全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(4)：428～432
Journal of Wuhan Botanical Research
荞麦属植物三叶期幼叶酯酶同工酶研究
张以忠 ，陈庆富
(1．贵州师范大学生物技术与工程学院植物遗传育种研究所，贵阳 550001；2．毕节学院环境与生命科学系，贵州毕节 551700)
摘 要：用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对荞麦属(Fagopyrum Mil1)8个种(含大粒组 7个种和小粒组 1个种)29份栽
培及野生荞麦植株三叶期幼叶的酯酶同工酶进行了研究。结果发现：酯酶同工酶酶带共 31条，不同物种的酶带数
4～9条，其中甜荞有 8条带，而苦荞为9条。酶带分析及聚类分析表明：大粒组荞麦种的谱带与细野荞(F．gracili—
pes)等小粒组荞麦种间差异极大，甜荞( esculentum)和苦荞(F．tataricum)酶带分别与大野荞( meg~paaanium)
和毛野荞( pilus)相似，并分别与大野荞和毛野荞聚类最近，提示大野荞和毛野荞可能分别是甜荞和苦荞的祖先
种 。
关键词：甜荞；苦荞；野荞；酯酶同工酶；系统关系
中图分类号 ：Q946．5 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2008)04—0428—05
Esterase Isozymes of Young Leaves
at Three-leaf Stage of Genus Fagopyrum Plants
ZHANG Yi．Zhong 一．CHEN Qing—Fu
(1．Institute ofPlant Genetics and Breeding，School ofBiological Technology and Engineering，Guizhou Normal University，
Guiyang，Guizhou 550001 China；2．Department ofEnvironment and Life Scie~e， 洳 Colege，Bijie，Guizhou 551700 China)
Abstract：The esterase isozymes of twenty-nine accessions of cultivated and wild buckwheat belonging to
eight species of genus Fagopyrum were studied by means of polyacrylamide gel eletrophoresis(PAGE)．
The results showed that there are a total of thirty—one bands of esterase isozymes，with a range from four
bands to nine bands among different buckwheat species．F．esculentum and F．tataricum respectively have
a total of eight bands and nine bands among different accessions．The results of the zymograph analysis
and the clustering showed that there are much great difference of zymographs between the big-achene
group and the small—achene group and that F．megaspartanium and F．pilus are close in clustering tree to
F．esculentum and F．tataricum，respectively，supporting Chens hypothesis that F．megaspartanium and F．
pilus may be the ancestors of F．esculentum and F．tataricum．respectively．
Key words：Common buckwheat；Tartary buckwheat；Wild buckwheat；Esterase isozyme；Phylogeny
酯酶同工酶在高等植物中广泛存在，具有明显
的种属、组织和发育阶段特异性，在一定程度上反应
植物的系统发生_】’ 。同工酶作为基因表达的产
物，其酶谱的差异能够很好的衡量种间的亲缘关系，
也可揭示种间、种内在进化过程中的变异程度_3’ 。
因此利用同工酶技术探讨植物的亲缘关系是一种较
为可靠的手段 。
荞麦属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopy-
rum) 。有两个栽培种，一个是甜荞(F．esculen．
rum Moench)，另一 个是苦荞 (F tataricum (L．)
Gaertn．) 。到目前为止，该属约有 l6个种，其中
7个种属于大粒组，9个种属于小粒组，荞麦属的这
两个组间遗传差异很大 ¨”’ 。
目前，国内外有关荞麦酯酶同工酶的研究报道
较少。主要有 Chen_1 对 7个荞麦种发芽种子酯酶
同工酶以及王转花等 对甜荞和苦荞干种子酯酶
同工酶作过初步分析。本实验首次对荞麦属所有大
粒组种和部分小粒组种的酯酶同工酶进行研究，以
期为荞麦属种问系统关系、栽培荞麦起源与演化、荞
麦遗传育种及开发利用等研究提供参考。
收稿日期：2008—02—20，修回日期：2008—04 02。
基金项目：国家自然科学基金项 目(30471116)；教育部新世纪人才支持计划(NECT2004—0931)；国家“十一 ·五”科技支撑计划
(2006BAD02B06)；贵州省动植物品种专项(黔农育专字[2007]026号)；贵州省教育厅自然科学培育项目(黔教科2006103)。
作者简介：张以忠(1977一)，男，硕士。讲师，从事大学生物学等课程的教学和荞麦研究工作。
通讯作者 (Author for corespondence．E—mail：cqf1966@163．com)。
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第4期 张以忠等：荞麦属植物三叶期幼叶酯酶同工酶研究 429
1 材料与方法
1．1 供试材料
供试材料来源于贵州师范大学生物技术与工程
学院植物遗传育种研究所，其编号、种名、倍性、原产
地、代号等见表 1。
1．2 实验方法
1．2．1 样品制备 供试荞麦材料播种到生长室花
盆内，取第三真叶完全展开时的幼叶。先用自来水
冲洗，再用双蒸水冲洗，用于净滤纸吸于水分。取该
表 1 供试荞麦材料
Table 1 Buckwheat materials used in this study
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430 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
养麦幼叶0．5 g，加0．8 mL双蒸水、0．96 g聚乙烯基
吡咯烷酮和0．5 g石英砂，冰浴研磨至匀浆。4~C下
4000 r／min离心20 min，取上清液，待电泳分析。
1．2．2 制胶及电泳 采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶
技术，分离胶浓度为8．5％(pH 8．9)，浓缩胶浓度为
5．16％ (pH 6．3)，胶 板 为 20 cm ×12．5 cm ×
0．23 cm，每个样品槽加样约60 ，上槽加 1滴 2％
溴酚蓝，4℃下进行 电泳，起始电压 100 V，2 h后
200 V，待溴酚蓝指示线移至距胶底0．2 cm时，终止
电泳。
1．2．3 染色及记录 酯酶同工酶的染色与固定，参
照 Chen¨ 及胡能书等⋯的方法稍加改动。具体方
法为：电泳完毕并经双蒸水冲洗 3次的凝胶放入 pH
6．0的磷酸盐缓冲液(配方为：取 31．43 g NaH PO
· 2H2O定容到 1000 mL记为 A液，再取 71．66 g
Na2HPO4·12H2O定容到 1000 mL记为 B液。然后
取 A液460 mL+B液40 mL+双蒸水 500 mL，并用
1 mol／L NaOH调至 pH6．0)中，37℃下保温 30 rain
后倒 出缓 冲液，换 上染 色 液 (配 方 为：10 mL
0．2 mol／L Na2HPO4+50 mL 0．2 mol／L NaH2PO4+
40 mL双蒸水 +坚牢蓝 RR盐 0．2 g，充分搅拌溶解
过滤待用)。置 37~C下保温50 min，倒出染色液，用
自来水冲洗，拍照后放入7％的乙酸中保存。
1．3 数据分析方法
本研究采用系统聚类法，首先将各样本看成一
类，有酶带数计为 1，无酶带计为0，使用 SPSS 11．1
分析软件，利用欧氏距离计算样品间距离，用最短
距离法计算类群间距离，按系统聚类分析方法对收
集系进行聚类分析。
2 结果与分析
8个种 29份养麦材料三叶期幼叶的酯酶同工酶
电泳结果见图1。从图 1中可以看出，酯酶同工酶谱
带 31条。根据谱带的分布，可分为 3个 区：a区
(EST 1～12)，b区(EST 13～14)，c区(EST 15～
31)。甜养 (ES2～ES6、ES8～ES12)，共 8条带
(EST：4、8、15、17、18、20、24、27)。其中，有 3条带
(EST：4、8、27)为主带。所有供试甜养收集系种内
无变异。苦荞(TA2、TA4～TA9、TA11、TA12、TA14、
TA15)，共9条带(EST：1、2⋯7 9 10、11、18、24、26)。
所有苦麦收集系种内未发现变异。 zuogongense
(ZU1)，共 6条带(EST：18、20、22、24、26、28)，其中
(EST：5、2条带(EST：22、28)为主带。F．pilus(PI1、
PI2)，共6条带(EST：2、11、12、18、24、26)。其中5
条带 (EST：2、11、12、23、26)为共有带。1条带
(EST：19)种内存在变异。 giganteum(GI2)，共 7
条带(EST：5、14、16、20、27、29、30)，其中 2条带
(EST：5、27)为主带。F．megaspartanium(ME4)，共
7条带 (EST：4、8、15、18、20、25、27)，其 中4条带
(EST：4、8、15、27)为主带。F．esculentum vat．homo-
tropicum(HO1)，共 4条带(EST：4、21、27、28)，其中
2条带(EST：4、21)为主带。F．cymosum(CY1)，共7
条带 (EST：5、14、16、24、26、30、31)，其中 2条带
(EST：14、16)为主带。 gracilip (GR1)，共 6条
带(ESTb：3⋯6 7 13、14、22)，其中4条带(EST：3、6、
13、22)为主带。
根据酶带在各区中的分布情况可将上述养麦分
为5种类型。类型 I：b区无带，a区有谱带 EST：2、
EST：11，c区有谱带 EST：15、EST：24、EST：27，包括
苦养和 pilus(PI1、PI2)。类型 I：b区无带，a区
有谱带 EST：4、EST：8，c区有谱带 EST：15、EST：18、
EST：20、EST：27，包 括甜养 和 meg~paaanium
(ME4)。类型m：b区无带，a区无带或有谱带 EST：
4，c区有谱带 EST：28，包括 esculentum var．homo．
tropicum(HO1)和 zuogongense(ZU1)。类型1V：b
区 EST：14有带，a区有谱带 EST：5，c区均有带
EST：16、EST：30，包括 giganteum(GI2)和
／1,o5um(CY1)。类型V：b区有独特带 EST：13，a区
有独特带 EST：3、EST：6，c区有带 EST：22，仅有
gracilipes。
从以上分析可以得出：甜养与 meg~paaani．
um、F．esculentum vat．homotropicum、F．zuogongens．苦
养与 pilus、 giganteum、 6~mosl,m分别被归人同
一 类中，暗示彼此有较紧密的联系。 gracilipes单独
成类，暗示与其它养麦之间的亲缘关系较远。
运用欧氏距离，以最短距离法，对上述养麦进
行系统聚类，结果见图2。T=8时，供试养麦独立
成类，与传统分类一致。T=17时，供试养麦分为
6类。其 中 甜 养 和 F．megaspartanium、苦 养 和
F．pilus、F．cymosum 和 F．giganteum分别 聚为一
类，提示它们之间分别有一定的亲缘关系。T：22
时，供试 养麦 明显分为 2类，即大粒组 的甜养、
F．megaspartanium、F．esculentum var．homotropicum、
F．zuogongense、苦 养、F．pilus、F．giganteum、
F．cymosum和小粒组的 F．gracilip黜，暗示养麦两个
组间的亲缘关系很远。
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第 4 期 张 以 忠等 ：荞麦属 植物三 叶期幼 叶酯酶 同工 酶研 究 4 3 l
(+ )
(+ )
(+ )
(一 )
2 3 4 5 6 7 8 9 10
2 3 4 5 6 7 8 9 10 1
3A
(+ )
27
强
18
17
15
8
4
(一 )
(+ )
26
24
1 8
11
10
9
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2 3 4 5 6 7 8 9 10 ll12 13 14 15 (一 )
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[ = ■二二I = ] 【二] 【= ] 【= ] [
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 1¨ 11
? 表示 很深 带： 一 表示 深 带 ； 一 表示 浅带 。 1A ， 1 B ： 甜荞酯酶 同工 酶酶图O A )及 模式 图fIB )。 样品 I ～ 10分 别是 E S 2、 E S 3 、
E S 4 、 E S 5 、 E S 6 、 E S 8、 E S 9 、 E S l0 、 E S ll、 E sl2； 2A ． 2B ： 苦养酯 酶 同工 酶酶图(2A )及模式图(2B )。 样品 1 ～ 11分别 是T A ． 2 、
T A 4 、 T A ． 5 、 T A 6 、 1 1A 7 、 T A 8、 T A 9 、 T A ll、 T A l2、 1 A 14 、 T A l5 ： 3A ， 3 B ： 不 同荞麦种 的酯酶 同工 酶酶 图(3 A )及模式 图(3B )。
样 品 1 ～ 15 分 别 是 E S 3 、 E S 4 、 E S 2 、 Z U l、 P 11 、 P 12 、 M E 4 、 G R l、 H 0 1 、 G 12、 C Y l、 T A l2、 T A 7 、 T A 2、 T A 8
D ark, light， andem p ．1y re． an gles are standfor very dark． dark, an dlightbands． respectiv ely． 1A ， 1B ： E sterase isozym e zym ographs (1A )and
ideogram s (IB )ofF E sculenno n S am ple l一 10 is E S 2 ． E S 3 ， E S 4 ， E S 5． E S 6， E S 8， E S 9 ， E S l0， E S ll， andE S l2， respectively；2A ， 2B ：E sterase
lsozym e zym ogr aphs (2A )an dideogr am s (2B )ofF T ataricum ． S am ple l— 11 is T A 2， T A 4 ， T A 5， T A 6， T A 7． T A 8， T A 9 ， T A lI．T A l2． T A l4 ． an d
T A l5， respectively； 3 A ， 3 B ： E sterase isozym e zym ographs (3 A )an dideogram s (3 B )ofbuckw heatspecies S am ple 1． 15 is E S 3 ． E S 4 ． Z u l，
P Il， P 12． M E 4 ， G R l． H 0 1． G 12． C Y l． T A l2． T A 7 ， T A 2 an dT A 8． respectively
图 1 荞麦属植物 三 叶期 幼 叶酯 酶 同 工 酶 酶 图 (A )及 模 式 图 (B 】
F ig． 1 E sterase isozym e zym ographs (A ) and ideogram s (B ) ofbu ckw heatyou ng leaves at three leafstage
O 5
T
10 15
T
20
T
25
┏━
┳━
┳┓┃
┃┣╋
┫
-J I
┃
l
┫
┣╋
l
━
┻
l
┗┛
图中各代号代表 的种名见表 I
T he sym bols ofaccessions in the figure see T able 1
图 2 荞麦三 叶期幼叶酯酶 同工 酶聚类图
F ig． 2 C lustering ofesterases isozym e zym ographs of
the young leaves ofbuckw heat atthe three - leafstage
3 讨 论
目前 ， 国 内外对荞麦酯酶 同工 酶 的研 究报道较
少 。 1999 年 C hen ll5 ] 研 究 了 7 个 荞 麦 种 (苦 荞 、 甜
荞 、 F ． zuogongense 、 F ． m egaspa rta nium 、 F ． pilus 、 F ．
gracilipes 、 F ． pleiram osum )发 芽种 子 的酯 酶 同 工 酶 ，
发现 了 16 个不 同谱带 ，酯酶 同工 酶在 同 一 种 不 同品
系之 间变异很小 ，但在不 同种 问表现 出明显 的差 异 。
同时发现 F ． m egasparta nium 和 F ． pilus 的谱带 分 别
与甜养和苦荞 的相似 ， 并结合形 态 、 核型 、 可 杂交性
等方面 的研 究提 出 F ． m egaspartanium 和 F ． pilus 可
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432 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
能分别是甜荞和苦荞的祖先种。王转花等 19]1998
年利用荞麦干种子研究了甜荞和苦荞的酯酶同工
酶，结果发现苦荞有4个不同谱带，甜荞有 3个不同
谱带，并认为苦荞的酯酶同工酶在种内存在一定变
异，甜荞种内差异较小。本研究首次对荞麦属所有
大粒组种和部分小粒组种三叶期幼叶的酯酶同工酶
研究发现：酯酶同工酶酶带数共 3l条，其中甜荞有
8条带，而苦荞为9条，谱带数及其分布与上述报道
有差异，其原因可能是本研究与上述研究的材料差
异性以及生育期的不同等。无论是甜荞还是苦荞，
本研究中不同收集系问未发现变异，暗示不同荞麦
类群问变异很小，与酯酶、谷草转氨酶等同工酶已有
的研究结果相似 ¨ 。另外，本研究发现 F．眦一
gaspartanium和F．pilus的谱带分别与甜荞和苦荞相
似，而且在聚类树上分别与甜荞和苦荞聚类最近，暗
示甜荞和苦荞可能分别由大野荞和毛野荞进化而
来，支持 Chen¨ 的假说。
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