全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (4) : 311～ 316
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
NAD PH 氧化酶可能参与了 ABA 诱导
蚕豆气孔保卫细胞运动
苗雨晨　董发才　宋纯鹏Ξ
(河南大学生物学系, 开封　475001)
摘　要: 研究了NAD PH 氧化酶在ABA (abscisic acid)诱导蚕豆气孔关闭信号转导网络中的
作用, 荧光光谱实验表明, 在嗜中性白血球 NAD PH 氧化酶抑制剂 D P I (diphenyleneio2
donium ) 存在的条件下, 与对照相比, 大大逆转了由ABA 引起 H PT S (82hydroxypyrene21, 3,
62t risu lfon ic acid, trisodium salt)的荧光强度下降。表皮生物分析法显示, 10- 6 mo löL 的D P I
和 103 unitömL 的过氧化氢酶 (cata lase, CA T ) 在一定程度上也逆转了ABA 诱导张开气孔的
关闭。因此推测: 在ABA 诱导蚕豆气孔保卫细胞过程中, 质膜上的NAD PH 氧化酶可能催化
形成超氧自由基O 2
Η
, 再经歧化反应形成 H 2O 2, 而形成的H 2O 2 参与了气孔运动调节。
关键词: 蚕豆; 保卫细胞; ABA ; H 2O 2; NAD PH 氧化酶; 气孔运动
　　中图分类号: Q 945　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0420311206
The NAD PH Ox idase Is L ikely Involved in ABA - Induced
Stomata l Guard Cell M ovem en t in V icia f aba
M IAO Yu2Chen, DON G Fa2Cai, SON G Chun2Peng
(D ep artm en t of B iology , H enan U niversity , Kaifeng　475001, Ch ina)
Abstract: T he m echan ism s of H 2O 2 genera t ion in guard cells of V icia f aba
induced by ab scisic acid (ABA ) w ere m easu red by u sing fluo rescene p robe,
82hydroxypyrene21, 3, 62t risu lfon ic acid, t risodium salt (H PT S). W hen guard
cells w ere trea ted w ith ABA , fluo rescene quench ing of H PT S occu rred, and
the trea tm en t of the guard cells w ith diphenyleneiodon ium ( D P I ) a t
10- 6 mo lömL (final concen tra t ion) w h ich is know n as an inh ib ito r of supero2
x ide2genera t ing NAD PH ox idases nearly reversed the quench ing react ion
induced by ABA 012 mmo löL ( final concen tra t ion ). ABA and H 2O 2 m igh t
induce stom ata l clo su re. Fu rthermo re, w hen D P I o r cata lase ( CA T )Ξ 收稿日期: 2000211201, 修回日期: 2001201212。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (编号: 39870372)。作者简介: 苗雨晨 (1970- ) , 男, 硕士, 从事植物生理及分子生物学研究。通讯联系人: (E2m ail: songcp@public. kfp tt. ha. cn)。
( 103 un itömL ) w as added to the su spen sion after above trea tm en t reversed
ABA 2induced stom ata l clo su re. T hese resu lts suggest tha t a novel O 2 Ηgenera t2
ing NAD PH ox idase in the p lasm a m em b rane of guard cell of V icia f aba m ay
be act iva ted by ABA , and sub sequen t ly H 2O 2, w h ich invo lved in the signal
t ran sduct ion pathw ay of ABA 2induced stom ata l clo su re.
Key words: V icia f aba; Guard cells; ABA ; H 2O 2; NAD PH ox idase; Stom ata l
movem en t
植物细胞在正常的生理代谢过程中都会产生活性氧 (act ive ox idat ive species,AO S) ,
包括H 2O 2, 尤其在外界环境胁迫条件下会有大量的AO S 产生。H 2O 2 作用于许多生物分
子, 调节细胞不同的生理功能, 同时也激活了防御和解毒相关基因的表达, 如过氧化氢酶
(CA T )、过氧化物酶 (POD ) , 抗坏血酸过氧化物酶 (A PX)、谷光甘肽2S2转移酶 (GST )、热
激蛋白 (H SP s)等, 使植物体产生了一定的防卫反应[1 3 ]。对于H 2O 2 产生的分子机制及其
作用位点目前仍有争议, 多数报道[4 ]认为, 其主要发生于胞外, 由质膜氧化还原系统产生。
细胞质膜成分的O 2
Η
生成依赖于NAD PH 的存在, 铁蛋白的阻碍剂D P I (d iphenylene
iodon ium )能抑制嗜中性白血球NAD PH 氧化酶的活性, 同样能抑制激发子 (elicito r)诱导
的大豆 H 2O 2 积累, 或酵母激发子诱导的 H 2O 2 的生成[5, 6 ]; 转钙调素 (CaM ) 的烟草有
NAD PH 的积累, 导致更强大的AO S 迸发 (bu rst) , 这说明植物的AO S 生成与NAD PH
氧化酶有关[7 ]。另外植物细胞壁中的过氧化物酶和叶绿体PSÉ 也可能与H 2O 2 产生有关。
关于H 2O 2 的信号转导机制目前有大量的研究工作正在进行。据 Kovtun 等[8 ]报道, H 2O 2
触发了促分裂原活化蛋白激酶 (M A PK) 引起的级联反应。他用外源的H 2O 2 处理拟南芥
叶肉原生质体, 发现激活了与烟草细胞蛋白激酶 (N PK) 相似的拟南芥蛋白激酶 (AN P) ,
然后激活M A PK的上游因子, 触发了M A PK级联的信号传递, 最终导致GST基因的表达。
水分胁迫下, 叶片ABA (ab scisic acid) 含量升高, 可有效地抑制气孔开放或导致气孔
关闭, 在植物生长和发育过程中起重要调节作用。ABA 信号刺激, 可导致胞内Ca2+ 、1, 4,
52三磷酸肌醇 ( IP 3)、二酰基甘油 (D G)、pH 值及膜上的 K+ 通道的变化最终导致气孔运
动[9, 10 ]。我们已证明了ABA 可以诱导蚕豆气孔保卫细胞产生H 2O 2, 并且H 2O 2 的产生与
ABA 的浓度呈正相关[11 ]。据报道[12 ] , ABA 可以诱导玉米CA T 1 的基因表达, H 2O 2 可能
是ABA 诱导气孔关闭信号转导链的中间成分。最近, Pei 等[13 ]以野生型和ABA 缺失突变
体拟南芥同样研究了ABA 诱导保卫细胞H 2O 2 的产生, 并且H 2O 2 激活了Ca2+ 通道, 促
使气孔关闭。为进一步研究ABA 诱导蚕豆气孔保卫细胞产生H 2O 2 可能的机理, 我们以
蚕豆叶片下表皮为材料, 研究NAD PH 氧化酶作为催化形成O 2
Η
的关键酶, 可能参与了
ABA 诱导保卫细胞产生H 2O 2, 以及H 2O 2、CA T、D P I对气孔运动调节的不同影响。
1　材料和方法
1. 1　材料与试剂
蚕豆 (V icia f aba L. )种子清洗消毒后浸种 24 h, 25℃催芽 2～ 3 d, 然后播种于较肥沃
的营养土中。幼苗生长期间每天浇水 1 次, 光暗周期为 14 hö10 h, 温度为 18～ 25℃, 光照
强度为 300 Λmo lõm - 2õs- 1, 相对湿度为 80%。幼苗长至 3～ 4 周时取顶部第 2 节的叶片作
213 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
为实验材料。化学试剂ABA、CA T、D P I、M ES〔22(N 2mo rpho lino ) ethane2su lfon ic acid〕为
美国 Sigm a 公司产品, H PT S为美国M o lecu lar p robes公司产品, 其余试剂为国产分析纯。
1. 2　表皮的剥离
取顶端第 2 节生长良好的叶片, 用镊子撕取其下表皮 (表皮尽可能撕成长 1～
115 cm , 宽 015 cm 且避开叶脉) , 然后置于表皮缓冲液中, 缓冲液含有 10 mo löL 的M ES、
50 mmo löL 的 KC l, pH 为 615。
1. 3　表皮 HPTS 荧光的观测
参照L ow 的方法[14 ]。取一片表皮置于室温下预处理 2～ 3 h, 使表皮细胞活性降低,
然后在 012 m gömL 的 H PT S 荧光染料溶液中温育。15～ 20 m in 后用缓冲液漂洗 1～ 2
次, 用硅胶把表皮固定在石英片上, 放入盛有 115 mL 缓冲液的比色杯中, 并迅速转移到
荧光光谱仪 (Spex F212 F luo ro log) 的暗室内。激发光波长为 405 nm , 荧光发射波长为
512 nm , 记录处理后的表皮随时间变化的相对荧光值。每个实验重复 3～ 6 次, 取其中的
一个图谱进行分析。
1. 4　表皮气孔开度的观测
置于缓冲液的表皮充分光照 2 h (置于无水Ca2CO 3 环境中, 以避免CO 2 的影响) , 使
时间 ( s)　T im e
　A. H 2O 2 (10 Λmo löL at final concen tration ) ;
　B. ABA (0. 2 mmo löL ) ;
　C. ABA (0. 2 mmo löL ) and D P I (10- 6 mo löL )
图　1　D P I处理表皮组织对ABA
　引起 HPTS 荧光猝灭的影响
　F ig11　Effects of D P I on ABA 2induced fluo rescence
　 quench ing of H PT S in ep iderm al stripe
　
　
　
其完全张开, 作为对照。然后用 ABA、
H 2O 2、抗坏血酸 (V c)、D P I、CA T 等不同溶
液处理气孔张开的表皮, 再置于光照培养
箱中, 每隔 1 h 在显微镜 (N ikon T E 300)
下观察气孔开度, 连续观察 4～ 5 次, 用测
微尺测量气孔开度孔径大小, 并照相记录。
选择 4 个不同的视野, 最后计算平均值和
方差。每个实验重复 3～ 5 次。
2　结果与分析
2. 1　外加 H2O 2、ABA 和D P I 对 HPTS 荧
光的影响
在过氧化物酶的中介下, H 2O 2 可以使
H PT S 荧光猝灭。从图 1: A 可见, 经H PT S
温育过的表皮加入 10 ΛL 的缓冲液几分钟
后荧光没有变化, 再加入 10 ΛL 10- 4 mo löL
的 H 2O 2 其荧光强度大大降低。图 1: B 表
明, 10 ΛL 的ABA 可以引起荧光猝灭, 并且
从图 1: C 来看,ABA 和D P I 共同处理时荧
光强度只有瞬时的降低, 相对荧光强度分
析显示, 其降低幅度远远低于 H 2O 2 和
ABA , 继而又处于相对稳定状态。因此,
D P I 可以逆转ABA 引起荧光强度的继续
313　第 4 期　　　　　苗雨晨等:NAD PH 氧化酶可能参与了ABA 诱导蚕豆气孔保卫细胞运动
下降, 这也说明D P I可能抑制了NAD PH 氧化酶的活性, 最终阻止H 2O 2 继续产生。
2. 2　H2O 2、Vc、CAT 和D P I对ABA 诱导气孔关闭的影响
H 2O 2 可有效地抑制气孔开放或导致气孔关闭。图 2、3 和图版É:B 表明, 一定浓度的
H 2O 2 对张开气孔的关闭有不同的影响, 并与其浓度呈正相关; 与对照相比, 10- 6 mo löL 的
H 2O 2 对气孔关闭影响最小; 高剂量的H 2O 2 对细胞产生毒害作用, 致使细胞活性降低 (数
据没有表明)。V c 是一种抗氧化剂, 存在于叶绿体膜上, 可清除AO S, 维持膜的氧化还原
状态。10- 4 mo löL 的V c 和H 2O 2 共同处理表皮时, 可逆转由H 2O 2 引起气孔的继续关闭
(图 3, 图版É: C)。外源的ABA 可以促进张开气孔的关闭 (图版É: A、D ) , 而CA T 可以清
除保卫细胞内产生的H 2O 2,D P I 可以抑制NAD PH 氧化酶继续产生H 2O 2。从图 4、5 结果
时间 (h)　T im e
图 2　 H2O 2 对张开气孔关闭的影响
(浓度单位: mo lömL )
F ig12　Effects of H 2O 2 on stom atal clo su re
　
　
时间 (h)　T im e
图 3　Vc 对 H2O 2 诱导气孔关闭的影响
(浓度单位: mo lömL )
F ig13　Effects of V c on H 2O 22induced
stom atal clo su re
　
时间 (h)　T im e
图 4　CAT 和D P I对ABA 诱导气孔关闭的影响
F ig14　Effects of CA T and D P I on ABA 2induced
stom atal clo su re
　
　
　
时间 (h)　T im e
图 5　H2O 2 对CAT 和D P I存在时的ABA 诱导
气孔关闭的影响
F ig15　Effects of H 2O 2 on CA T and D P I p resence
ABA 2induced stom atal clo su re
　
　F ig. 2, 3, 4, 5 N o tes: F resh ly p repared ep iderm is w as incu lated in CO 22free KC l2M ES fo r 2 h under conditions p romo t2
ing stomo tal open ing and then transferred to fresh CO 22free KC l2M ES contain ing H 2O 2, V c, ABA , CA T , D P I respec2
t ively. Stom atal apertu res w ere determ ined at 1, 2, 3, 4 h incubation, respectively, values are the m eans of 120 m ea2
su rem en ts±SE values.
413 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
来看, 10- 5 mo löL ABA 对气孔关闭影响较大, 而继续加 CA T 103 un itömL 和 D P I
10- 6 mo löL 都不同程度地逆转了这种效应 (图版É: D、E、F)。因此, 在NAD PH 氧化酶催
化下形成的H 2O 2 可能参与了ABA 诱导气孔关闭的过程。
3　讨论
已知质膜电子传递系统或质膜氧化还原系统 (P lasm a m em b rane redox system ,
PM R S) 普遍存在于原核生物及所有动植物体内, 产生O 2
Η
的NAD PH 氧化酶即是 PM R S
的一个重要成分[15 ]。动物免疫细胞产生的呼吸迸发 (resp ira to ry bu rst)是一个研究比较透
彻的系统, 在植物中也存在着与动物呼吸迸发极相似的AO S 迸发机制。我们用荧光光谱
分析的方法, 获得了ABA 诱导蚕豆气孔保卫细胞产生H 2O 2 的可能机理。外加NAD PH
氧化酶的阻碍剂D P I, 可逆转由ABA 引起H PT S 荧光强度的继续下降 (图 1)。因此,ABA
诱导气孔关闭的过程中, 质膜上的NAD PH 可能是直接的电子供体, 在NAD PH 氧化酶
的作用下与氧反应生成O 2
Η
, 经过歧化反应形成的H 2O 2 参与了气孔运动。从图 1 荧光强度
分析, D P I 抑制了一定量的H 2O 2 的产生, 说明NAD PH 氧化酶可能是H 2O 2 产生的关键
酶, 但也存在不依赖NAD PH 氧化酶的产生途径。已知植物激素脱落酸可以转导多种信
号途径[16 ] , 而H 2O 2 作为信使分子越来越多地被人们所关注[17, 18 ]。因此, 由NAD PH 氧化
酶产生的H 2O 2 诱导气孔关闭可能是ABA 诱导气孔信号转导网络中的一条主要转导链。
另外, 在植物与病原菌互作过程中产生H 2O 2 已有大量报道, 并且产生的机制多与
NAD PH 氧化酶有关[19, 20 ]; A llan 等[21 ]利用 H 2O 2 的荧光探针乙酰乙酸盐22, 72二氯氢化
荧光素 (2, 72dich lo rofluo rescin diaceta te, H 2DCFDA ) 并结合激光共聚焦扫描显微镜技
术研究发现, 氨基酸及多胺类激发子刺激所产生的AO S 对外施的CA T 敏感; 而 cryp to2
gein 刺激产生的AO S 对CA T 不敏感。表明氨基酸及多胺类激发子是作用于细胞壁过氧
化物酶 (POD ) ; cryp togein 是作用于质膜NAD PH 氧化酶, 并且表皮细胞所产生的H 2O 2
可通过质外体途径进入保卫细胞, 我们的研究与A llan 等[21 ]有较大的类似性, 也为进一步
研究 H 2O 2 在植物细胞的信号转导机制以及相关基因水平上的转录提供了更多的可能
性。
ABA 信号刺激, 可有效地抑制气孔开放或导致气孔关闭, 但对其信号转导机制还不
清楚。多数认为[22, 23 ] , Ca2+ 和H + 很可能作为细胞内的第二信使参与ABA 对气孔和质膜
通道的调节。另外 IP 3 是引起胞内Ca2+ 动员的中介物, 当用ABA 处理 10 s 后, 可发现 IP 3
含量增加 1 倍, 并引起胞内Ca2+ 水平升高[24 ]。最近, 安国勇等[25 ]发现, H 2O 2 促进蚕豆气孔
关闭主要是通过抑制K+ 通过保卫细胞质膜内向流入, 或加强K+ 外向流出实现的。因此,
H 2O 2 成为ABA 诱导蚕豆气孔关闭信号转导链的一个中间成分, 将被越来越多的人们所
证实。表皮气孔生物学分析表明, 在CA T 和D P I存在的条件下, 可大大逆转由ABA 诱导
的气孔关闭, 并且逆转程度与其浓度呈正相关 (图 2、3、4、5, 图版É ) , 进一步暗示了
NAD PH 氧化酶在ABA 诱导气孔关闭中起了重要调节作用。因此, 我们的实验结果将为
研究ABA 诱导气孔关闭中的信号转导网络提供相关依据。目前, 我们正利用反转录PCR
分子生物学手段对上述问题进行研究, 将有可能获得NAD PH 氧化酶参与形成H 2O 2 的
直接证据。
513　第 4 期　　　　　苗雨晨等:NAD PH 氧化酶可能参与了ABA 诱导蚕豆气孔保卫细胞运动
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