全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 04-0273-04
Bar 基因转化草原 1号苜蓿的研究
刘艳芝,王玉民,刘　莉,隋松兵,李望丰,董英山*
(吉林省农业科学院生物技术研究中心, 吉林公主岭 136100)
摘要: 利用农杆菌介导法将抗草丁膦的 Bar 基因导入草原 1 号苜蓿, 经叶片筛选试验证实转基因植株对除草剂 Bast a具
有抗性, 通过多聚白酶连式反映检测,初步证实目的基因已转入到苜蓿基因组中。
关键词: 生物技术;苜蓿; 农杆菌介导;遗传转化
中图分类号: Q943. 2　　　文献标识码: A
Agrobacterium-Mediated Transformation of Alfalfa
Variety,Caoyuan No. 1, by Bar Gene
LIU Yan-zhi, WANG Yu-m in, LIU Li, SU I Song-bing , LI Wang-feng , DONG Ying-shan
*
( Biot echnolog y Research Cent er, Jilin Academy o f Ag r i cultur e Sciences, Gong zhuling, Jilin P ro vince, 136100, China)
Abstract: Bar gene coding Glufo sinate r esistance is tr ansf ormed int o t he alfalfa v ariety , Caoyuan No . 1, mediated by
Agrobacter ium tumefaciens. T he leaves of t ransgenic plant s after being scr eened and tested are pr oved t o be r esistant to
Glufosinate . Fur thermo re , PCR analysis shows that bar gene has been tr ansfo rmed into A lfalfa.
Key words: Biotechnolog y; Alfalfa; Ag robact erium t umefaciens; Genetic tr ansfo rmation
　　苜蓿是世界上最重要的豆科牧草, 种植面积约
3500万 hm 2。在我国种植面积约 130万 hm2。与其他
豆科牧草相比,苜蓿中蛋白质含量约占干物质总量的
17%～20%, 其营养价值丰富, 是一种极好的饲料作
物。草害是苜蓿生产中的主要问题之一,在苜蓿商品草
进入国际市场的检验标准中规定:杂草含量在 8%以
下。这项指标严格限定了苜蓿商品草生产田杂草生物
量的控制界限。目前,国内对所需求的苜蓿草产品质量
要求不严,产、供、销过程中没有对草产品的杂草含量
给予足够的重视。
随着苜蓿产业化的逐步推进以及国际市场的需
求,苜蓿田的杂草问题必将日渐突出。在实际生产中,
依靠传统的除草策略降低杂草的危害存在一定的困
难。目前在苜蓿生产中广泛使用除草剂,但一些化学除
草剂残留期长,对饲草、人畜均有一定危害。因此通过
基因工程手段将高效、低残留的除草剂抗性基因导入
到苜蓿中,是一个非常有意义的研究课题。
关于苜蓿转基因研究已有一些报道, 如抗除草
剂、抗虫、抗病毒和提高含硫氨基酸含量及遗传转化方
法方面的研究 [ 1～8] , 但大部分研究都是采用容易再生
的基因型进行的, 这些基因型在生产上意义不大。本研
究旨在建立具有重要推广价值的苜蓿品种转化体系,
为转基因苜蓿在生产上应用奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
草原 1 号苜蓿( Medicago varia Mart in. cv. Cao-
yuan No . 1) , 由吉林省农科院畜牧分院草地所提供。该
品种是以内蒙古锡林郭勒草原野生黄花苜蓿(Medicago
f alcata L. ) 为母本, 内蒙古准格尔苜蓿 ( Medicago
sativ a L. cv. Neimeng Zhungeer )为父本,采用人工授粉
进行种间杂交育成,生育期 110 d 左右, 抗寒性强、较抗
旱,适宜在内蒙古东部、东北和华北北部种植。
1. 2　外植体的获得
选取饱满种子, 用 75%乙醇浸泡 2 m in, 0. 1%升
汞浸泡 30 m in, 无菌水清洗 4次,用无菌水浸泡 24 h,
至种子膨胀后接种于MS0( M S 附加蔗糖 3%, pH 5. 8)
收稿日期: 2003-09-10;修回日期: 2004-03-09
基金项目:国家植物转基因中试基地资助课题
作者简介:刘艳芝( 1964-) ,女,副研究员,主要从事植物遗传转化工作, E-mail: ysdong @263. net ;通讯作者 Author for correspondence
第 12 卷　第 4 期
　Vol. 12　　No . 4
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SINICA
　2004 年　12月
　Dec. 　2004
图 1　转化用目的基因示意图
F ig . 1　Target g ene used in the tr ansfo rmat ion experiment
培养基。
1. 3　质粒
pCAMBIA3301由中国科学院上海植物生理研究
所卫志明先生惠赠。它含有 35 S 启动子调控的 Bar 基
因和Gus 基因(见图 1)。质粒在大肠杆菌中保存。
1. 4　菌株
根癌农杆菌菌株 LBA4404(郭三堆先生提供)带有
链霉素和利福平抗性标记。用碱裂解法从大肠杆菌提取
质粒 pCAMBIA3301, 用液氮处理的冻融直接转移法
将 pCAMBIA 3301转入 LBA4404, 微量提取质粒进行
酶切分析,以确定目的基因是否转入农杆菌质粒中。
1. 5　苜蓿的转化和再生植株移栽
1. 5. 1　菌液的制备　取100
l甘油冷冻保存的农杆菌
菌种, 加入 5 ml 不含抗生素的 YEB液体培养基, 26～
28℃下摇动( 100～150 rpm/ m in)培养 24 h, 待菌液混
浊,取1 ml活化菌液,加入15 ml YEB 培养基,连续扩增3
次,置于冰箱中备用, 不超过3 d, OD600约为0. 4～0. 6。
1. 5. 2　转化　在接种后 6～7 d 子叶完全展开时, 切
取子叶,浸入用 MSO 稀释 3倍的菌液中, 30 m in后取
出, 放在无菌滤纸上, 吸去子叶表面的菌液, 接种到
LM1 ( MS 附加 2, 4-D 2. 0 mg / L、KT 0. 25 mg / L、CH
2000 mg / L , 蔗糖 3% , pH 5. 8)半固体培养基上培养
3～4 d, 将子叶转入附加 2 mg/ L 除草剂( Basta) 和
300 mg / L 头孢霉素( Cef )的 LM1 选择培养基上筛选
转化的外植体, 诱导体细胞胚胎发生,然后在附加 2
mg / L 除草剂和 300 mg/ L 头孢霉素( Cef ) ( Basta )
LM2 ( M S 附加 NAA 0. 05 mg/ L、6-BA 0. 5 mg / L , 蔗
糖 3%, pH5. 8)选择培养基上筛选转化的胚状体,再转
到 MS0+ 2 mg / L 除草剂( Basta)培养基上再生, 获得
完整植株。
1. 5. 3　植株移栽　将根系发育良好的 5～8 cm 高抗
性植株和对照植株(非转化处理子叶外植体再生植株)
连同培养瓶在培养室内开瓶盖锻炼 1周左右, 洗净植
株根部琼脂, 移到装有营养土(市场销售的花卉营养
土,不用消毒)的花盆中, 1个月后移栽大田。
1. 6　转基因植株鉴定
1. 6. 1　植株 Basta 抗性检测　将再生小植株的叶片,
接种到 MS0+ 3 mg / L 除草剂( Basta)培养基和MS0+
5 mg / L 除草剂( Basta)培养基上。以组织培养获得的
再生植株叶片做抗性筛选对照。
1. 6. 2　抗性植株 PCR(多聚酶链式反应)分析　取抗
性植株幼嫩叶片 0. 2～1 g,按 CTA B法[ 11]提取基因组
DNA ,根据 Bar 基因序列设计了特异扩增引物, 上游
引物 B1 为 5-GCAGGAACCGCAGGAGT GGA, 下游
引物B2 为5′-ATCT CGGTGACGGGCAG-GAC。在每
一 25
l PCR 反应体系中含 50ng 基因组 DNA, 10
mmol/ L T ris-HCl pH 9. 0, 50 mmol/ L KCl , 1. 8
mmol/ L MgCl 2, 0. 1% Tr iton X-100, 200 mol
dNT Ps, 每一引物 50 ng, 1 U Taq DN A 聚合酶.
PCR 反应在 Biometra 热循环仪上按下列程序进行:
预变性 94℃ 4 min; 然后 94℃ 45 sec, 55℃ 45 sec,
72℃ 1 min, 35个循环; 最后 72℃ 10 min。PCR产物
通过 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
2　结果与分析
2. 1　苜蓿子叶体细胞胚胎发生
LM1 培养基诱导无菌苗子叶形成愈伤, 约 20 d 出
现胚状体(图 2) , 30 d 时用 LM 1继代,继代时挑取绿
色类胚性愈伤,再过 10 d即有大量的胚状体出现。挑
取适当的胚状体置于 MS0 或 LM 2 培养基上再生, 剩
下的类胚性愈伤重新用 LM 1和 LM 2 继代, 诱导胚状
体。LM 1上的培养物 10 d左右已有新的单个胚状体再
生,且再生能力很强; LM2 上的培养物胚状体诱导效
果好于 LM 1。诱导产生的胚状体转入MS0培养基中再
生,获得再生植株。
2. 2　苜蓿转化及抗性筛选
利用农杆菌介导将 Bar 基因转入草原 1号苜蓿,
有创伤的子叶直接浸染 , LM 1诱导培养基加除草剂
274 草　地　学　报 第 12卷
图 2　无菌苗子叶体细胞胚胎发生
Fig . 2　Soma tic embryogenesis fr om a lfalfa coty ledon
( 2 mg / L )筛选 16 d, 取筛选存活的胚性愈伤组织(图
3)在原培养基(去掉除草剂)中继代 30 d后恢复培养,
此时胚状体又进一步增殖, 再继代时回到加除草剂的
原培养基中筛选 20 d, 去掉除草剂转入分化培养基
( LM 2或 MS0 )中恢复培养 30 d 左右,再转入加除草剂
的分化培养基中, 取筛选存活的胚状体干燥处理7 d,
目的是提高再生能力, 最后获得抗性再生植株。
图 3　子叶农杆菌侵染后 Basta 筛选
Fig. 3　Screening with Basta a fter alfalfa coty ledon
infect ed by Ag robact erium t umefa ciens
　　获得抗性植株( MS0+ Basta 2 mg/ L ) 96 株, 取抗
性植株及非转化植株试管苗叶片, 置于两种浓度
Basta 的筛选培养基上(图 4)。结果对照均于 6 d 死
亡,在 MS0+ Basta 3 mg/ L 上叶片抗性筛选, 60 d 后
存活 18株;在 MS0+ Basta 5 mg / L 叶片抗性筛选, 60
d后存活 13株。两次筛选存活的植株并没有表现出完
全一致的结果,是由于抗性植株中存在一定数量的嵌
合体所致。另外选取 43 株抗性植株的全部叶片, 用
MS0+ Basta 5 mg / L 筛选,筛选 30 d结果: 叶片全活 2
株;叶片全死为0株;叶片半死为41株。此结果证明苜
蓿子叶农杆菌介导转化的嵌合体比率非常高。
图 4　抗性植株叶片 Basta 筛选
F ig . 4　Scr eening the leaves o f transgenic plants in
MS0 medium added with 5 mg / L Basta
2. 3　抗性植株的 PCR 检测
以 MS0+ Basta 5 mg / L 叶片抗性筛选, 60 d后存
活 13株材料的叶片提取 DNA 进行 PCR 分析, 结果
全部为阳性(图 5) , 叶片筛选和 PCR 结果完全一致,
叶片筛选结合PCR检测方法尚未有其他文献报道。这
也为转基因植株的检测提供了一个比较便捷的方法,
其缺点是无法判断嵌合体的比例。
图 5　转基因植株 PCR检测结果
Fig. 5　PCR analy sis of tr ansgenic plants
M: M ark er; 1:阳性对照; 2～4:阴性对照(组培苗) ;
5～17: MS0+ Basta 5 mg/ L 叶片抗性筛选 60 d后存活的材料
M: Marker ; 1: Pos it ive cont rol; 2～4: Negative cont rol;
5～17: Ex ist ing materials, 60 d ays after b eing screened f rom leaves
of t ransgenic plants and soak ed in MS0+ Basta 5 mg/ L
3　结　论
本项研究利用农杆菌介导法将 Bar 基因转入草
原 1号苜蓿, 抗性植株叶片抗性筛选结合分子生物学
检测,初步证实目的基因已转入苜蓿基因组中。整个转
化程序具有稳定性和可重复性,为利用其它目的基因
进行苜蓿遗传转化奠定了基础。以往的苜蓿转化研究
主要采用容易再生的基因型进行,本研究采用的材料
是生产上推广面积较大的品种草原 1 号, 为转基因苜
蓿的生产提供了保证。 (下转 280页)
275第 4期 刘艳芝等: Bar 基因转化草原 1号苜蓿的研究
3　结论与讨论
3. 1　国际上对豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多
年的历史。几乎在全世界范围内对苜蓿进行根瘤菌接
种都已没有争议, 认为绝大多数农业土壤,特别是新
区,种植苜蓿都需要接种相适宜的根瘤菌。接种根瘤菌
可提高苜蓿的成苗率、幼苗结瘤率,增加苜蓿产草量和
蛋白质含量, 同时还可以增加土壤肥力,使苜蓿的后茬
作物获得增产。所以世界各国都很重视苜蓿根瘤菌的
研究及应用。但苜蓿根瘤菌的不同菌株与不同品种相
互间有很强的选择性, 只有共生性很强的“菌株——品
种”组合才能形成共生固氮最佳体系。因此,苜蓿根瘤
菌优良菌种的筛选、与植物的最优匹配及根瘤菌剂生
产工艺的研究应用已势在必行。
3. 2　本试验通过对 22个不同品种紫花苜蓿根瘤菌表
型多样性分析,得到 3株对抗生素、化学药剂和盐碱耐
受性较强的菌株, 它们是 NWMSH022、NWMSH023
和 NWMSH028, 其寄主分别为塞特、苜蓿王、关中。塞
特引进于荷兰,根系发达, 适宜在干旱地区生长; 苜蓿
王从美国引进,苗期生活力强,产量较高, 刈割再生能
力极强,适于东北、内蒙古东部和西北地区种植; 关中
是陕西关中及渭北旱塬古老的苜蓿地方品种,返青早,
生长速度快, 属早熟品种,抗旱和抗寒性中等。这 3株
菌与其寄主是否为最优匹配还有待回接结果证实。同
时从数值分析得出:
3. 2. 1　在 89%的相似水平上, 除 NWMSH009 和
NWMSH023 外, 所有的未知菌株聚为一个不含已知
参比菌株的新表观群,说明它们可能是一类新的根瘤
菌种群;
3. 2. 2　来自同一试验田不同品种紫花苜蓿的根瘤菌能
很好地聚在一个新表观群中,说明生态环境是影响根瘤
菌生理生化表型特征的重要因素,即环境影响表型[ 7] ;
3. 2. 3　从亚群的划分又说明根瘤菌的表型特征也会
受到寄主的影响[ 3] ,那么根瘤菌的系统发育进化究竟
与哪些外部因素有关, 还有待进一步研究。
参考文献
[ 1]　王宗礼. 优质牧草新品种及栽培技术[ M ] .北京:中国劳动保障出
版社, 2002, 1
[ 2]　高振生,马其东,牛志强. 沿海滩涂地区苜蓿根瘤菌接种方法和效
果的研究[ J] . 草地学报, 1996, 4( 4) : 288～293
[ 3]　韦革宏,陈文新,朱铭莪. 陕甘宁地区根瘤菌数值分类与 DNA 同
源性分析[ J] . 应用与环境生物学报, 1999, 5( 1) : 73～78
[ 4]　韦革宏,陈文新,朱铭莪. 分离自鸡眼草和木兰的根瘤菌分类研究
[ J] . 微生物学报, 1999, 39( 5) : 387～395
[ 5]　阚凤玲,陈文新. 西部某些根瘤菌的数值分类和 16srDNA PCR-
RFLP 分析[ J] . 微生物学通报, 2002, 29( 3) : 1～8
[ 6]　王素英,许晓东,蔡雪梅,邓必清,杨晓丽. 西藏根瘤菌的数值初步
分类研究[ J] . 微生物学通报, 2002, 29( 6) : 5～9
[ 7]　阎爱民,陈文新. 苜蓿、草木樨、锦鸡儿根瘤菌的表型多样性分析
[ J] . 生物多样性, 1999, 7( 2) : 112～119
(上接 275页)
参考文献
[ 1]　DHalluin K, Boteerman J , d e Greef W . Engineer ing of herbicide-
res istant al falfa and evaluat ion under f ield condit ions [ J ] . Crop
Sci, 1990, 30: 866～871
[ 2 ]　T homas J C, Wasmann C C, Echt C, et al . Int roduct ion and
exp res sion of an ins ect proteinase inh ibitor in alfal fa ( Medicago
sat iv a L. ) [ J ] . Plant Cel l Rep, 1994, 14: 31～36
[ 3 ] 　Hil l K K, et al . T he development of vi rus-resis tant alfal fa,
Med icag o sat iv a L[ J] . Bio/T echnolog y, 1991, 9: 373～377
[ 4]　Wandelt C, et al. Vicilin w ith carboxy-termin al KDEL is retained
in th e endoplasmic ret iculum and accumulates to high levels in the
leaves of t rans genic plants [ J ] . T he Plant Journ al , 1992, ( 2) :
181～192
[ 5]　S chroeder H E, et al. Expr ess ion of chicken ovalbumin gene in
three Lu cer ne cul t ivars [ J ] . Aust ralian Journal of Plant
Physiology , 1991, 18: 495～505
[ 6]　吕德扬,曹学远, 唐顺学,等. 紫花苜蓿外源基因共转化植株的再
生[ J] .中国科学( C辑) , 2000, 30( 4) : 342～348
[ 7]　吕德扬,等. 苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生[ J] . 遗传学
报, 2000, 27( 4) : 331～337
[ 8 ] 　 Shahin E A, et al . Transformat ion of cu lt ivated alfalfa us ing
disarmed A g robacter ium tumef aciens [ J ] . C rop S ci. , 1986, 26:
1235～1239.
280 草　地　学　报 第 12卷