全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (6) : 449～ 452
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
秋水仙素诱导川贝母 (F r itilla r ia cir rhosa D. D on )
愈伤组织多倍体的研究Ξ
王　强　兰利琼　傅华龙ΞΞ
(四川大学生命科学学院, 成都　610064)
摘　要: 应用组织培养技术对川贝母 (F ritilla ria cirrhosa D. Don)进行多倍体诱导。结果表明: 组织培养条件下, 将
川贝母愈伤组织在培养基中添加一定浓度的秋水仙素处理一段时间, 或者经一定浓度的秋水仙素浸泡一段时间后
再培养, 均可诱发川贝母多倍体的产生, 但以前者效果较好, 在秋水仙素浓度为 1 000 m göL , 处理 5 d 的条件下, 诱
导率最高达 70%。细胞染色体鉴定结果为: 四倍体染色体数为 2n= 4x = 48, 而二倍体的染色体数为 2n= 2x = 24。
关键词: 川贝母; 秋水仙素; 多倍体
　　中图分类号: Q 943　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0620449204
Induction of Polyplo id from Colch ic ine-Treated
F r itilla r ia cir rhosa D. D on Callus
W AN G Q iang, LAN L i2Q iong, FU H ua2L ongΞΞ
(S chool of L if e S cience, S ichuan U n iversity , Chengdu　610064, Ch ina)
Abstract: T he callu s of F ritilla ria cirrhosa D. Don w as ob ta ined by p lacing the bu lb on M S m edi2
um supp lem en ted w ith 2 m göL 62BA and 1 m göL NAA and 500 m göL CH , and the callu s w as
trea ted to get po lyp lo id w ith co lch icine. T he resu lt show ed that po lyp lo id callu s w as ob ta ined by
adding co lch icine in to the m edium o r by co lch icine soak ing. T he fo rm er m ethod w as bet ter than
the la ter one. T he best resu lt fo r inducing tet rap lo id w as by adding co lch icine 1 000 m göL in to the
m edium treated fo r 5 days, the inducing ra te w as up to 70%. T he ch romo som e num ber of the te2
t rap lo id w as 2n= 4x = 48, w h ile that of d ip lo id w as 2n= 2x = 24.
Key words: F ritilla ria cirrhosa D. Don; Co lch icine; Po lyp lo id
　　川贝母 (F ritilla ria cirrhosa D. Don) 为百合科
贝母属的一种多年生草本植物, 其鳞茎具有清热润
肺、化痰止咳的功效, 用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚
劳嗽、咯痰带血等症[1 ]。川贝母主要用鳞茎进行营养
繁殖, 但由于生长期长, 且近年来对野生川贝母过度
采挖, 野生资源已锐减[2, 3 ]。人工栽培的川贝母又存
在着繁殖系数低、生长周期长、品系退化的问题, 因
此利用组织培养技术探求川贝母新资源的研究越来
越受到人们的重视[2 5 ]。一般栽培和组培中的川贝
母都是二倍体, 多倍体的诱导育种研究还未见报道。
据陈柏君等[6 ]报道, 多倍体植物由于染色体加倍, 往
往具有根茎叶的巨大性, 即根茎叶的产量较高, 能较
好地满足药材生产的要求; 另一方面, 植物染色体倍
性的变化也往往会导致次生代谢产物含量的变化,
这就有可能获得有效成分含量高的药用植物。笔者
使用秋水仙素处理川贝母愈伤组织并诱导多倍体,ΞΞΞ 通讯作者。收稿日期: 2002203223, 修回日期: 2002207226。基金项目: 四川省科技厅应用基础项目。　　　作者简介: 王强 (1979- ) , 男, 硕士研究生, 主要从事中草药的组织培养和生理生化的研究。
以期为以后进一步进行川贝母多倍体的研究打下基
础。
1　材料与方法
1. 1　材料
实验用的川贝母无菌鳞茎由四川大学藻类学实
验室提供, 为继代培养 6 次的材料。原始外植体取自
四川省阿坝州若尔盖地区。
1. 2　方法
1. 2. 1　愈伤组织的诱导
将川贝母无菌鳞茎切成 015 cm ×015 cm ×
015 cm 的小块, 接种到愈伤组织诱导培养基M S+
62BA 2 m göL + NAA 1 m göL + CH 500 m göL + 蔗
糖 30 göL 中, 培养温度 (20±2)℃, 暗培养。15 d 左
右, 切口开始膨大, 有淡黄色愈伤组织产生。
1. 2. 2　秋水仙素处理
(1) 秋水仙素加入培养基处理法　将淡黄色愈
伤组织切成 015 cm ×015 cm ×015 cm 的小块, 转入
含 有 秋 水 仙 素 浓 度 分 别 为 100、500、1 000、
2 000 m göL 的愈伤组织诱导培养基中, 处理分别为
1、5、10 d, 处理完毕后转入不含秋水仙素的分化培
养基M S+ 62BA 2 m göL + NAA 2 m göL 中进行分
化培养。
(2) 秋水仙素溶液浸泡处理法　将秋水仙素配
成 100、500、1 000、2 000 m göL 的溶液, 将愈伤组织
切成 0. 5 cm 3 的小块, 在上述溶液中浸泡 24、48、
72 h后取出, 无菌水冲洗 3 次, 转入不含秋水仙素的
分化培养基M S+ 62BA 2 m göL + NAA 2 m göL 中
进行分化培养。
1. 2. 3　细胞倍性鉴定和诱导率的统计
将上述 (1)和 (2)中在不含秋水仙素的愈伤组织
诱导培养基中培养了 5 d 的愈伤组织取出, 用
01002 mo löL 的 82羟基喹啉预处理 2 h, 再用卡诺氏
固定液 (乙醇÷冰乙酸= 3÷ 1) 室温下固定过夜, 经双
蒸水洗涤后, 在 215% 纤维素酶和果胶酶的混合液
中 37℃酶解 115 h, 双蒸水洗净后用改良苯酚品红
染色 30 m in, 压片, O lympu s BH 22 显微镜镜检、拍
照。随机统计 200 个分裂相细胞, 统计其中的四倍体
细胞个数, 诱导率= 四倍体细胞个数ö200×100%。
2　结果与分析
经细胞染色体鉴定表明, 采用秋水仙素加入培
养基处理法和秋水仙素溶液浸泡处理法都可获得一
定频率的多倍体细胞。四倍体细胞染色体数为 2n=
4x = 48 (图 1) , 而二倍体细胞染色体数为 2n= 2x =
24 (图 2)。在未处理和处理后的愈伤组织的倍性观
察中均发现有非整倍体的细胞, 但数量极少, 未做统
计; 另外在 1 000 m göL 和 2 000 m göL 的长时间
(5～ 10 d)处理组合中发现有少量八倍体细胞。处理
后的愈伤组织在分化培养基上培养 5～ 10 d 后开始
恢复生长, 但是和未处理的相比, 分化迟缓, 进一步
的筛选工作正在进行中。
图 1　川贝母二倍体染色体 (2n= 2x = 24)
F ig11　T he ch romo som es of dip lo id of
F ritilla ria cirrhosa D. Don (2n= 4x = 48)
图 2　川贝母四倍体染色体 (2n= 4x = 48)
F ig12　T he ch romo som e of tetrap lo id of
F ritilla ria cirrhosa D. Don (2n= 2x = 24)
2. 1　秋水仙素加入培养基处理法对愈伤组织细胞
多倍体的诱导
通过显微镜观察和多倍体细胞统计, 其结果见
表 1。从表 1 可见, 培养基中添加不同浓度的秋水仙
素和处理不同的时间对川贝母四倍体的诱导均有一
定的效果, 其中用 500 m göL 处理 10 d、1 000 m göL
处理 5～ 10 d、2 000 m göL 处理 5 d, 这几个组合均
能得到较高的诱导率, 而以 1 000 m göL 处理 5d 的
效果最好, 诱导率可达 70%。
2. 1. 1　秋水仙素浓度对加倍效果的影响
本 实 验 证 明, 在 秋 水 仙 素 浓 度 为 100～
1 000 m göL 的范围内, 诱导率随诱导剂量的升高而
增加, 当秋水仙素浓度超过 2 000 m göL 时, 诱导率
054 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　　
反而有所下降。而且随着秋水仙素浓度的增加, 对细
胞的伤害也增大, 愈伤组织的受害率也增加。
2. 1. 2　处理时间对加倍效果的影响
从表 1 中可以看出, 秋水仙素浓度在 100～
500 m göL 的时候, 随着处理时间的延长, 诱导率逐
渐升高, 但是秋水仙素浓度在 1 000～ 2 000 m göL
的时候, 随着处理时间的延长, 诱导率反而降低。因
此, 在低浓度的秋水仙素的处理下, 由于对愈伤组织
的伤害并不严重, 所以诱导率逐渐升高, 而在高浓度
的秋水仙素的处理下, 愈伤组织受害严重, 时间的延
长更加剧了这种伤害度, 从而导致了诱导率的降低。
从 2. 1. 1 和 2. 1. 2 的分析可以得出以下结论:
秋水仙素的浓度和处理时间的变化都对川贝母多倍
体的诱导有着较为明显的影响 (见图 3) , 但由于高
浓度的秋水仙素和长时间的处理都会对川贝母愈伤
组织块有着明显的伤害作用, 所以用 1 000 m göL 的
秋水仙素处理 5 d 的组合最好, 既能得到最高的诱
导率, 又不至于对愈伤组织块产生严重的伤害。
表 1　秋水仙素加入培养基处理法对川贝母愈伤组织多倍体诱导的影响
T able 1　T he effects of adding co lch icine in m edium on inducing po lyp lo id of F ritilla ria cirrhosa D. Don
处理浓度 (m göL )
T reatm ent
concen tra t ion
处理时间 (d)
T reatm ent
t im e
处理愈伤组织
N um bers of
treated callus
受害愈伤组织
N um bers of
in ju ried callus
四倍体细胞
N um bers of
tetrap lo id cell
诱导率 (% )
Inducing
ratio
100 1 30 0 36 18
100 5 30 0 58 29
100 10 30 2 80 40
500 1 30 1 70 35
500 5 30 3 96 48
500 10 30 4 126 63
1 000 1 30 2 100 50
1 000 5 30 5 140 70
1 000 10 30 8 130 65
2 000 1 30 7 98 49
2 000 5 30 11 120 60
2 000 10 30 15 112 56
　　　0 (Contro l) 0 30 0 0 0
图 3　秋水仙素加入培养基处理法对加倍效果的影响
F ig13　T he effect of m edium w ith co lch icine on doubling rate
　
2. 2　秋水仙素溶液浸泡处理法对愈伤组织细胞多
倍体的诱导
秋水仙素溶液浸泡处理法也可以得到一定频率
的多倍体细胞 (表 2) , 多倍体出现的频率随处理浓
度的升高和处理时间的延长而增加, 但诱导率较秋
水 仙素加入培养基处理法低。以处理浓度为
1 000 m göL、处理时间 24 h 的组合的效果最好, 能 够得到 47% 的诱导率, 继续升高浓度和延长时间,加倍效果呈下降趋势。秋水仙素溶液浸泡处理法对愈伤组织的伤害较直接, 而且要经过多次的转移和冲洗, 增加了受污染的几率。所以秋水仙素溶液浸泡处理法不论在操作还是在加倍效果上均不如秋水仙素加入培养基处理法。
154　第 6 期　　　　　王　强等: 秋水仙素诱导川贝母 (F ritilla ria cirrhosa D. Don)愈伤组织多倍体的研究
表 2　秋水仙素溶液浸泡处理法对川贝母愈伤组织多倍体诱导的影响
T able 2　T he effects of imm ersing callus in co lch icine so lu tion on inducing tetrap lo id of F ritilla ria cirrhosa D. Don
处理浓度 (m göL )
T reatm ent
concen tra t ion
处理时间 (d)
T reatm ent
t im e
处理愈伤组织
N um bers of
treated callus
受害愈伤组织
N um bers of
in ju ried callus
四倍体细胞
N um bers of
tetrap lo id cell
诱导率 (% )
Inducing
ratio
100 24 30 0 30 15
100 48 30 3 40 20
100 72 30 5 58 29
500 24 30 2 46 23
500 48 30 6 60 30
500 72 30 8 74 37
1 000 24 30 5 94 47
1 000 48 30 10 86 43
1 000 72 30 14 78 39
2 000 24 30 8 66 33
2 000 48 30 15 70 35
2 000 72 30 20 62 31
　　　0 (Contro l) 0 30 0 0 0
3　意义
利用秋水仙素进行染色体加倍具有经济、方便、
诱变作用专一性强的特点。但是, 人们在研究中发
现, 以往采用浸种和滴涂生长点的方法, 是在整体水
平上染色体加倍的诱导, 受环境干扰大, 易产生嵌合
体, 并可能发生回复突变, 随着组织培养技术的发
展, 很多物种通过组培再生植株已经不存在障碍, 这
使秋水仙素在离体组织水平上诱导单个细胞内染色
体加倍成为可能。离体组织细胞染色体加倍也以其
容易控制实验条件和重复实验结果、提高工作效率、
减少嵌合体等三大优势而逐渐受到重视。在国内, 应
用组织培养技术已对黄芩 (S cu tella ria ba ica lensis
Geo rgi) [6 ]、宁夏枸杞 (L y cium ba rba rm L. ) [7 ]、百合
〔L ilium d av id ii var. w illm ottiae ( W ilson )
R affill〕[8 ]、党参〔Cod onop sisi p ilosu la ( F ranch. )
N ann t〕[9 ]等药用植物进行了多倍体育种, 取得较好
的效果。本实验通过对川贝母愈伤组织进行秋水仙
素处理, 得到了四倍体的愈伤组织, 这在川贝母的研
究中是首次报道, 具有一定的意义。首先, 本实验中
诱导得到的愈伤组织块通过细胞学方法迅速地进行
染色体数目的鉴定、筛选, 并且可以通过诱导所得的
多倍体愈伤组织的生长、增殖、分化在短期内得到大
量的多倍体组织和植株, 可以用于有效成分的提取,
也可以作为生药材使用或者直接栽培的研究; 另外,
在前言中提到由于植物在多倍化后一般都会呈现出
植株的巨大性, 而且由于染色体数目的变化, 与次生
代谢产物有关的基因数量也相应变化, 所以本实验
中使用的川贝母在进行多倍化后可能有效成分 (总
生物碱、总皂甙) 含量会有所改变, 这对于进一步研
究川贝母的生理生化变化打下了基础。
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