全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(4)：292～297
Journal of Wuhan Botanical Research
高亲和 K+转运载体 SsHKT1的抗体制备及表达分析
邵 群 ，韩 -7 ，丁同楼 ，王宝山
(1．山东师范大学生命科学学院，济南 250014；2．山东轻7-业学院食品与生物7-程学院，济南 250100)
摘 要：利用 RT—PCR及 RACE技术从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L，)根中克隆了高亲和 K 转运载体 SsH—
KT1的基因。以SsHKT1基因的cDNA为模板，扩增了 cDNA中的亲水片段 (403—612 bp)，连接至原核表达载体
pGEX-6P一3中并转化大肠杆菌 BI21(DE3)，IPTG诱导表达了融合蛋白。该蛋白主要以包涵体的形式存在，纯化后
免疫新西兰兔，得到了特异性较高的SsHKT1多克隆抗体。利用此抗体进行了Western blot分析 ，表明 SsHKT1可能
主要存在于质膜上。进一步研究了 K 饥饿及盐胁迫条件下 SsHKT1蛋白表达量的变化，结果表明 K 饥饿及盐胁
迫条件下 SsHKT1的表达量都明显增加，表明 SsHKT1在盐地碱蓬 K 吸收特别是高盐条件下 K 营养中有重要作
用 。
关键词 ：SsHKT1基因；多克隆抗体；盐胁迫；K 营养
中图分类号：Q945．78 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2006)04—0292—06
Polyclonal Antibody Preparation and Expression Analysis of
High-affinity K Tran sporter SsHKT1
SHAO Qun’，HAN Ning 一，DING Tong— u ，WANG Bao—Shan’
(1．Colege ofcife Science，Shandong Normal Unitersity，ji’nan 250014，China；
2．Colege ofFood and Biotogic Engineering，Shandong l~tuute ofu#t，ndw‘ ，ji’nan 250100，China)
Abstract：We isolated a cDNA homologous to T／from Suaeda salsa L．(Ss脒 )roots using RT—
PCR and RACE methods．The hydrophilic fragment(403—612 bp)was amplifed by PCR from Ss脒
cDNA of halophyte S．salsa L．PCR product was inserted into prokaryotic expression vector pGEX-6P一3．
The recombinant vector was transformed into Escherichia coli BL2 1(DE3)and the GST—SsHKT1 fusion
protein expression was induced by IPTG．The fusion protein was mainly in inclusion bodies．The purified
protein was injected into a New Zealand rabbit and the rabbit’S anti—serum against SsHKT1 with higher
specificity was prepared．Western—blot analysis using this polyclonal antibody demonstrated that SsHKT1
may be localized to the plasma membrane．Further study shows that level of SsHKT1 proteins increase an—
der conditions of K starvation or salt stress．These datas SUggest that SsHKT1 iS important for K uptake
of S．salsa L．and particularly for K nutrition under high salt conditions in this plant．
Key words：Ss脒 T1：Polyclonal antibody：Salt stress：K nutrition
HKT(high—afinity K transporter)类蛋白属于一
个广泛存在于植物、真菌、真细菌和古细菌中的 K
转运体超级家族。1994年 Schachtmanl 从小麦幼
苗根 cDNA表达文库中克隆到第一个高亲和 K 载
体蛋白HKT1的基因，以后陆续在拟南芥、水稻、桉
树、冰叶日中花等多种植物中克隆了其同源蛋白的
基因。植物 HKT类蛋白既可以作为高亲和 K 转运
载体 J¨，也可以作为 Na 转运体 J，也可能有双重
功能但对 K 、Na 选择性不同 ¨J。以前的研究认
为在盐胁迫条件下 HKT类蛋 白的作 用是有害
的 ¨ ，如高 Na 条件下，AtHKT1是负责组成性低
亲和性 Na 吸收的候选基 因，在盐胁迫时会造成
Na 毒害。然而在野生型拟南芥中，其有益的生理
功能也逐渐得到揭示，Maser 认为 AtHKT1参与调
控Na 在根和地上部分的分配，更多的研究结果 ，
则认为 AtHKT1参与 Na 通过韧皮部汁液从地上部
分至根部的再循环过程，此过程从地上部分移走了
大量的Na ，降低了叶中 Na 的积累。Ren等 在
水稻中有关 SKC1的实验数据也支持上述观点。这
些结果证明HKT类转运体在提高耐盐性中可能具有
收稿日期：2005-12-09，修回日期：2006-07-19。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30270793)；山东省自然科学基金重点项 目(Z2004D03)资助。
作者简介：邵群(1967一)，女，副教授，硕士，主要从事植物生理及分子生物学研究。
+ 通讯作者(E-mail：bswang@sdnu．edu．ca)。
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第 4期 邵 群等：高亲和 K 转运载体 SsHKT1的抗体制备及表达分析 293
重要的作用。但是，对于 HKT类蛋白表达、功能及
结构的理解大多处于推论及假说阶段，不同实验室
得出的结论仍存在很多的争议。
已经克隆的 HKT类蛋白基因多来自非盐生植
物，在盐生植物中其功能及相关特性所知较少。盐
生植物能在高盐环境中生长发育并完成生活史，而
非盐生植物则不能。两类植物在 K 、Na 的吸收、
运输、区域化和外排等方面的差别可能是它们抗盐
性不同的关键 。真盐生植物盐地碱篷 (Suaede
salsa L．)是中国特有的一种典型的积盐型盐生植
物，盐胁迫条件下，在外界高 K (mmol／L)时 K 、
Na 的吸收相互竞争，这与非盐生植物相同 J，而在
外界低 K (~mol／L)条件下，Na’浓度的增加对植
株的K 含量并无明显影响，推测在低 K (~mol／L)
条件下，盐地碱篷可能拥有一种不受外界高 Na 条
件影响的非常有效的 K 吸收系统 引¨，推测 HKT蛋
白可能与此有关。因此，研究盐生植物 HKT蛋白基
因克隆、表达和功能分析及其在抗盐性中的作用具
有重要意义。
我们从真盐生植物盐地碱蓬中克隆了K 转运
载体蛋白 SsHKT1的基因(GenBank accession No．
AY530754)，将其基因片段在大肠杆菌中进行 了原
核表达并制备出了 SsHKT1蛋白的多克隆抗体，利
用此抗体进行的Western blot分析结果表明，SsHKT1
可能主要存在于质膜上，进一步检测了 K 饥饿及
盐胁迫条件下 SsHKT1蛋白水平表达量的变化。初
步证明 SsHKT1在高盐条件下盐地碱蓬 K 营养中
有重要作用。
1 材料与方法
1．1 菌种、质粒、实验动物、工具酶及试剂
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5o~、大肠杆菌
BL21(DE3)及质粒 pGEX-6P一3由本实验室保存。
雄性新西兰长毛兔购自山东省农业科学院。
Trizol、5_RACE试剂盒购 自Invitrogen公司，限
制性内切酶、连接酶、DNA分子量标记及 RNA PCR
Kit(AMV)Ver 2．1试剂盒及 T vector试剂盒购 自
Takara公司。IPTG、蛋白分子量标记、碱性磷酸酶标
记的羊抗兔购 自北京华美生物工程公司；Freund’S
佐剂购自上海生物工程公司。其他常规化学试剂均
为分析纯产品。
1．2 植物材料的准备
基因克隆所需材料的准备：待沙培的盐地碱蓬
(Suaeda salsa L．)小苗长到2—4片真叶时移出，用
1／5 Hoagland营养液 [(1 mmol／L KNO ，1 mmol／L
Ca(NO3)2，0．2 mmol／L KH2PO4，0．4 mmol／L MgSO4，
5．0× 10 mmol／L H3BO3，1×10 mmol／L H2MoO4，
1×10 mmol／L CuSO4，4 × 10 mmol／L ZnSO4，4 ×
10 mmol／L MnCI2，0．04 mmol／L Fe．EDTA，pH5．0)]
通气水培养 1周，转入改良的低钾 1／5 Hoagland营
养 液(不加外源 K 、KH PO 和 KNO ，分别用
0．2 retool／L NaH2PO4和O．5 retool／L NH4NO3代替)中
处理l6—24 h。收集根，液氮速冻，一8o℃保存备用。
Western blot分析材料的准备：低钾处理方法同
上，处理 4 d，未 经低钾处理 的小苗 作 为对照。
200 mmol／L NaCI胁迫处理直接用沙培小苗，每天
以 100 mmol／L NaCI递增，达到 终浓度 后用 含
200 mmol／L NaC1的 1／5 Hoagland营养液浇灌 1周，
未受盐胁迫的幼苗作为对照，收集叶及根，液氮速
冻，一80℃保存备用。
1．3 盐地碱蓬高亲和 K 转运载体 HJ盯z eDNA
克隆的分离与测序
以低钾处理的碱蓬幼苗根为材料，Trizol法提取
RNA，根据小麦、拟南芥、水稻等植物中已克隆的
HKT同源基因的保守序列设计兼并引物进行 RT．
PCR，得到 SsHKT1基因的部分片段，经过 3’及 5’一
RACE反应得到可能编码 SsHKT1的cDNA序列，用
克隆载体 pMD18一T上的通用引物对插入片段测序，
获得编码 SsHKT1的cDNA全长序列。
l 4 盐地碱蓬 HJ盯z基因片段的扩增
以SsHKT1 cDNA质粒为模板，在SsHKT1 cDNA
开放阅读框403—612 bp处分别设计带接头的引物。
上游接头为 BamH I：5，_CGC GGATCCCATITlqCG一
— 鬲丁一
GCCTCGA一3’；下游接头为 Xho I：5’一CGACTCGAG一
——赢 一
仉 CCTAAq3"GA邢 GA-3’。
PCR反应程序为：预变性 94℃ 3 min；然后变性
94℃ 30 S，退火55℃ 30 s，延伸72oC 1 min，循环 35
次；最后一次循环完成于72℃ 延伸 10 min。
1．5 重组质粒的构建及鉴定
将扩增得到的SsHKT1基因片段克隆到pMD18一
T载体中，构建重组质粒 pMDH。测序工作 由 In—
vitrogen公司完成。在 BamH I和 Xho I位点将基因
片段连人原核表达载体 pGEX-6p-3，转化大肠杆菌
BI21(DE3)，用片段两端的引物进行 PCR检测，挑
选阳性克隆，提取质粒测序。
1．6 融合蛋白的诱导表达及包涵体的纯化
将含 有 表 达 片 段 的 阳性 克 隆 接 种 于 含
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294 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
50 g／mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37c【=振
荡培养过夜。将培养好的菌液按 1：100的比例转接
人 800 mL新 鲜 的 含 氨 苄 青 霉 素 (终 浓 度 为
100 g／mL)的 LB液体培养基中，37℃培养至 OD鲫
约为0．5左右。加入 IPTG至终浓度为 1 mmol／L，
30℃继续培养4 h以诱导蛋白的表达。包涵体蛋白
的纯化方法参照文献[1l，l2]并加以改进如下：离
心收集菌体，菌体细胞重悬于 PBS(137 mmol／L
NaCI，2．7 mmol／L KCI，10 mmol／L Na2HPO4，2 mmol／
L KH2PO ，pH7．4)中，超 声 波 裂 解 菌 体，4c【=
10 000 g离心收集包涵体，洗涤液 (0．5％ Triton一
100，10 mmol／L EDTA，裂解液)洗涤 2次，裂解液
(50 mmol／L Tris—HCI，1 mmo~L EDTA，100 mmol／L
NaC1，pH8．0)重悬包涵体加溶菌酶消化 1 h，超声波
作用 l min，离心收集包涵体，洗涤液洗涤4次，PBS
洗涤 2次，PBS溶液重悬包涵体。SDS—PAGE电泳，
参照标准蛋 白浓度进行 定量 (利用 band leader
application version 3．0)。分离胶浓度为 12％。
1．7 动物免疫
将纯化的融合蛋 白进行 SDS—PAGE，割取含有
融合蛋白的凝胶块，将胶块在液氮中研磨成粉末状，
再与完全弗氏佐剂充分乳化混匀，按常规方法免疫
新西兰兔(背部皮下多点注射)，共免疫 4次，每次
约 1．0 mg蛋白，每次免疫间隔4周左右，最后一次
免疫3～5 d后心脏取血，4c【=析出血清，分离血清，
加 0．02％ 叠氮化钠，一8Oc【=保存。
1．8 碱蓬质膜微囊及液泡膜提取
参照 Wang等 ¨的方法进行。
1．9 抗体特异性及不同离子处理样品的 Western
blot分析
将纯化 的融合蛋 白包涵体样 品(1 0 g)，经
SDS—PAGE分离后再电转移至硝酸纤维素膜上，经
封闭液(含 1％脱脂奶粉的TBS)室温封闭2～3 h，
加入 1：200比例稀释的抗血清为一抗，4℃震荡温育
2 h，TBS洗膜3次；加入 1：1000稀释的碱性磷酸酶
标记的羊抗兔二抗，室温震荡温育 1 h，TBS洗膜 3
次，在碱性磷酸酶显色缓冲液中加入 NBT／BCIP使
底物显色，检测抗体的特异性。
从不同离子处理的幼苗叶或根中提取质膜，利
用制备的多克隆抗体进行 Western blot(质膜蛋白上
样量为40 g)，分析 SsHKT1基因在蛋白水平的表
达情况。
2 结果与分析
2．1 盐地碱蓬高亲和 K 转运载体 SsHKT1 eDNA
序列及分析
高亲和 K 转运载体 SsHKT!eDNA序列全长
2 033 bp，包括 54 bp的5’一非编码区和 332 bp的
3’一非编码区(图 1，图2)。开放阅读框为 1 650 bp，
编码 550个氨基酸残基，分子量约 63．0 kD。SsH-
KT1起始密码子 ATG位于序列“AAAGATGTr”内，
与 Ltlteke 14]所 推 断 的植 物 起 始 密 码 子 序 列
“AACAATGGC”类似，证明“AAAGATGTr”确实为
SsHKT!eDNA起始序列。在 3’一非编码区位于 poly
(A)上游 27～33 bp处存在 1个推测的多腺苷酸加
1 AAA AAC AAT TCC TTA CAA AAA AAA AAA AATAAA 33
34 AAA AAA TAC CAA 1 CAA AAG缝 1弋G AGT TTC 66
图 1 盐地碱蓬 SsHKT1 cDNA序列5’-非编码区
(划线部分表示起始密码子，阴影部分
为起始密码子序列)
Fig．1 5’．noncoding re on in cDNA sequence of
ssHKTl of Suaede salsa L．(The initiation codon is
underlined and the sequence of the initiation
code is marked in shade)
l 702 C2’C rAA AAC CAA TTT 1’AT TGA rAG A1’A GAT TCT rrAA CTC CTC CCG l 746
l747 A ’AGT GCT CCT TAC TCA TTA AAA TTT TCC C11A ATC G ～ 1 r l79l
l792 AGG GAA AGT TTA TTG GGT ACG GAG 1 r AAT ATC GGG TGG AGT TAC l 836
l 837 GAA T TTT GTG TGC TTC TTG GTG A T 气 ATC C丁T GAA TTG TGA J88 J
l 882 CTT TAA TTT TTT TGT rA CGT GTC GTG TGC TTC TTA TAA GAC TGG l926
l927 TGA AAG GGT CAT GCA TTG TTG 1 r CAG TTG CAT GAT TTT TTC 1 r l97I
J972 GGC CTG CAT CAA CTG AA 1’A j rr GTT A11A 1’ CGA 11AA TTT 11_A 2Ol6
2OI 7 TTT TCA AAA AAA AAA AA
图 2 盐地碱蓬 SsHKT1 cDNA序列3’-非编码区
(划线部分表示终止密码子，阴影部分为推测的多腺苷酸加尾信号“A1TrAAT”)
Fig，2 3’．noneoding re on in cDNA sequence of&朋 of S．salsa L，
(The termination codon iS underlined and the putative polyadenylation signal iS in shade)
尾信号“ArIAAT”。
2．2 SsHKT1蛋白多克隆抗体的制备
2．2．1 pGEX-SsH 枷 加重组质粒的构建
用设计的SsHKT!eDNA阅读框的5’端及3’端弓
物，I,NeDNA为模板扩增出1条长210 bp的SsHKT1基
因的eDNA片段，符合预期大小(图3)。序列分析表
明，该eDNA片段编码70个氨基酸残基，预计分子量
为7．49 kD。将产物回收纯化，连接到pMD18-T载体
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第4期 邵 群等：高亲和K 转运载体S~HKT1的抗体制备及表达打折 295
巾并对重组分子pMDH进行测序．结果表明扩增出
的SstlKTt片段序列与已克陛的SsHKTI摹因的eDNA
序 列 完 全 一 致．经 BamH I和 Xho I双 酶 切
pMD-SsHKT1后连人原核表达载体pGEX一6p 3。转化
大腑杆菌BL21(DE3)．用 片段两端 的 l物进 行PCR
检测，挑选阳性克隆，经删序鉴定，构建重组分子
pGEX一．SsflKTI帕 【引 正确，
1 扩增 蚋 5sHKTI片段
M：分子量标准I)L20O0
I：Amplifled 5silK7。I frt~,roenl；
M 【NA nmrker DI2000
图 3 SsHKTI基 因片段 的
PCR扩增
Fig 3 FCR—amplified product
of HKTl fragment
2．2，2 融台蛋 白的诱导表达
经 IPYG诱导后的细胞粗提物进行 SDS—PAGE
电泳检测( 4)，大肠杆菌BI2l(DE3)(pGEX-SsH—
KT1 j )柱33．5 kD附j丘H 5现高水平表达的蛋白
条带，与预期的融合蛋白GST—SsltKT1分子量一致．
而太肠杆菌 BL21(DE3)(pGEX-．6p一3)在相同分子
量部位没有相应的噩白条带，只在26．0 kD的位置
出现了GST蛋白的特异条带，表明插人的外源基因
片段已经成功地在大肠杆菌中表达．并与 GST形成
了融台蛋白
i M ! n
一 2
饕
I：E coil IH21(1J1,21 J【I_L r x-6p．jj 喃呼盘曲蛋白；
2：E．cp“I]121(D )【pGEX—SsHKT[】的诱导仝茼蛋白；
M：蜇I~1质廿子量标
I： lol pn,tein l coli Bl2【(D母 )(pGEX~p-3)
findue~t)；2：T~tal p~lein o r" coilBJ2】(DE3 J(pGEX
HKn j finduct~[)；M ：Pn,teiI1 m“】 】I r weight marker
图 4 GST-SsttKT1融 合蛋 白诱导产 物的 SDS-PAGE
Fig．4 SDS—IAGE of induc~menl of GST- HKTI
fushm protein
2 2．3 融合蛋白的存在形式及纯化
将 F,I2．1(1IE3)(pGEX—SsHKTI)诱导后的菌体
超声波破碎 离心，沉淀及 上清液分别进行 SDS—
PAGE，融合蛋白在 匕清液和沉淀中都有．『旦主要存
在于沉淀巾，说明融台蛋白主要以包涵体的形式存
在(翻5：左、 经纯化，得到较高纯度的包涵体，除
了特异的主带以外．只在分子量鞍小的位置隐约有
两条小带．这可能是包涵体蛋白少量降解的产物
(图 5：右)
’ 卵 4 M
： ：二
一
kD
盘 -20．1一m 婆
一
14 q一_ _
】： thl“2Ill】E3 J。I,GEx一&~tCK i请导 过 ．趟声 破碎 樽到
的沉淀；2：E．。 tJ,IJ2【(I}F3)( EX—SslIKTI)诱导丧丛．超声破
碎得到的 L清液；3：含pGEX-6pI3守拽抽龋体蛋白f束诱导)；
4：纯化的包涵悻：M：标准蛋口质分于鞋
I：Ptllet( coli B J2I(DE3)(pGEx—SsIIKTI)after ultm~nlc—
b~aking(indu,：ed J；2：s mB【H玎 l coil n12I(I)碉 )(pGEX一
脒 "17) er ultr~mic—b~aking(indue )：3： rott~I protein of E
咖“It 1(】 )(pGEX-6p-3)(uni．duotd)；4：】tlriftedinclusi．n
h l ：M Pn~tein n1(·Ie l ~eighl rker
图 5 融台 蛋白 GST-SsHKTI在太肠杆菌 B12．1
cDE3)中的表达(左)殛包涵体的纯化f右)
Fig．5 Expression Df GST—SsHKT1 in E cdi BI2I
f DE31(1eft)and purification of inchtsion bodies(r~gllt)
2．2．4 抗体特异性分析
得到的多克隆抗血清，以1：200比例进行稀释，
用 Western blot检测其特异性，在 33．5 kD处出现
l条特舁的蛋白带 (图6)。提取低钾处理的盐地碱
图 6 SsHKTI多克隆抗体 的
Western blot鉴定
、 5 kI) Fig．6 Identification of SsHKT1 polyc-
lonal sntibodi~ using Westert—Blot
篷衽3的质膜 及液泡膜．抗体进 行 1：1o0稀释，经
Western blot检测，结果显示根质膜样品的泳道在
63．0 kD的位置可见与 SsHKII推测分子量大小相
符的特异条带．而在液泡膜样品泳道相同位置未见
条带，表明抗 GST—SsHKTI血清具有较好的特异性，
而且可以将 SsHKTI定 啦雁膜 七(图7)
1：盐地蜮矗杖皿膜：2：盐地碱蓬档被糙 ；M：酥桃蜇自庙分子错
l：Plasma memh~ le m 妇 I n《l ：2： m 舯}from S m
加 L 呻 I ：M：Fmtein m．1ex：ular weighl mRrk~y
图 7 SsHKT1蛋白的 V．~eslerll-blot分析
Fig．7 ~eslcrrl—Blot ananlysis of SsHKT1
polyc[onal antilx~dies
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
2．3 盐地碱蓬 中 SsHKT1蛋 白的表达受低 K 和
高 Na 的诱导
植物中 K 载体通常以很低的水平表达 ¨，作
为一种高亲和性的 K 载体，小麦、大麦及水稻中
HKT类蛋白的基因在 K 饥饿情况下 mRNA表达量
明显提高 ¨” ，本实验首先分析了SsHKT1在 K 饥
饿条件(不加外源 K )下蛋白水平的表达情况。
从高 K (1．2 mmol／L)及低 K (约 40 p,mol／
L)处理 4 d后的盐地碱蓬叶中分别提取了质膜蛋
白，利用制备的多克隆抗体进行了Western blot分
析，结果见图 8：A，在高 K 样品的泳道中对应于
63．0 kD的位置几乎没有可见条带，原因可能是在
高 K 条件下 SsHKT1蛋白的表达量太低，在低 K
处理样品的泳道中出现较清晰的条带，说明低 K
处理后碱蓬叶中的蛋白表达量明显增加。
很多报道表 明 HKT类蛋 白与植物的耐盐性
有关，本 实 验 中 又进 一 步 分 析 了盐 胁 迫 条 件
(200 mmoL／L NaC1)下 SsHKT1蛋白水平表达量的
变化，结果见图 8：B。在0 mmoL／L NaC1样品的泳
道中，没有清晰条带，原因同上，在200 mmol／L NaC1
处理样品的泳道中也出现了较清晰条带，说明盐胁
迫处理后 SsHKT1蛋白表达量也明显提高。
2 l
0 粤
A
I 2
B
A：1．High K (1．2 retool／L K )；2．Low K (40~mol／L K )
B：1．0 retool／1 NaC1；2．200 mmol／L NaC1
图 8 盐地碱蓬 K 饥饿(A)及盐胁迫(B)条件下
叶质膜 SsHKT1聋白Western blot分析
Fig．8 Western blot analysis of S．salsa L．1eaves plasma
membrane SsHKT1 under K starvation(A)
and salt stress(B)
3 讨论
越来越多的研究表明，HKT类蛋白在植物 K 、
Na 吸收及耐盐性 中有重要作用，但不同植物中
HKT类蛋白功能有所不同，在盐生植物与非盐生植
物中的功能差别可能更大 。目前，HKT类蛋白的
研究主要来源于小麦和拟南芥等非盐生植物，盐生
植物 HKT类蛋白只在冰叶日中花中报道，而且此类
蛋白的抗体更少，除了在冰叶日中花中制备了其抗
体I1引，其他植物中未见报道。但冰叶日中花为兼性
CAM植物，并且在盐处理下产生大量盐囊泡，盐地
碱蓬为高度耐盐的积盐型盐生植物，没有盐腺等结
构，是一种研究植物耐盐机理很好的材料，SsHKT1
蛋白基因克隆自盐地碱蓬，具有较高特异性的SsH—
KT1多克隆抗体的获得将为此蛋白的特性及功能的
深入研究奠定良好的基础，具有重要的意义。
SsHKT1蛋 白是跨膜 蛋 白，靠 近 N一末 端 的
A135—204区段是亲水区且与其它植物的同源性较
低，因此选择此区进行原核表达并制备抗体能保证
较高的特异性，是可行的。我们利用 PCR方法得到
了SsHKT1片段，在 pGEX-6p-3原核表达系统中进
行了表达，对诱导条件如 IPTG的加量、诱导的温度
及时问等进行了摸索，获得了较为理想的结果，得到
了稳定高效的融合表达。
用原核细胞表达的基因工程产物普遍存在包涵
体的问题，即表达的蛋 白质分子不能正确折叠而相
互凝集形成不溶性的多肽聚集微粒——包涵体，但
包涵体产物并不影响用于制备高特异性的抗血清，
因为真核生物体内一般不存在大肠杆菌中的蛋白
质，因此做抗原用的大肠杆菌表达产物分离纯化的
要求较从真核生物体 内纯化抗原低得多。SDS—
PAGE分析表明，融合蛋白GST—SsHKT1主要以包涵
体形式存在。Marston等 ¨曾报道，离心后的包涵
体沉淀用 Triton X一100和EDTA洗涤，调整条件能使
包涵体中的外源蛋白的纯度达 90％以上，可直接用
作抗原 J。本实验中结合两种简单有效的包涵体
纯化方法经多次重复进行了条件优化，获得了较高
纯度的包涵体并制备了多克隆抗体，得到的抗体和
植物盐地碱蓬中提取的质膜样品经 Western blot分
析，在与 SsHKT1大小相符的位置出现了清晰条带，
表明得到的抗 GST—SsHKT1血清具有较高的特异
性，Western blot分析表明 SsHKT1可能主要存在于
质膜上，并进一步研究分析了 K 饥饿及盐胁迫条
件下 SsHKT1蛋白表达量的变化。
第一个高亲和 K 载体蛋白 HKT1的 eDNA是
从小麦根的eDNA文库中得到的 ¨，拟南芥中AtH-
KT1也主要在根中表达 J，据此，实验前期我们以盐
地碱蓬根作为基因克隆及 Westem blot分析的主要
材料，然而用 RT—PCR方法进行的基因表达分析数
据表明，SsHKT1在叶中的表达量明显高于根，且 K
饥饿及盐胁迫时 SsHKT1表达量明显上调(结果未
显示)，所以在检测离子对于 SsHKT1蛋白表达的影
响时采用了取材方便的叶作为材料，这也可能与盐
地碱蓬主要把盐积累在叶片中，而不是在根中有关。
已有的数据证明，SsHKT1在 mRNA水平上表
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第 4期 邵 群等：高亲和 K 转运载体 SsHKT1的抗体制备及表达分析 297
达量较低，推测其为一种低丰度蛋 白，已进行的
Northern blot分析难以得到清晰的信号(结果未显
示)，在 Westem blot分析中不经低钾或盐胁迫诱导
的对照样品中也难以出现清晰条带(与处理样品上
样量相同)。然而从 Western blot结果可以看出，K
饥饿条件下及盐胁迫时SsHKT1在蛋白水平表达量
都明显增加，这与基因表达分析的结果相符。K 饥
饿条件下表达量增加暗示着 SsHKT1可能在低 K
条件下参与 K 的吸收，在盐地碱蓬中可能是一种
高亲和 K 转运载体。实验证实，在低 K 条件下非
盐生植物 K 的积累随着盐浓度的增加而显著降
低，从而抑制植物的生长，而盐地碱蓬中 K 含量随
着盐浓度的增加并没有明显变化 ¨，且其生长未受
到抑制反而有所增加，说明在低 K 条件下盐地碱
蓬中存在着一种有效的 K 吸收系统，高盐条件对
此系统的表达具有诱导作用，使植物体尽可能多地
吸收 K ，以保持体内正常生长所需的 K 含量的稳
定，SsHKT1蛋白的表达受到盐胁迫上调的现象与上
述推论相一致，这也说明 SsHKT1在盐地碱蓬中可
能作为一种高亲合性的 K 转运载体起作用。
本研究从 SsHKT1蛋白表达分析人手，初步证
明了 SsHKT1在盐地碱蓬中可能作为一种高亲和性
的 K 吸收载体，并在高盐条件下对 K 营养有重要
作用。
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