全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(1)：89-92
JourmN D，Wuhan Botanical Sese~ h
开口箭甾体皂甙元的分离鉴定及其抗荔枝霜疫霉菌活性
吴光旭 ，刘爱媛 ，魏孝义 ，陈维信h
(1．广东省果蔬保鲜重点实验室，华南农业大学，广州 510642；2．长江大学生命
科学学院。荆州 434025；3．中国科学院华南植物园，广州 510650)
摘 要：在以荔枝霜疫霉菌为指示菌的生物活性测定导向跟踪下 ，运用 I1￡、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和凝胶
柱层析等分离纯化方法，从开口箭(Tupistra chinensis)甲醇提取物的乙酸乙酯分部萃取物中分离纯化得到2个抗菌
化合物。经现代光谱(MS、IR、1D NMR和 2D NMR)分析，确定化合物 1为 113，2B，3B，4B，5B，7 -六羟基螺甾-25
(27)-烯_6-酮，化合物2为螺甾-25(27)·烯-1B，2B，3B，4B，5B，6B，7 -七醇。离体抗菌活性测定化合物 1和化合物2
抑制荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)孢子囊萌发的Ec5o分别为 100．28 mg·mL 和124．37 mg·mL～。用质量
浓度为500 rag·mL 的两个化合物分别处理后接种霜疫霉菌，供试荔枝果实的发病率分别为 16．7％和18．9％。
关键词：开口箭(Tupistra chinensis Bak．)；甾体皂甙元；荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)；抗菌活性
中图分类号 ：Q946．887；$436．67 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2007)01．0089．04
Isolation and Structural Elucidation of Sapogenins from Tupistra chinensis
and Their Antifungal Acitivity Against Peronophythora litchii
WU Guang—Xu ，LIU Ai—Yuan ，WEI Xiao．Yi。
， CHEN Wei—Xin ‘
(1·Guangdong研 Laboratoryfor Postharvest Science and Technology o，Fruit and VegetaMes，South China Agricultural
University，GuangzhOU 510642，China；2．Colege Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025。China；
3．South China Botanical C．ardmt，The Chinese Academy Sc／etwes，Guangzhon 510650，China)
Abstract： I11e methanol ex~act of Tupistra chinens~ showed anfifungal acitivity against the sporangium
germination of Peronophythora litchii．Bioassay—guided fractionation together with various chromatographic
procedures(，ILC，silica column chromatography。RP一1 8 reverse phase chromatography and Sephadex
LH_20 gel chromatography)led to the isolation of two bioactive sapegenins from ethyl acetate phases of the
methanol extract of chinensis．By means of spectroscopic analysis(MS，IR，1D NMR and 2D NMR)，
their structures were identifed as 1p，2p，3p，413，5p，7 0【一hexahydroxyspirost-25(27)一en-l5一one(1)and
spirost-25(27)一ene一1p，213，3p，413，5p，6p，7 0【一heptol(2)．Bioassay in vitro revealed that the EC5o
values of compounds 1 and 2 against sporan gium germination of litchii were 100．28 mg·mLI1 an d
124．37 mg·mL～，respectively． Ireatment with 500 mg·mL I1 of compounds 1 an d 2 before inoculated
with P．1itchi，the incidences of downy blight disease of the tested litehi fruits were just 16．7％ and
18．9％ 。
Key words：Tupistra chinensis Bak．；Sape genins；Peronophythora litchi；Antifungal activity
开口箭(Tupistra chinensis Bak．)为百合科(Lili—
aceae)铃兰族(Convalarieae)开口箭属多年生草本
植物 J¨。主要分布在我国四川、湖北、云南和广西
等地。开口箭多以根状茎人药，民间常用于治疗头
痛、咽喉痛、腰背疼痛、关节肿痛、跌打损伤、烧伤和
烫伤等症。植物化学研究发现，开口箭属植物中主
要含有甾体皂甙、甾体皂甙元和强心甙类等成
分 。笔者在筛选植物源抗菌物质对果蔬采后病
害防治的研究中，发现开口箭提取物对荔枝霜疫霉菌
(Peronophythora litchi)具有较强的抗菌活性【6】，并以
荔枝霜疫霉菌为指示菌进行活性跟踪，运用TLC、硅
胶柱层析、反相硅胶柱层析和凝胶柱层析等分离纯化
方法，从开口箭甲醇提取物的乙酸乙酯分部萃取物中
分离纯化得到2个甾体皂甙元抗菌化合物。目前，有
关其抗荔枝霜疫霉菌活性的相关研究尚未见报道。
本研究对植物源抗菌活性物质用于荔枝采后病害防
治、降低腐损率、控制农残量、保证食用安全性，以及
提高我国果蔬产品国际竞争力具一定的意义。
收稿 日期：2006．07-27，修回日期：2OO6．1 1．24。
基金项 目：农业部科技项目(2OO6-G31)；湖北省科技攻关计划资助项目(2004AA201C35)；广东省科技攻关项目(2004A20301002)。
作者简介：吴光旭(1961一)，男，副教授，博士，主要从事天然产物及果蔬采后病理研究(E．mail：wuguxu@sohu．CO1)。
+ 通讯作者(AutlI∞for corespondence．E-mail：chenweix@sti．gd．en)
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
1 材料与方法
1．1 供试植物材料的采集、鉴定、处理与保存
开口箭(Tupistra chinensis Bak．)样品于2002年
6月采自神农架国家级自然保护区，采集号为2958
和2959．植物由华南农业大学林学院李秉滔教授鉴
定，植物标本藏于华南农 业大学林学 院标本馆
(CAN)。
将开口箭截取根茎 ，去除泥土、残渣、黏附物和
其它异物，置于65℃的干燥箱中烘干、粉碎、过 100
目筛(孔径0．15 mm)制成千粉，于0℃低温下密封
保存 ，备用。
1．2 供试病原菌的分离、纯化与鉴定
参照方中达的方法【7 进行荔枝霜疫霉菌(Pero—
nophythora litchi Chen ex Ko et a1．)的分离与纯化。
病原菌由作者鉴定。
1．3 仪器设备与试剂
Eyela N一1旋转蒸发仪 (Tokyo Rikakikai Co．，
Ltd)、BS2000S型电子天平 (SARTORIUS)、SM 2．1
型显微镜(Nikon)、层析柱(各种规格)、API 2000型
质谱仪、BRUKER EQUINOX-55傅立叶变换红外光
谱仪、Bruker DRX-400型超导核磁共振仪。
硅胶(100—300目，青岛海洋化工厂)、ODS反
相硅胶(日本)、Sephdex凝胶(日本)、氯仿、甲醇、四
氢呋喃、丙酮、二甲亚砜、显色剂。
1．4 开口箭甲醇提取物及其分部萃取物的制备
采用冷浸法提取。将开口箭根茎干粉用体积分
数为 95％的甲醇反复浸泡直至浸出液无色为止，将
甲醇浸出液过滤，用旋转蒸发仪减压(11 kpa，50—
60℃)浓缩得到浅褐色膏状甲醇提取物，将 甲醇提
取物用少许稀酒精溶液溶解，然后分别用石油醚、乙
酸乙酯、正丁醇进行液一液分部萃取，减压浓缩得其
石油醚分部萃取物、乙酸乙酯分部萃取物、正丁醇分
部萃取物和水溶性剩余物。
1．5 化合物的分离纯化与光谱分析
以荔枝霜疫霉菌活性生测和TLC检测为导向。
对开口箭提取物进行分离纯化。将乙酸乙酯分部萃
取物用硅胶柱层析(100—200目，200—300目，氯仿
和甲醇混和液洗脱)、反相硅胶柱层析(RP一18，甲醇
和水混合液洗脱)和凝胶柱层析(Sephadex LH-20。
四氢呋喃洗脱)分离得到化合物 1。将乙酸乙酯分
部萃取物进行硅胶柱层析(100—200目，甲醇和水
混合液洗脱)和反相硅胶柱层析(RP一18，甲醇和水
混合液洗脱)得到化合物 2。
质谱(MS)用 Applied Biosystems API 2000型质
谱仪、采用大气压化学电离源(APCI)、正负两种离
子模式、以二氯甲烷为溶剂直接进样测定。红外光
谱(IR)用 BRUKER EQUINOX-55傅立叶变换红外
光谱仪，KBr压片测定，扫描范围400—4000 cm一。
核磁共振(NMR)用 Bruker DRX-400型超导核磁共
振仪测定，以TMS为内标，氘代吡啶为溶剂。
1．6 开口箭提(萃)取物的抗菌活性测定
1．6．1 开口箭提(萃)取物的离体 (in vitro)抗菌活
性测定
取在25 cC和 RH 98％条件下培养(PDA培养
基)的菌龄为5 d的荔枝霜疫霉菌菌种，用无菌水冲
洗，制成孢子囊悬浮液。取化合物 1和化合物 2，分
别配制成浓度为 1000 pLg·mL 的贮液。将孢子囊
悬浮液与化合物 1和化合物 2各自的贮液分别配成
浓度50、100、150、200、250 lxg·mL 的含药菌液，含
药菌液的浓度为每视野2O个孢子囊，将含药菌液摇
匀，置于25℃和RH98％条件下培养6 h，在 10×40
倍显微镜下，观察各处理孢子囊萌发数，计算萌发率
或抑制率。
毒力计算方法：将抑制率换算成机率值，质量浓
度以对数值表示，以各提(萃)取物不同质量浓度的
对数值( )减去菌落生长抑制率的几率值(y)，求取
毒力回归方程Y=a+ ，并计算抑制菌丝生长的
Ec50值。
1．6．2 化合物对荔枝霜疫霉菌的活体( vivo)抗
菌试验
参照Jiang等的方法l8 J，将化合物 1和化合物 2
分别配成浓度为500 mg·mL 的溶液 ，接着将药液
分别均匀涂布于荔枝(淮枝)果尖处，凉干，再蘸取
霜疫霉菌孢子囊悬浮液，均匀涂布于施药处，30个
荔枝果为一个处理，重复 3次，同时，设空白试验对
照。单果包装，在 25℃和98％ RH条件下培养 7 d
后，统计病、健果数，计算发病率。
2 结果与分析
2．1 抗菌化合物的结构鉴定
化合物1：为淡黄色粉末。其APCI—MS的负离
子谱显示[M+C1]一的离子峰为 m／z 543，正离子谱
显示[M+H] 的离子峰为 m／z 509。IR(KBr) 。
cm ：3399(OH)，2951(C—H)，1716(C=O)，1652
(C=C)，1453，1379，1107，1049，983，920，877，
851。核磁共振氢谱(400 MHz，氘代吡啶)：8 4．32
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第 1期 吴光旭等：开口箭甾体皂甙元的分离鉴定及其抗荔枝霜疫霉菌活性 91
(1H，br s，H一1)，4．40(1H，br s，H-2)，4．74
(1H，br s，H一3)，5．8l(1H，d，J=3．2 Hz，H4)，
4．54(1H，br s，H-7)，4．56(1H，In，H一16)，0．87
(3H，s，H一18)，1．45(3H，s，H一19)，1．06(3H，
d，J：6．8 Hz，H-21)，4．01(1H，d，J=12．0 Hz，
H-26eq)，4．41(1H，d，J=12．0 Hz，H-26ax)，
4．76(1H，br s，H-27a)，4．79(1H，br s，H-27b)。
核磁共振碳谱(100 MHz，氘代吡啶)见表 1。
对比"C NMR数据，查阅相关文献[2 与天然产
物数据库(Dictionary of Natural Prodtlcts database，
Charpman&Hal，2004，version 12：2)可知，化合物
1为 1p，2p，3p，4p，5p，7 一六羟基螺甾-25(27)一烯一
6一酮(1p，2p，3p，4p，5p，7 一hexahydroxyspirost-25
(27)一en-6一one)。其结构式见图 1。
化合物 2：为浅褐色粉末。其 APCI—MS的负
离子谱显示[M+CI]一的离子峰为 m／z 545，正离子
谱显示[M+H] 的离子峰为 m／z 511。IR(KBr)
v— cm～：3517，3435(OH)，3159(=C—H)，2946
(C—H)，1655(C：C)，1452，1379，1231，1101，1045，
958，920，877，852。核磁共振氢谱(400 MHz，氘代吡
啶)：84．34(1H，br s，H一1)，4．3l(1H，br s，H-2)，
4．74(1H，d，J=3．0 Hz，H-3)，5．3l(IH，d，J=3．0
Hz，H-4)，5．o0(1H，d，J=2．8 Hz，H-6)，4．48(1H，
br s，H-7)，2．61(1H，br t，J=11．6 Hz，H-8)，4．56
(1H，dd，J：14．4，7．6 I-Iz，H一16)，0．93(3H，s，H—
l8)，1．98(3H，s，H一19)，1．06(3H，d，J=6．8 Hz，
H-21)，3．98(1H，d，J=12．0 Hz，H-26eq)，4．4o
(1H，d，J=12．0 Hz，H-26ax)，4．75(1H，br s，H．
27a)，4．78 (1H，br s，H-27b)。核磁 共振 碳谱
(100 MHz，氘代吡啶)见表 1。
圩C NMR显示该化合物有 27个碳原子，其中包
括3个甲基碳、8个亚甲基碳(其中包括一个末端烯
碳 =CH )、4个次甲基碳、7个偕氧次甲基碳和5个
Ho
Ho
oH o
H
H
表 1 化合物1和化合物2的核磁共振碳谱
Table 1 ”C NMR(100 MHz，in pyridine-d 6，8ppm)
data of compounds I and 2
C- Compound 1 Compound 2 C- Compound 1 Compound 2
poeition 8c 8C imltloa 8C 8c
1 76．5 79．7 15 31．5 32．0
2 67．9 67．2 16 81．3 81．3
3 75．5 75．6 17 62．9 63．1
4 71．2 69．8 18 16．3 16．4
5 86．3 78．2 19 13．0 15．6
6 211．1 73．6 2O 42．1 42．1
7 75．2 71．8 21 15．O 15．0
8 40．9 34．6 22 1o9．5 1o9．5
9 38．O 37．6 23 33．2 33．2
1O 5O．2 40 ．4 24 29．O 29。0
11 22．O 2lJ4 25 144．4 14 ．5
12 39．4 39．8 26 65．1 65．0
13 40 ．7 40 ．4 27 1O8．8 108．7
14 49．3 5O．1
季碳。从 以上数据可推导出化合物 2分子式为
C27H4209。
对比碳谱数据，查阅文献[3】，确定化合物2为螺
甾-25(27)一烯一1p，2p，3p，4p，5p，6p，7 一七 醇
(spirost-25(27)一ene一1p，213，313，413，5B，613，7 一hep—
to1)，其核磁共振氢谱和碳谱的数据属首次报道。
其结构式见图 1。
2．2 化合物 1和化合物2对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌
发的抑制效果
化合物1和化合物2对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌
发的抑制效果随浓度升高而增强，化合物1的抗茵毒
力随浓度变化的幅度比化合物 2平缓，在浓度为
250 wg·mL 时，两化合 物的抑 菌效果 基本 相 等
(见图2)。经统计分析得出，化合物 1对荔枝霜疫霉
菌孢子囊萌发的 EC50为 100．25 Ixg·mL一，化合物 2
对荔枝霜疫霉菌孢子囊萌发的Ec∞为 124．37 wg·
mL～ 。
oH oH
化台物 I(Compound I) 化台物 2(Compound 2)
图 1 化合物 1和化合物2的结构式
Fig-I Structures of compound 1 and compound 2
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
V
料
}函
浓度 (ug·m )
Concentrarion
图 2 化合物 1和化合物 2对荔枝
霜疫霉菌孢子囊萌发的毒力
Fig．2 Inhibitory efects on sporanglum germination of
Peronophythora litchi of compounds 1 and 2
2．4 化合物 1和化合物2对荔枝霜疫霉菌的接种
防治效果
在荔枝果尖处定点分别涂抹化合物 1和化合物
2溶液，然后再分别接种霜疫霉菌，于 25℃和 RH
98％条件下培养 7 d，发病率分别为 16．7％和
18．9％，与对照(87．8％)相比，具有显著差异。统
计结果见表 2。
表 2 化合物 1和化合物 2对荔枝霜
疫霉菌的活体抑菌效果
Table 2 Inhibitory efects of compounds 1 and 2 on
P．1itchii in vivo
Note：Followed by the same letters in each column are not sig~if—
eantly diferent at the5％ level(DMRT)．
3 结论与讨论
在以荔枝霜疫霉菌为指示菌的生物活性测定与
TLC分离检测的共同跟踪下，运用硅胶柱层析、反相
硅胶柱层析和凝胶柱层析等一系列分离纯化方法，
从开口箭甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离纯化
得到2个单体抗菌化合物。经现代光谱(MS、IR、1D
NMR和2D NMR)分析，确认化合物 1和化合物2
为甾体皂甙元，其化学名称为 1p，2p，3p，4B，5B，
7ct一六羟基螺甾-25(27)一烯 一酮和螺甾-25(27)一烯一
1B，213，3B，413，5B，613，7ct一七醇。
采用孢子萌发法测定，化合物1和化合物2对荔
枝 霜 疫 霉 菌 孢 子 囊 萌 发 的 EC卯分 别 为
100．28 rag·mL 和 124．37 mg·mL～，化合物 1对荔
枝霜疫霉菌孢子囊萌发的离体抗茵活性强于化合物
2。采用荔 枝活体 接种试验 发现，在质量浓度为
50O mg·mL 时，化合物1和 化合物2对荔枝果实接
种霜疫霉菌的防病率分别为 83．3％和 82．1％，两化
合物对荔枝霜疫霉菌的活体抑菌效果无明显差异。
开口箭属植物所含化学成分多为甾体皂甙类物
质。有文献报道一些皂甙类化合物具有抗植物病原
真菌的作用 引。沈平等口。 在用稻瘟霉菌进行抗
癌活性先导化合物追踪分离时，发现弯蕊开口箭
( wati)根茎的乙醇提取物可使稻瘟霉菌(Pyricu-
laria oryzae)的菌丝发生畸形，分离得到 3个具有很
强细胞毒活性的强心苷，并证明强心苷有抗稻瘟霉
菌作用，另外，还分离出 watosideB、WatosideC、kiti—
genin和convalageninB等4个多羟基甾体皂苷元，
并测定了它们在体 内对肿瘤细胞 62和 A2780a
的细胞毒活性。本研究发现开 口箭中的 1p，2p，
3B，4B，5B，7 一六羟基螺甾-25(27)一烯一6一酮和螺甾一
25(27)一烯一1 B，20，3B，4B，5B，6B，7d一七醇具有抗荔
枝霜疫霉菌活性，进一步说明了开 口箭属植物在植
物源医药和农药研发方面具有重要价值。
参考文献：
[1] 濮社班，钱士辉，丁志遵，袁齐昌．开口箭属五种植物的花粉形
态学研究[J]．中国野生植物资源，1999，18(2)：36—37．
[2] 沈平，王三龙，杨崇仁，蔡兵，姚新生．弯蕊开口箭的多羟基甾
体皂甙元[J]．植物学报，2003，45(5)：626—629．
[3] PanW B，Chang FR，WuY C．Spirostanol sapogeninsfromthe
underground parts of Tupistra chincmsis[J]．Chem Pharm Bu／，
2001．钙 ：1350—1352．
[4] PanWB，ChangFR，wuY c．TupichigeninA。8 new steroidal
sapogenln from Tupistra chinensis[J]．J Nat Prod，2000，63：
861—863．
[5] Wu G x ，Wei X Y，Chen W X．Spirostane~eroidal saponins
from the underground parts of Tup／stra ch／nens／s[J]．Ch／nese
Chem Let，2005，16(7)：911—914．
[6] 吴光旭，杨小玲，刘爱嫒，陈维信．64种植物提取物的离体抗
真菌活性测试[J]．长江大学学报(自然科学版版)，2005，2
(2)：77—82．
[7] 方中达．植病研究方法[M]．北京：中国农业 出版社。1998．
248—249．
[8] Jiang Y M，Zhu X R，Li Y B．Postharvest control oflitchi fruit
rot byBac／／us subtilis[J]．Lebensm-Wits Technol，2001，34(7)：
430—436．
[9] 陈梦菁．铃兰族 的甾体皂甙[J]．植物学通报，1999，16(1)：
37—43．
[1O] 周立刚，张颖君，蔡艳 ，刘玉青，王锦亮 ，王君健，杨崇仁．黄酮
和甾体类化合物的抗真菌活性[J]．天然产物研究与开发 ，
1997。y(3)：24—29．
[11] 江洪，谭汝成，刘汉兰，马敬中，谢九皋．盾叶薯蓣根抽提物中
甾体皂甙成分对植物病原真菌的抑菌活性[J]．华南农业大
学学报(自然科学版)，2002，23(3)：96．
[12] Carotenuto A，Fatorusso E。Lanzoti V，Magno S．Spirostanol
saponins of AUium porum L[J]．Phytochem~try，1999。51：
1077—1082．
【13] Shen P，Wang S L，Liu X K，Yang C R，Cai B。~ao X S．
Structure elucidation and activity evaluation of a new cardenolide
from Tupistra wati Hook．f[J]．ChineseJMed Chem，2002，12
(5)：261—264．
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ ∞
。l墨 0l1 一IIlII
维普资讯 http://www.cqvip.com