全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(２): ２０３~２０９
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ２０２０３
枇杷幼果 ＰＬＤ和 ＬＯＸ对低温胁迫的响应
吴锦程∗ꎬ 吴毕莎ꎬ 黄审剑ꎬ 陈祠贤ꎬ 颜 亮ꎬ 许宏斌ꎬ 林建琼
(莆田学院环境与生物工程学院ꎬ 福建莆田 ３５１１００)
摘　 要: 以 ３年生枇杷品种‘早钟 ６ 号’ (Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ ‘Ｚａｏｚｈｏｎｇ Ｎｏ􀆰 ６’)容器嫁接苗为试材ꎬ 于 ０℃、
－１℃、 －３℃人工气候室内进行低温胁迫处理ꎬ 探讨枇杷幼果细胞膜磷脂及相关酶对低温胁迫的响应机制ꎮ 结果
显示ꎬ 在不同温度胁迫过程中ꎬ 枇杷幼果磷脂酶 Ｄ (ＰＬＤꎬ ＥＣ ３􀆰１􀆰４􀆰４)和脂氧合酶(ＬＯＸꎬ ＥＣ １􀆰１３􀆰１１􀆰１２)活性
均呈上升趋势ꎻ 质膜磷脂酰胆碱(ＰＣ)和磷脂酰肌醇(ＰＩ)含量因逐渐被降解而呈下降趋势ꎬ 磷脂酸(ＰＡ)含量出
现积累、 增加ꎬ 而膜结合 Ｃａ２＋含量有不同程度的降低ꎮ 随处理时间的延长和处理温度的降低ꎬ 枇杷幼果细胞
ＰＬＤ和 ＬＯＸ活性增幅加大ꎬ 从而加速了膜 ＰＣ和 ＰＩ的降解和 ＰＡ的积累ꎮ 低温胁迫过程中幼果细胞膜 ＰＣ 含量
的降幅大于 ＰＩꎬ 膜结合 Ｃａ２＋含量的变化与 ＰＬＤ 和 ＬＯＸ 活性变化呈负相关ꎮ 低温胁迫下枇杷幼果细胞膜结合
Ｃａ２＋含量的减少诱导了膜脂降解酶 ＰＬＤ和 ＬＯＸ活性的提高ꎬ 并导致膜结构稳定性下降ꎬ 加剧了低温胁迫对膜脂
的降解和脂质过氧化伤害ꎬ 其中尤以－３℃胁迫处理 ４ ~ ６ ｈ 对幼果细胞质膜的伤害最严重ꎮ 表明低温胁迫下
Ｃａ２＋􀅰ＣａＭ信使系统可能参与枇杷幼果细胞膜 ＰＬＤ和 ＬＯＸ活性的调控ꎮ
关键词: 枇杷ꎻ 低温胁迫ꎻ 磷脂酶 Ｄ(ＰＬＤ)ꎻ 脂氧合酶(ＬＯＸ)ꎻ 膜结合 Ｃａ２＋
中图分类号: Ｑ９４５􀆰７８ꎻ Ｓ６６７􀆰３　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０２￣０２０３￣０７
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０６￣１２ꎬ 退修日期: ２０１４￣０８￣１２ꎮ
　 基金项目: 福建省科技计划项目(２０１１Ｎ００２８)ꎻ 福建省高校服务海西建设重点项目(２００８ＨＸ０２)ꎮ
　 作者简介: 吴锦程(１９６５－)ꎬ 男ꎬ 教授ꎬ 研究方向为果树逆境生理ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ. Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｊｃ２３８４＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ ａｎｄ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ｙｏｕｎｇ Ｌｏｑｕａｔ Ｆｒｕｉｔｓ ｉｎ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｌｏｗ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｓｔｒｅｓｓ
ＷＵ Ｊｉｎ￣Ｃｈｅｎｇ∗ꎬ ＷＵ Ｂｉ￣Ｓｈａꎬ ＨＵＡＮＧ Ｓｈｅｎ￣Ｊｉａｎꎬ ＣＨＥＮ Ｃｉ￣Ｘｉａｎꎬ ＹＡＮ Ｌｉａｎｇꎬ
ＸＵ Ｈｏｎｇ￣Ｂｉｎꎬ ＬＩＮ Ｊｉａｎ￣Ｑｉｏｎｇ
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｐｕｔｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｐｕｔｉａｎꎬ Ｆｕｊｉａｎ ３５１１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ｇｒａｆｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ￣ｙｅａｒ￣ｏｌｄ ｌｏｑｕａｔ (Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ ‘Ｚａｏｚｈｏｎｇ
Ｎｏ􀆰 ６’) ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ０℃ꎬ －１℃ ａｎｄ －３℃ ｉｎ ｐｈｙｔｏｔｒｏｎ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ (ＰＬＤꎬ ＥＣ ３􀆰１􀆰４􀆰４)
ａｎｄ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ (ＬＯＸꎬ ＥＣ １􀆰１３􀆰１１􀆰１２) ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ. Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ (ＰＣ) ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ (ＰＩ)
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｄｕｅ ｔｏ ｇｒａｄｕａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ. Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ ( ＰＡ) ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄꎬ
ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅｅｓ. Ｗｉｔｈ
ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＬＤ ａｎｄ ＬＯＸ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄꎬ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ＰＣꎬ ＰＩ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＰＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ
ｉｎ ＰＣ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＩ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ ｕｎｄｅｒ
ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ. Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＬＤꎬ ＬＯＸ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ
ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｃｏｎｔｅｎｔｓ. Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＰＬＤ ａｎｄ ＬＯＸ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｃｏｎｔｅｎｔｓ. Ｍｅａｎｗｈｉｌｅꎬ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ￣
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｓｔａｂｌｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ ｗｈｉｃｈ
ａｇｇｒａｖａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄａｍａｇｅ ｄｕｅ ｔｏ ｌｉｐｉｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ
ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ｆｒｕｉｔｓ ｗａｓ ｍｏｓｔ ｓｅｒｉｏｕｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｔ －３℃ ｆｏｒ ４－
６ ｈ. Ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｃａ２＋􀅰ＣａＭ ｍａｙ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＰＬＤ ａｎｄ ＬＯＸ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ
ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｌｏｑｕａｔꎻ Ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓꎻ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ(ＰＬＤ)ꎻ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ(ＬＯＸ)ꎻ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａ２＋
　 　 枇杷(Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌｉｎｄｌ.)为典型的亚
热带果树ꎬ 低温是限制其生长、 产量和地理分布的
一个重要因素ꎮ 枇杷花蕾可耐受－６℃以下低温ꎬ
但幼果(尤其是种胚)对低温较为敏感ꎬ 在－３℃时
即受冻[１]ꎮ 福建和广东等省的山地枇杷产区在冬
季气温较低的年份幼果常遭受冻害ꎬ 而一年中气温
最低的 １２月到次年 １月恰逢枇杷早熟品种‘早钟 ６
号’(‘Ｚａｏｚｈｏｎｇ Ｎｏ􀆰 ６’)幼果的生长发育期ꎬ 幼果
受冻尤为严重ꎬ 在海拔相对较高的山地因枇杷幼果
受冻甚至颗粒无收[２]ꎮ 据不完全统计ꎬ ２００３ －
２００５年福建枇杷‘早钟 ６ 号’连续 ３ 年因遭受冻害
而减产 ３０％以上[１]ꎬ 枇杷幼果受冻问题十分突出ꎬ
低温严重威胁着枇杷的生产ꎮ
质膜是细胞感受环境胁迫较为敏感的细胞结
构ꎬ 磷脂是质膜的骨架成分ꎬ 磷脂酶 Ｄ (ＰＬＤꎬ ＥＣ
３􀆰１􀆰４􀆰４)是质膜磷脂水解的关键酶ꎮ 植物细胞在低
温胁迫下激活 ＰＬＤ 酶对质膜磷脂的降解ꎬ 由此产
生胞内磷脂酸(ＰＡ)和游离脂肪酸的大量积累ꎻ 脂
氧合酶(ＬＯＸꎬ ＥＣ １􀆰１３􀆰１１􀆰１２)进一步催化由 ＰＬＤ
酶降解膜磷脂所产生的游离不饱和脂肪酸生成活性
氧和氧自由基ꎬ 直接作用于膜磷脂中的结合态不饱
和脂肪酸ꎬ 导致膜磷脂双分子层结构的破坏[３ꎬ ４]ꎮ
许多研究已证明 ＰＬＤ酶在冷害中降解膜脂的作用ꎬ
ＰＬＤ活性与植物对低温胁迫的响应密切相关[５ꎬ ６]ꎮ
赵鹏等[７]研究认为低温逆境下拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ.)ＰＬＤ具有膜磷脂水解和信号转导的双
重功能ꎬ 参与拟南芥抗冻性的调控ꎮ 相关研究发
现ꎬ 冷胁迫诱导了不同植物细胞 ＰＬＤ 和 ＬＯＸ 等磷
脂降解酶活性的上升并启动对质膜的降解作
用[８－１０]ꎮ 低温胁迫诱导 ＬＯＸ 基因的表达并促发生
物膜的氧化也得到分子生物学方面相关研究的证
实[１１ꎬ １２]ꎮ 因此ꎬ ＰＬＤ和 ＬＯＸ在细胞膜磷脂代谢中
起重要的调控作用[１３－１５]ꎮ 有关低温胁迫下枇杷幼
果细胞 ＰＬＤ和 ＬＯＸ在膜磷脂代谢和信号传导中的
作用研究还未见报道ꎬ 本实验拟探索枇杷幼果磷脂
水解酶 ＰＬＤ和 ＬＯＸ对低温胁迫的响应ꎬ 旨在为枇
杷的抗寒性生理研究提供理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料处理
３年生枇杷早熟品种‘早钟 ６ 号’ (Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ
ｊａｐｏｎｉｃａ ‘Ｚａｏｚｈｏｎｇ Ｎｏ􀆰 ６’)容器嫁接苗由福建省
莆田市果树研究所提供ꎮ 选取生长正常、 长势一
致、 无病虫害、 无损伤的花后 ６０ ｄ 的容器嫁接苗
为试材(经常规疏果ꎬ 每穗留 ４~５个果)ꎻ 以 ２５℃
室温下培养的枇杷容器嫁接苗为对照(ＣＫ)ꎮ 将容
器嫁接苗分别置于 ０℃、 －１℃、 －３℃的人工气候室
(相对湿度为 ７０％ꎬ 光照时间为 ６ ∶ ３０~１８ ∶ ３０ꎬ 光
照强度为 ２０００ ｌｘ)中进行低温胁迫处理ꎮ ３ 个处理
分别经低温胁迫 １、 ２、 ４、 ６ ｈ 后于 ２５℃室温下平
衡 １２ ｈ后立即进行幼果混合取样ꎬ 每个处理 １０株ꎬ
３次重复ꎬ 每个重复共取 ２０个幼果组成混合样ꎬ 经
液氮速冻后保存于－７０℃冰箱ꎬ 待测相关指标ꎮ
１􀆰 ２　 测定方法
磷脂酶 Ｄ (ＰＬＤ)活性测定参照 Ｋｈａｔｏｏｎ等[１６]
的方法稍加修改ꎬ 以 １ ｍｉｎ 内 ＯＤ４９２ ｎｍ增加 ０􀆰 ０１
定义为一个酶活性单位 Ｕꎬ 结果以 Ｕ􀅰ｍｉｎ－１􀅰
ｍｇ－１蛋白表示ꎮ 脂氧合酶(ＬＯＸ)活性测定参照石
延霞等[１７]的方法ꎬ 以 １ ｍｉｎ内ＯＤ２３４ ｎｍ增加 ０􀆰 １定
义一个酶活力单位 Ｕꎬ 结果以 Ｕ􀅰ｍｉｎ－１􀅰ｇ－１ ＦＷ
表示ꎮ 参照 Ｙａｐａ等[１８]和 Ｍａｏ等[１９]的原子吸收分
光光度法检测膜结合 Ｃａ２＋含量ꎬ 膜结合 Ｃａ２＋含量
以 μｇ / ｇ ＦＷ表示ꎮ 膜磷脂含量参照杨文龙等[２０]的
ＨＰＬＣ 法测定ꎬ 结果以 μｇ / ｇ ＦＷ 表示ꎮ 蛋白质含
量采用考马斯亮蓝法进行测定ꎮ 以上各指标测定均
重复 ３次ꎮ
４０２ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
１􀆰 ３　 数据分析
采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３ 和 ＳＡＳ １２􀆰 ０ 统计
软件对数据进行差异显著性检验并作图ꎬ 数据均为
３次重复实验的平均值ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 低温胁迫对枇杷幼果磷脂酶 Ｄ (ＰＬＤ)活性的
影响
　 　 在低温环境下ꎬ ＰＬＤ 通过水解细胞质膜中的
磷脂改变膜脂组成而影响膜的结构、 功能和稳定
性ꎬ 在植物抗冻性方面发挥重要的调控作用[２１ꎬ２２]ꎮ
从图 １可见ꎬ 低温胁迫过程中枇杷幼果 ＰＬＤ 活性
呈上升趋势且高于 ＣＫꎻ 胁迫处理温度越低、 低温
持续时间越长幼果 ＰＬＤ活性上升越明显ꎮ ０℃低温
处理的幼果 ＰＬＤ活性虽高于 ＣＫꎬ 但差异并不显著
(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎮ －１℃处理 １~２ ｈ时幼果 ＰＬＤ活性与
ＣＫ无显著差异ꎬ 而低温处理 ４ ~ ６ ｈ 时幼果 ＰＬＤ
活性的上升明显高于 ＣＫ(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ －３℃处理的
幼果 ＰＬＤ 活性均始终高于 ＣＫ、 ０℃和－１℃处理ꎬ
且差异均达显著水平(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎬ 尤其是在－３℃
低温处理的后期(４~ ６ ｈ)幼果的 ＰＬＤ 活性是 ＣＫ、
０℃和－１℃处理的 １􀆰 ７倍以上ꎬ 差异达极显著水平
(Ｐ < ０􀆰 ０１)ꎮ 可见ꎬ 低温是诱导枇杷幼果 ＰＬＤ 活
性上升的主导因素ꎬ 而持续低温是导致 ＰＬＤ活性
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不同小写字母表示差异达显著水平(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ 下同ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ０􀆰 ０５
ｌｅｖｅｌ. Ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 １　 低温胁迫对枇杷幼果 ＰＬＤ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＰＬＤ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ
上升的重要因素之一ꎬ 本实验以－３℃低温胁迫 ４~
６ ｈ对幼果 ＰＬＤ活性的影响最大ꎮ
２􀆰 ２　 低温胁迫对枇杷幼果脂氧化酶(ＬＯＸ)活性的
影响
在衰老及逆境条件下ꎬ ＬＯＸ 酶促进植物细胞
膜脂质过氧化和自由基的产生ꎬ 导致磷脂双分子层
的破坏直至膜降解ꎬ ＬＯＸ 活性与植物抗寒性相
关[８ꎬ ２３]ꎮ 从图 ２可见ꎬ ３种低温胁迫处理过程中幼
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图 ２　 低温胁迫对枇杷幼果 ＬＯＸ活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＬＯＸ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ
果 ＬＯＸ活性均呈递增的变化趋势ꎬ 同时处理温度
越低幼果 ＬＯＸ 活性上升越明显ꎮ 当 ０℃处理幼果
１~ ２ ｈ 时幼果 ＬＯＸ 活性与 ＣＫ 相比无显著差异
(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎬ 但 ０℃处理 ４~ ６ ｈ时幼果 ＬＯＸ 活性
已显著高于 ＣＫ (Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ －１℃处理幼果 １ ｈ
时其 ＬＯＸ 活性与 ＣＫ 之间差异不显著ꎬ 而在－１℃
处理 ２~６ ｈ 时幼果 ＬＯＸ 活性已明显高于 ＣＫꎬ 差
异达显著水平(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ －３℃胁迫处理过程中
幼果 ＬＯＸ活性始终显著高于 ＣＫ、 ０℃和－１℃处理
(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎻ ０℃与－３℃处理 １~２ ｈ时两者幼果间
ＬＯＸ活性差异仅达显著水平(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎬ 而胁迫
处理 ４~ ６ ｈ时ꎬ 它们之间的 ＬＯＸ 活性差异达极显
著水平(Ｐ < ０􀆰 ０１)ꎮ 可见ꎬ 随着低温胁迫时间的
延长ꎬ －３℃与 ０℃处理的幼果间 ＬＯＸ 活性的差异
增大ꎮ ０℃与－１℃处理的幼果间 ＬＯＸ 活性差异并
不显著(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎮ 结果表明ꎬ ３种低温处理在一
定程度上均激活了细胞 ＬＯＸ 活性ꎬ 加剧了低温胁
５０２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 吴锦程等: 枇杷幼果 ＰＬＤ和 ＬＯＸ对低温胁迫的响应
迫下幼果膜脂的过氧化作用ꎮ
２􀆰 ３　 低温胁迫对枇杷幼果质膜磷脂酰胆碱(ＰＣ)、
磷脂酰肌醇(ＰＩ)和磷脂酸(ＰＡ)含量的影响
已有研究证实 ＰＡ 是 ＰＬＤ 水解膜磷脂的产物
之一ꎬ 膜磷脂如 ＰＣ和 ＰＩ等的消减以及 ＰＡ含量的
高低也就成为评判低温诱导质膜损伤程度的一个重
要指标[２４ꎬ ２５]ꎮ 本研究结果显示ꎬ 枇杷幼果在低温
胁迫过程中质膜 ＰＣ和 ＰＩ含量均呈下降趋势(图 ３:
Ａ、 Ｂ)ꎬ 经不同低温处理的幼果质膜 ＰＣ 和 ＰＩ 含
量变化趋势依次均为 ＣＫ > ０℃ > －１℃ > －３℃ꎮ 在
０℃和－１℃低温处理 １~ ４ ｈ 时质膜 ＰＣ 和 ＰＩ 含量
虽均低于 ＣＫꎬ 但差异不显著(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎬ 但－１℃
处理幼果 ６ ｈ时其质膜 ＰＣ含量显著低于 ＣＫ (Ｐ <
０􀆰 ０５)ꎬ 而 ＰＩ含量仍与 ＣＫ保持相近(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎮ
－３℃处理 １ ｈ的幼果质膜 ＰＣ含量低于 ＣＫ但差异
不显著(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎬ 在－３℃胁迫 ２ ~ ６ ｈ 时幼果
ＰＣ含量均显著低于 ＣＫ、 ０℃和－１℃处理 (Ｐ <
０􀆰 ０５)ꎮ －３℃处理 １~ ２ ｈ 的幼果质膜 ＰＩ 含量低于
ＣＫ但差异不显著(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎬ 在－３℃胁迫 ４ ~ ６ ｈ
时其 ＰＩ 含量显著低于 ＣＫ、 ０℃和－１℃处理(Ｐ <
０􀆰 ０５)ꎮ 可见ꎬ 低温胁迫可促进质膜 ＰＣ和 ＰＩ的降
解ꎬ 并随着低温胁迫时间的延长质膜 ＰＣ 和 ＰＩ 的
降解加速ꎮ 不同植物细胞 ＰＬＤ 酶存在特异性ꎬ 低
温胁迫过程中质膜 ＰＩ 含量下降的速度及幅度均不
及 ＰＣꎬ 低温胁迫主要诱导 ＰＬＤ酶对质膜 ＰＣ 的降
解ꎬ ＰＩ可能不是枇杷幼果 ＰＬＤ酶作用的主要底物ꎮ
与幼果细胞质膜 ＰＣ 和 ＰＩ 含量下降的变化趋
势相反ꎬ 枇杷幼果在低温胁迫过程中质膜 ＰＡ 含量
呈不同程度上升ꎬ ３ 种低温处理幼果质膜 ＰＡ 含量
从高到低依次为－３℃ > －１℃ > ０℃ > ＣＫ(图 ３:
Ｃ)ꎮ 经 ０℃处理的幼果质膜 ＰＡ含量波动较小并保
持相对稳定ꎻ 经－１℃处理的幼果质膜 ＰＡ含量呈平
缓上升ꎬ ０℃和－１℃处理与 ＣＫ 幼果质膜 ＰＡ 含量
相近ꎮ 经－３℃处理的幼果质膜 ＰＡ含量变化规律与
－１℃处理基本一致ꎬ 但其 ＰＡ含量上升的幅度大于
０℃和－１℃处理ꎻ 在－３℃胁迫前期(１~ ２ ｈ)幼果质
膜 ＰＡ含量虽高于 ＣＫ、 ０℃和－１℃处理ꎬ 但差异
不显著(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎬ 而在－３℃胁迫后期(４~ ６ ｈ)
其幼果 ＰＡ 含量均显著高于 ＣＫ、 ０℃和－１℃处理
(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ 这表明低温胁迫诱导了枇杷幼果质
膜 ＰＡ的积累ꎬ 较低的胁迫温度及长时间的胁迫有
利于幼果质膜 ＰＡ的生成ꎮ
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图 ３　 低温胁迫对枇杷幼果 ＰＣ、 ＰＩ、 ＰＡ和膜结合 Ｃａ２＋含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＰＣꎬ ＰＩꎬ ＰＡ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｌｏｑｕａｔ ｆｒｕｉｔｓ
６０２ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
２􀆰 ４　 低温胁迫对枇杷幼果细胞膜结合 Ｃａ２＋含量的
影响
Ｃａ２＋作为第二信使参与植物细胞许多重要生理
过程的调节ꎬ 细胞膜结合 Ｃａ２＋在维持膜的完整性
及调控膜的功能方面具有重要的作用[１８ꎬ ２６]ꎮ 实验
结果显示(图 ３: Ｄ)ꎬ 在低温胁迫过程中 ３ 种低温
处理的枇杷幼果细胞膜结合 Ｃａ２＋含量均呈下降趋
势ꎬ 但不同胁迫时间和温度下其膜结合 Ｃａ２＋含量
下降速度(或幅度)存在差异ꎬ 以－３℃处理的幼果
细胞膜结合 Ｃａ２＋含量下降速度(或幅度)最大ꎬ 膜
结合 Ｃａ２＋含量从大到小依次为 ＣＫ > ０℃ > －１℃ >
－３℃ꎮ 在低温胁迫 １~２ ｈ时ꎬ ０℃处理幼果细胞膜
结合 Ｃａ２＋含量与 ＣＫ 无显著差异(Ｐ > ０􀆰 ０５)ꎬ 而
在胁迫后期(４~ ６ ｈ)其膜结合 Ｃａ２＋含量明显低于
ＣＫꎬ 差异显著(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎻ 经－１℃和－３℃处理的
幼果细胞膜结合 Ｃａ２＋含量始终显著低于 ＣＫ (Ｐ <
０􀆰 ０５)ꎮ －３℃处理后期(４ ~ ６ ｈ)其幼果细胞膜结
合 Ｃａ２＋含量均显著低于 ０℃和 －１℃处理 ( Ｐ <
０􀆰 ０５)ꎮ 可见ꎬ 低温胁迫可导致细胞膜结合 Ｃａ２＋含
量不同程度降低ꎬ 且与 ＰＬＤ 和 ＬＯＸ 的活性变化呈
负相关ꎮ
３　 讨论
质膜是植物细胞与周围环境进行物质交换、 能
量和信息传递的界面和屏障ꎬ 能维护细胞内微环境
的相对稳定ꎬ 在维持细胞正常生理功能上具有重要
的作用[２７]ꎮ 低温胁迫直接导致膜结构的损伤ꎬ 而
质膜可能是低温伤害的初始部位[２８]ꎮ 一般认为低
温胁迫下植物细胞膜结构完整性的破坏和功能的受
损与活性氧的过量累积直接相关ꎬ 过量的活性氧增
强了膜脂过氧化作用或激活磷脂酶启动了膜磷脂的
脱酯化反应[２９ꎬ ３０]ꎮ ＰＬＤ 是催化对膜起稳定作用的
ＰＣ和 ＰＩ 磷脂水解的关键酶ꎬ ＰＬＤ 催化 ＰＣ 和 ＰＩ
水解生成 ＰＡꎬ 进而影响细胞膜的结构、 功能和稳
定性ꎮ Ｗｅｌｔｉ 等[２１]研究发现低温胁迫下 ＰＬＤ 酶通
过水解磷脂改变拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ.)
膜脂的组成而直接影响其抗冻性ꎮ Ｗｉｌｌｅｍｏｔ[３１]研
究认为小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ.) ＰＬＤ 活性因冻
害而被激活ꎬ ＰＬＤ 活性与小麦对冻害的响应密切
相关ꎮ 本实验研究发现ꎬ 低温胁迫激活了枇杷幼果
ＰＬＤ酶活性并催化膜磷脂 ＰＣ和 ＰＩ的降解以及 ＰＡ
的积累ꎬ 从而改变了膜脂质的组成ꎬ 不利于膜结构
完整性的保持并影响其抗冻性ꎮ 低温胁迫下枇杷幼
果 ＰＬＤ酶对 ＰＣ的水解程度明显超过对 ＰＩ的水解ꎬ
推测枇杷幼果 ＰＬＤ 酶的主要底物可能是 ＰＣ 而不
是 ＰＩꎬ 这还有待进一步研究证实ꎮ 枇杷幼果 ＰＬＤ
活性以及 ＰＣ、 ＰＩ 和 ＰＡ 含量的剧烈变化发生在
－３℃胁迫处理后期(４~ ６ ｈ)ꎬ 说明胁迫温度及持
续时间是导致枇杷幼果发生冻害的关键因素ꎮ
脂氧合酶(ＬＯＸ)可催化多元不饱和脂肪酸的
氧化代谢生成脂质过氧化自由基等物质ꎬ 激活膜脂
过氧化作用而加剧对膜结构的破坏[３２－３４]ꎮ Ｐｉｎｈｅｒｏ
等[８]研究认为抗寒性较强的玉米(Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ.)中
ＬＯＸ活性较低ꎬ 且 ＬＯＸ 活性与玉米的耐寒性密切
相关ꎮ 本实验表明低温胁迫诱导了枇杷幼果 ＬＯＸ
活性不同程度的上升ꎬ 加强了 ＬＯＸ 酶对质膜多元
不饱和脂肪酸的加氧反应ꎬ 生成的脂质过氧化自由
基进一步加剧了膜脂的过氧化作用并引起质膜结构
的损伤ꎮ 低温胁迫处理的时间越长ꎬ 枇杷幼果
ＬＯＸ活性上升愈加明显ꎻ 胁迫处理的温度越低ꎬ
ＬＯＸ活性上升幅度愈大ꎮ 相关研究表明ꎬ 质膜脂
肪酸不饱和度高的植物抗寒性强于脂肪酸不饱和度
低的植物[３５－３７]ꎮ 低温胁迫促进枇杷幼果 ＬＯＸ 对质
膜多元不饱和脂肪酸的氧化代谢也是幼果抵御冻害
能力逐渐丧失的一个重要原因ꎮ
膜结合 Ｃａ２＋对膜脂质具有保护作用ꎬ 可减轻
逆境胁迫对植物细胞膜的损伤并加强细胞壁结构ꎬ
Ｃａ２＋对膜脂结构的稳定、 防止膜损伤和保持膜完整
性方面发挥重要的作用[１８ꎬ ３８]ꎮ 相关研究表明ꎬ
Ｃａ２＋处理能明显缓解低温对茄子(Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎ￣
ｇｅｎａ Ｌ.)、 甜瓜(Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｌ.)、 水稻(Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｌ.)、 番茄(Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｌ.)等植
物的伤害[３９－４２]ꎮ Ｓａｎｇ 等[４３]研究发现 Ｃａ２＋抑制剂
ＥＧＴＡ 处理可导致拟南芥 ＰＬＤ 酶活性的丧失ꎮ
Ｃａ２＋能在较低的水平上激活 ＰＬＤꎬ Ｃａ２＋对 ＰＬＤ 酶
活性具有调控作用[８ꎬ ４４]ꎮ 细胞质基质中相对较高
的 Ｃａ２＋浓度会提高 ＬＯＸ酶的活性[８]ꎮ 本实验低温
胁迫过程中ꎬ 枇杷幼果细胞膜结合 Ｃａ２＋含量不断
降低ꎬ －３℃低温胁迫处理后期(４ ｈ 和 ６ ｈ)膜结合
Ｃａ２＋降幅最大ꎬ 这在一定程度上削弱了膜结合
７０２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 吴锦程等: 枇杷幼果 ＰＬＤ和 ＬＯＸ对低温胁迫的响应
Ｃａ２＋对脂质的保护能力并引起膜的损伤ꎮ 膜结合
Ｃａ２＋的释放以及低温诱导钙库渗出的 Ｃａ２＋会使细
胞质基质中 Ｃａ２＋含量增加ꎬ 激活细胞中 ＬＯＸ 酶的
活性ꎬ 加剧膜脂的降解和过氧化作用ꎬ 这与 Ｍａｏ
等[１９]在黄瓜(Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ.)冷害研究中得出
低温条件下膜结合 Ｃａ２＋含量的降低促进了 ＰＬＤ 和
ＬＯＸ活性上升的结果一致ꎮ
参照王慧等[４４]的方法对低温处理的枇杷幼果
进行解剖观察发现ꎬ ０℃低温处理 １~ ６ ｈ时幼果胚
和果肉正常ꎻ －１℃低温处理 １~ ４ ｈ 时幼果胚和果
肉正常ꎬ 处理 ６ ｈ 时幼果胚轻微变褐、 果肉正常ꎻ
－３℃低温处理 １~ ２ ｈ 时幼果胚轻微变褐至部分变
褐、 果肉正常ꎬ 处理 ４ ~ ６ ｈ 时幼果胚完全变褐、
果肉部分变褐ꎮ 不同低温处理之间幼果的生理响应
指标与形态解剖学观察的结果基本一致ꎮ 低温胁迫
激活了枇杷幼果细胞 ＰＬＤ 酶的活性ꎬ 促进了膜磷
脂 ＰＣ和 ＰＩ的降解以及 ＰＡ和游离不饱和脂肪酸的
积累ꎮ 游离不饱和脂肪酸进一步为 ＬＯＸ 酶提供底
物氧化生成活性氧和氧自由基并启动作用于膜结合
态不饱和脂肪酸的过氧化作用ꎬ 膜脂的脂肪酸不饱
和度降低与 ＰＬＤ 酶催化膜磷脂降解导致膜脂组分
的改变形成协同效应ꎬ 直至造成质膜功能紊乱和膜
的不可逆伤害ꎮ 膜中作为 Ｃａ２＋载体的 ＰＡ积累促进
了膜释放出 Ｃａ２＋并激活 ＰＬＤ 酶催化自身膜脂质的
降解ꎬ 膜结合 Ｃａ２＋的释放也降低了膜结构的稳定
性而易受伤害ꎮ Ｃａ２＋􀅰ＣａＭ 信使系统可能参与枇
杷幼果细胞 ＰＬＤ和 ＬＯＸ活性的调控而对低温胁迫
产生响应ꎮ
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(责任编辑: 张 平)
９０２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 吴锦程等: 枇杷幼果 ＰＬＤ和 ＬＯＸ对低温胁迫的响应