全 文 ：第 16 卷 第 5 期
Vol. 16 No . 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 9 月
Sep. 2008
中苜 1号紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选
康俊梅1 , 张丽娟1 , 郭文山1 , 杨青川1* , 魏窦兴2
( 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 2.青海省海西州草原站 , 青海海西州 817000)
摘要 : 研究 8 株根瘤菌对/ 中苜 1 号0紫花苜蓿( Med icago sativ a L . cv. Zhongmu No . 1)的接种效果。结果表明: 8
株根瘤菌接种效果差异明显;接种后干草重、根瘤数、干根重、粗蛋白质含量比对照分别增加了 3. 8% ~ 26. 12%、
2. 9% ~ 41. 43%、5. 8% ~ 41. 38%和 2. 39% ~ 8. 5% ; 筛选出与中苜 1 号最佳共生匹配的根瘤菌 ACCC17544,该菌
株能增强其共生固氮效果,既提高干草产量, 又增加粗蛋白质含量, 具有一定的生产应用价值。
关键词: 根瘤菌; 紫花苜蓿;固氮
中图分类号: S541 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 05-0497-04
Screening of High Efficient Symbiotic Rhizobium for Zhongmu No. 1 Alfalfa
KANG Jun-mei1 , ZHANG L-i juan1 , GU O Wen-shan1 , YAN G Qing-chuan1* , WEI Dou-x ing2
( 1. Inst itute of Animal S cien ces , CAAS, Beijing 100193, Ch ina; 2. Grassland Station of H aixi, Qin ghai Province 817000, China)
Abstract: T he effects of inoculat ion w ith 8 rhizobial st rains on Med icago sativa L. cv. Zhongmu N o. 1 w ere
studied. T he results show that ther e w as signif icant difference in differ ent str ains for alfalfa gr ow th im-
provement . T he shoot dry w eight of Zhongmu N o. 1 inoculated with rhizobia increased 3. 8%~ 26. 12%, the
number of nodules increased 2. 9% ~ 41. 43% , the roo t dry w eight increased 5. 8% ~ 41. 38% , and the con-
tent of crude pr otein increase 2. 39%~ 8. 5% in comparison w ith the control. Zhongmu No. 1 g rew w ell by
inoculat ion w ith the st rain ACCC17544 which enhanced the symbiot ic nit rog en f ixat ion, forag e yield, and
pro tein content in alfalfa.
Key words: Rhiz obium; Alfalfa (M edicago sativa L. ) ; Nit rog en fix at ion
根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性
细菌,它能侵染豆科植物根部形成根瘤,固定空气中
的分子态氮形成氨, 为植物提供氮素营养。据统计,
全球每年生物固氮量达 1. 75 @ 108 t[ 1] ,为世界工业
氮肥产量的 4. 37倍 [ 2]。根瘤菌与豆科植物共生是
生物固氮作用最强的体系, 所固定的氮约占生物固
氮总量的 65% [ 3] ,而全世界大约有 20%的蛋白食品
来自豆科植物 [ 4]。我国豆科植物约有1400多种, 从
草本到乔木,其生态、形态、生活习性多样,大部分都
可以被根瘤菌感染而结瘤。根瘤菌固氮不仅能提高
豆科植物产量, 改善品质,节约氮肥,降低生产成本,
而且可以提高土壤肥力, 改善土壤结构,并为后茬作
物提供部分氮素营养 [ 5, 6]。然而, 根瘤菌并不意味着
对任何豆科寄主植物都会提高其产量或品质。因为
根瘤菌结瘤是一个竞争结瘤的过程,众多因素影响着
其结瘤和共生固氮效率,如土壤条件、土著根瘤菌、植
物品种、根瘤菌以及植物与根瘤菌的相互作用等。因
此豆科植物与根瘤菌共生固氮优良组合筛选一直是
生物固氮研究领域中的热点[ 5]。
紫花苜蓿(下称苜蓿)作为重要的豆科牧草, 随
着我国农业结构调整和西部大开发战略的实施, 其
种植面积不断增加,目前已达 300多万公顷,不仅为
我国草地畜牧业的发展提供重要的优质蛋白饲料,
并由于固氮作用培肥土壤, 改善生态环境,对提高中
低产田的利用率, 增进其生态治理及促进草地畜牧
业的发展具有重要作用。本文研究/中苜 1号0苜蓿
接种 8株根瘤菌在温室条件下的生长情况及结瘤状
况,旨在筛选出与之具有最佳共生匹配的根瘤菌菌
株,以期通过接种达到增产效果,并为苜蓿高效固氮
根瘤菌的筛选提供理论依据。
收稿日期: 2007-09-04; 修回日期: 2008-06-05
基金项目: 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基本科研业务费专项基金创新团队( yw f- td-3)
作者简介: 康俊梅( 1972-) ,女,内蒙古集宁人,助研,在读博士,主要从事牧草与草坪草遗传育种工作, E-mail: kangjm ei@ yah oo. com. cn ;
* 通讯作者 Author for corresponden ce, E-mail: qch yang66@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 16卷
1 材料和方法
1. 1材料
1. 1. 1 供试植物 耐盐苜蓿/中苜 1号0,由中国农
业科学院北京畜牧兽医研究所牧草研究室供种。
1. 1. 2 供试菌株 由中国农业微生物菌种保藏管
理中心(简称 A CCC)提供(表 1)。
表 1 供试菌株及其来源
Table 1 The source of different stra ins
菌株编号
St rain nam e
原编号
No.
寄主植物
H ost plant
来源地区
Source
ACCC17513 9 苜蓿 Alfalfa 山东 Shandong province
ACCC17531 129 苜蓿 Alfalfa 黑龙江 H eilongjiang province
ACCC17535 143 苜蓿 Alfalfa 黑龙江 H eilongjiang province
ACCC17540 174 苜蓿 Alfalfa 黑龙江 H eilongjiang province
ACCC17544 6-3 苜蓿 Alfalfa 新疆 Xin jian g Uigur Au ton om ou s Region
ACCC17558 50 苜蓿 Alfalfa 甘肃 Gansu provin ce
ACCC17568 A8 苜蓿 Alfalfa 甘肃 Gansu provin ce
ACCC17584 B2 苜蓿 Alfalfa 甘肃 Gansu provin ce
1. 1. 3 供试土壤 为中国农业科学院北京畜牧兽
医研究所试验地表土(种过豆科牧草,前茬为禾本科
牧草) ,土壤为壤土, 土质均匀一致, pH 8. 3, 全氮 0.
064% ,全磷 0. 042%, 0全钾 1. 64%。
1. 1. 4 培养基 YMA 固体培养基(配方: 10 g 甘
露醇、0. 25 g K 2HPO4、0. 25 g KH 2 PO 4、0. 2 g M g-
SO 4、0. 1 g NaC1、3 g CaCO3、15 g 琼脂粉、1 L 蒸馏
水) , pH 6. 8-7. 2。
1. 2 方法
1. 2. 1 根瘤菌活化 将供试菌株分别接种到克氏
瓶中 YMA培养基平面上, 28 e 培养至对数生长期
( 2 d) ,用 100 mL 无菌水洗下菌体, 装入无菌三角
瓶,旋涡振荡打散菌体后取一部分测其 OD 值(K=
600 nm) ,使每毫升菌悬液根瘤菌达 20亿个。
计算公式如下:
根瘤菌数= 各方格中根瘤菌数平均值
16
@ 稀释倍数@ 4000 @ 1000
1. 2. 2 种子处理和根瘤菌接种
苜蓿种子经 95%乙醇处理 15 min,用无菌水冲
洗 5-6次,再用 0. 1%的 HgC12 进行表面消毒 4 m in
之后用无菌水冲洗 7-8次,放入培养皿中,置于28 e
培养箱催芽 2 d。先在培养皿加入备用的菌悬液适
量(以淹没种子为宜) , 再加入发芽一致, 根长约
1 cm的苜蓿种子, 浸泡 15 min, 用镊子夹取植入装
有土壤的塑料花盆(宽 @ 高为 13 cm @ 15 cm, 内装
1 kg土壤) ,每盆种植 10粒,再沿各株根部加入该菌
液 2 ml,保证每株接菌量达到 1. 0 @ 109 个以上, 分
别用 8种不同根瘤菌进行接种处理,各 3个重复, 以
不接种者作对照, 重复 3次。最后转入光照强度为
7000-8000 Lx ,白天 23 e ? 5 e ,晚上 18 e ? 2 e , 日
照 16 h 的温室中培养[ 5] 。
1. 2. 3 接种效果测定
接种 45 d 后收获。将地上部(以第一片子叶叶
痕处作为划分标准)剪下后分别装袋,在105 e 烘箱中
烘 1 h,经80 e 烘干到恒重,称干重; 收获时把根系用
水洗净,测定每盆总根瘤数; 采集新鲜根瘤, 洗净吸
干,采用乙炔还原法,测定固氮酶活力;之后经80 e 烘
干,称干根重;粗蛋白质含量用凯氏定氮法测定[ 7]。
1. 3 数据处理 用 SAS 统计软件和 EXCEL 软件
进行分析和处理。
2 结果与分析
2. 1 接种后中苜 1号生长效应
中苜1号接种 8株不同根瘤菌后,其干草重与对
照间差异显著 ( P< 0. 05) , 其中 ACCC17540、AC-
CC17535和ACCC17544菌株的干草重高于其他处理,
其中增幅最大的是 ACCC17540,干草重达3. 67 g,高出
对照26. 12%, 增幅最小的是 ACCC17584, 比对照高
3. 8%(图1)。接种根瘤菌后对苜蓿根的生长影响不明
显,除ACCC17544差异显著外,其他菌株间差异不显
著,但各处理干根重均大于对照,说明根瘤菌接种对苜
蓿根的生长有一定促进作用(图2)。
2. 2 接种后中苜 1号固氮效应
接种根瘤菌能显著提高苜蓿的结瘤能力,而根
瘤数反应其与菌种相互作用时结瘤的能力。接种根
瘤菌后中苜 1 号结瘤能力存在差异, 其中 AC-
CC17531菌株根瘤数最多,比对照增加 41. 42% ,其
次是 ACCC17584和 ACCC17544根瘤数明显高于
对照,分别增加 29. 43%、25. 43%。根瘤数增加最
少的菌株是 ACCC17540,仅 3% (图 3)。
498
第 5期 康俊梅等:中苜 1号紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选
2. 3 接种根瘤菌后, 苜蓿粗蛋白质含量差异较大,
以 ACCC17568含量最高,达 23. 13%, 显著高于对
照和其他菌株( P< 0. 05) , 其次是 ACCC17544、AC-
CC17513和 ACCC17535明显高于对照。虽然其他
4种菌株对苜蓿粗蛋白质含量有所增加,但效果不
大(图 4)。说明供试根瘤菌菌株固氮效率间差异显
著( P< 0. 05)。
图 4 接种后中苜 1 号粗蛋白质含量
F ig . 4 Crude pro tein content of Zhongmu No .
1 after ino culation of differ ent str ains
2. 4 根瘤菌固氮酶活力测定结果表明, 以土著根瘤
菌固氮酶活力最高,菌株 ACCC17544和 ACCC17535
的固氮酶活力与对照间差异不显著,而 ACCC17513、
ACCC17531、ACCC17540、ACCC17558和 ACCC17584
固氮酶活力则明显低于对照。由此可见,固氮酶活性
与干草重、粗蛋白质含量等生长效应指标的相关性不
显著。因此,在进行高效根瘤菌筛选时固氮酶活力只
可作参考指标。因为固氮酶活性是固氮微生物进行
固氮作用的瞬间值, 只代表取样瞬间的活性强度,具
有明显的时空变化,并与根瘤菌的不同发育阶段有
关。因此,不能单纯的依据固氮酶活性的高低确定不
同菌种的固氮能力,必须综合其他指标,如接瘤效率、
有效根瘤数以及环境因素等(图 5)。
图 5 供试根瘤菌固氮酶活力比较
Fig. 5 Comparison of nitrogenase activities of different nodule
499
草 地 学 报 第 16卷
综合上述各项测定指标: ACCC17544对中苜 1
号接种效果最佳,各项指标都明显高于其它处理, 可
有效增加其产草量和粗蛋白质含量。初步证明是中
苜 1号的最佳匹配菌株。
3 讨论与结论
3. 1 一种根瘤菌只能侵染一定范围的豆科植物, 产
生有效根瘤, 这是根瘤菌本身所特有的专一性。
Gibson等研究表明, 在土壤氮素相同的条件下, 所
有根瘤菌并不能使不同苜蓿品种获得同样的接种效
果,对某个品种产生优异表现的菌株,对另一品种也
许只能起诱导次级反应作用。这两种生物之间的交
互作用说明根瘤菌与寄主之间需要很好的搭配, 才
能使苜蓿获得最佳固氮效果。这涉及到寄主植物与
菌株的基因型[ 8] 。本研究选用 8株根瘤菌对中苜 1
号苜蓿接种,结果表明不同菌株的接种效果均有差
异,其中 ACCC17544 接种后干草重、干根重、粗蛋
白质含量等各项指标都明显高于对照, 表现出良好
的接种效果, 而另一些菌株,如 ACCC17531根瘤数
虽多,但对中苜 1号的生长效应没有明显变化。与
Gibson的研究结果相一致。陈丹明等[ 9] 进行苜蓿
高效根瘤菌筛选实验, 证明不同苜蓿品种接种不同
菌系时,品种与菌系间差异较大。同一品种接种寄
主来源不同的根瘤菌, 有时比接种相同寄主来源根
瘤菌的效果好, 如来自天蓝苜蓿(M edicago lupul i-
na L. )的 30085菌株对中苜 1 号, 以及来源于草木
樨(M elilotus suav eolens Ledeb. )的 30096 菌株对
WL323的接种效果均显著高于某些来自苜蓿的根
瘤菌。因此根瘤菌应扩大选种范围,不能只局限于
同种寄主的根瘤菌。
3. 2 根瘤菌的固氮效果与土壤环境密不可分。研
究表明,某些根瘤菌接种效果差,是由于菌种的生理
特性很大程度上决定其在土壤中的生命力和存活能
力。不同种属具有不同的反应能力。此外, 土壤中
生物与非生物因素也起着重要作用。土壤结构、pH
值、温度、湿度等非生物因素对接种物的动态变化产
生直接的影响, 并可通过微生物区系土著菌的活性
间接影响着接种物。另外还有生物因素的影响, 土
壤中存在一定数量的原生动物和微生物, 它们对外
来的微生物具有一定的敏感性, 并能捕食外来微生
物,此外, 接种菌与土著菌之间存在争夺营养基质和
生存空间的竞争 [ 10-12]。本研究所用试验土为大田表
土,土壤环境较为复杂, 既有土著根瘤菌、接种菌以
及其他微生物之间的相互作用, 又有土壤条件对植
物、接种根瘤菌的影响,固氮效果受到多层次多方面
因素的相互制约。这些都是造成某些菌种固氮效果
不好的原因。筛选与苜蓿品种匹配的根瘤菌研究表
明:通过蛭石栽培筛选出来的高效根瘤菌,与田间栽
培筛选出来的截然不同。因为蛭石对植物只起到一
种支持物的作用, 用蛭石只能筛选出与品种匹配的
根瘤菌;而从土壤筛选的才是适合当地条件的高效
根瘤菌,两者差异很大,显示环境因素起着至关重要
的作用[ 9] 。陈文新院士对有关根瘤菌与豆科植物共
生关系提出新见解: 同一植物在不同地理环境中可
与不同根瘤菌结瘤固氮; 同一地理环境条件下不同
种植物可与同一种根瘤菌结瘤固氮。这一见解又给
根瘤菌与品种的匹配提供了新的思路, 接种时不仅
要考虑根瘤菌与寄主之间的匹配关系, 还应考虑当
地的土壤环境条件 [ 13]。
3. 3 筛选高效固氮根瘤菌时,首先应考虑苜蓿品种
及种植环境的关系, 其次是与苜蓿及其生长环境相
适应的根瘤菌,针对不同苜蓿品种、不同土壤类型,
选用大量来源不同的根瘤菌进行盆栽试验,以期筛
选出与之共生匹配最佳的根瘤菌, 而该有效菌株才
更切合生产实际。
参考文献
[ 1] 沈世华,荆玉祥.中国生物固氮研究现状和展望[ J] .科学通报,
2003, 48( 6) : 532-540
[ 2] 林稚兰,黄秀梨.现代微生物学与实验技术[ M ] . 北京:科学出
版社, 2000. 9-13
[ 3] Zab ran H H. Rh iz obium- legume symbiosi s and nit rogen f ixa-
tion under s evere condit ion an d in arid cl imate [ J] . M icrobiol
Mol. Biol. Rev. , 1999, 63: 968-989
[ 4] Denarie J , Roch e P. Rh iz obium nodulat ion signals [ A] . In: Ver-
ma D P S, ed. Molecular signals in plant-microbe commun ica-
tion s [ C] . L on don : CRC Pres s, 1991. 296-324
[ 5] 曾昭海.紫花苜蓿高效根瘤菌筛选及田间鉴定方法研究 [ D] .
中国农业大学博士学位论文, 2003
[ 6] 宁国赞,刘慧琴,马晓彤.中国豆科牧草根瘤菌资源的采集宝藏
及利用[ J] .草地学报, 1999, 7( 2) : 165-172
[ 7] 戴小密, 刘彦杰, 叶小梅, 等.接种大豆根瘤菌( Sinorhi z obium
f red i i )遗传工程菌株 LMG101对大豆的增产效应[ J] .中国农
业科学, 2003, 36(1) : 66-70
[ 8] Gibson A H, Cu rnow B C , Bergersen F J, et a l . S tu dies of
st rains of Rhiz obium tri f ol ii associated w ith T ri f ol ium sub-
terr aneum L. pastures in south- easatern Aus tralia [ J] . S oi l B-i
ology and Biochem ist ry, 1975, 7: 95-102
[ 9] 陈丹明,曾昭海,隋新华,等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选
[ J] .草业科学, 2002, 19( 6) 27-31
[ 10] H ardarson G, Heichel G H , Barn es D K. Rhiz ob ial s t rain pref-
erence of alfal fa population s selected for characteris t ics assoc-i
ated w ith N2 f ixat ion [ J ] . C rop. Sci. , 1982, 22: 55- 58
[ 11] Brockw ell J, Bot tomley P J. Recent ad vances in inoculant tech-
nology and prosp ects for the fu tu re [ J] . Soil. Biol. Biochem . ,
1995, 27: 683-697
[ 12] Kosslak R M, Bohlool B B. Inf lu ence of environm ental factors
on interst rain compet iti on in R hiz obium j ap onicm [ J ] . Appl .
Environ. M icrobiol. , 1985, 49: 1128-1133
[ 13] 陈文新,李阜棣,阎章才.我国土壤微生物学和生物固氮研究的
回顾与展望[ J] .院士论坛.世界科技研究与发展. 2002, 4: 6- 12
(责任编辑 孟昭仪)
500