全 文 ：武汉植物学研究 2010, 28(6): 660~665
Journal of Wuhan Botanical Research


收稿日期: 2010-04-08, 修回日期: 2010-05-17。
基金项目: 国家自然科学基金面上项目(30671312)。
作者简介: 王太霞(1964−), 女, 河南新乡市人, 博士, 从事植物遗传与生物化学研究。
∗通讯作者(Author for correspondence. E-mail: whwei@oilcrops.cn)。
DOI: 10.3724/SP.J.1142.2010.60660
甘蓝型油菜 A 基因组候选 BAC 克隆的筛选
及其插入片段大小分析
王太霞1, 闫晓红2, 查敏敏1, 王力军2, 魏文辉2∗
(1. 河南师范大学生命科学学院, 河南新乡 453007;
2. 中国农业科学院油料作物研究所/农业部油料作物生物学重点开放实验室, 武汉 430062)
摘 要: 选择甘蓝型油菜A基因组 10个连锁群上特有的 85个 SSR分子标记, 合成其引物序列, 采用四维 PCR
法筛选甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系 BAC文库, 成功筛选到甘蓝型油菜 A基因组 39个 BAC克隆,
其插入片段介于 50~300 kb之间, 平均为 120 kb。甘蓝型油菜 A基因组 10个连锁群 BAC克隆的获得, 对后
续开展甘蓝型油菜 A 基因组染色体识别、基因染色体定位、遗传距离与物理距离间关系分析等均具有重要
价值。
关键词: 甘蓝型油菜; A基因组; SSR标记; 四维 PCR; BAC克隆
中图分类号: S565.403 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X(2010)06-0660-06

Screening and Insert Size Analysis of Candidate BAC
Clones from Brassica napus A Genome
WANG Tai-Xia1, YAN Xiao-Hong2, ZHA Min-Min1, WANG Li-Jun2, WEI Wen-Hui2∗
(1. College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang, Henan 453007, China;
2. Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key
Laboratory of Oil Crop Biology of the Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China)
Abstract: Thirty-nine A genome specific BAC clones were successfully screened by four-
dimensional PCR, with the primer sequences of eighty-five SSR markers located in the ten linkage
groups of Brassica napus A genome from the BAC library of Brassica napus-Xinjiang wild rape
disomic alien addition line. The thirty-nine screened BAC clones had an average insert size of
120 kb (range 50 to 300 kb). This set of BAC clones will be of interest to A genome chromosome
identification, gene locating, and relationship analysis between physical distance and genetic
distance in Brassica napus.
Key words: Brassica napus; A genome; SSR markers; Four-dimensional PCR; BAC clones
自 Landry和 Hubert[1]成功构建甘蓝型油菜第
一张分子标记遗传连锁图以来, 国内外不同实验
室又分别构建了其多张遗传图谱[2−8], 这些遗传图
谱在甘蓝型油菜的基因组研究中起到了重要作
用。遗传图谱是根据基因或分子标记间的重组频
率确定其相对位置, 与其在染色体上的真实位置
并不完全相符, 有许多基因或分子标记在遗传连
锁图上的位置相同, 然而在染色体上并不等位。基
因在染色体上真实位置的确定, 对于深刻认识基
因组结构、染色体结构及目的基因的分离等均具
有重要作用。本研究从甘蓝型油菜-新疆野生油菜
二体 异 附 加系 BAC(bacterial artificial chro-
mosome)文库中筛选到一套甘蓝型油菜 A基因组
十个连锁群特异的 BAC克隆, 对今后进行特定材

第 6期 王太霞等: 甘蓝型油菜 A基因组候选 BAC克隆的筛选及其插入片段大小分析 661


料的染色体识别及研究甘蓝型油菜遗传距离与物
理距离之间的关系等可提供重要参考价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所用 BAC文库为本实验室构建的甘蓝
型油菜(Brassica napus)-新疆野生油菜(Sinapis
arvensis)二体异附加系 BAC文库, 该文库 69120
个克隆,覆盖了甘蓝型油菜全基因组至少 6倍[9]。
甘蓝型油菜中双四号基因组用于四维 PCR筛选的
阳性对照。
1.2 试验方法
1.2.1 连锁群特异标记的选择
根据 Piquemal 等 [10]构建的甘蓝型油菜遗传
图谱选用 A基因组的 85个 SSR分子标记, 对整个
文库的 69120个克隆进行筛选。标记选择满足 2
个条件: 所选标记在图谱中具有唯一位点, 每个连
锁群上被选用的标记均匀分布。
1.2.2 文库混合池的构建
1.2.2.1 备份 BAC 文库的准备
文库保存在−80°C, 使用时首先在 4°C 解冻
10 h。冻存缓冲液和 LB(含 2%氯霉素)按 10:1混
合, 之后分装到新的 384孔板中, 每个孔 100 μL。
用 384针复制手(replicator)将原板中的克隆接种
到新的 384孔板中。每次使用复制手时用 70%酒
精消毒, 火焰干燥。接种后的 384孔板在 37°C培
养箱中培养过夜。按照同样的方法再制备第二个
备份文库。将每一个 384孔板用保鲜膜包好, 存放
于−80°C。
1.2.2.2 BAC 克隆混合池制备
为了快速高效筛选 BAC克隆, 首先准备混合
池 : 将每十个 Plate pool 混合成一个一级池即
Super Plate pool(10×384 个克隆/pool); 将一个
384 孔板的所有克隆混合成一个二级池即 Plate
pool(384个克隆/pool); 每一行混合成一个三级池
即 RP pool(24克隆/pool);384孔板每一个 pool即
为一个四级池。
首先准备二级混合池: 在Φ 15 cm培养皿中加
入 LB液体培养基, 用 384针复制手将一个板的所
用 BAC克隆接种到培养基中, 37°C培养过夜。取
培养好的菌液 500 μL与 500 μL 80%甘油混匀, 置
于 1.5 mL离心管, −80°C保存。
接着准备一级混合池: 将二级混合池每十个
混合成一个一级混合池, 用无菌牙签接种。培养好
的菌液和 80%甘油 1:1混合保存于−80°C。在使
用时, 用无菌牙签接种于 1.5 mL 离心管, 每管加
LB 液体培养基 1000 μL, 250 r/min 37°C培养过
夜。将培养好的菌液小量制备 BAC DNA, 便于长
期保存使用。
三级混合池亦用无菌牙签将每一个板的每一
行混合成一个三级池。
这些混合的或单个的携带有 BAC 克隆的
Escherichia coli 均用 LB 培养基 (含 2%氯霉
素)250 r/min 37°C下培养过夜。
1.2.3 BAC 克隆 PCR 筛选
利用 SSR引物序列通过四维 PCR筛选 BAC
克隆, 具体步骤参照 Kato等[11]的方法, 略有改动。
先在 SP pool中筛选, 再在 P pool中筛选确定阳性
P pool, 之后筛选与阳性 P pool相对应的 16个 CP
pools, 最后筛选与阳性 CP pools 对应的 24 个
pools以确定阳性单克隆。
PCR筛选所用体系: 总反应体系为 20 μL, 其
中 10×PCR buffer 2 μL, dNTP (dATP、dGTP、
dCTP、dTTP各 2.5 mmol/L) 1.6 μL, 引物 (25 μmol/L)
1 μL, Taq DNA 聚合酶(3 U/μL)1 μL, BAC DNA
(50～200 ng/μL)1 μL, ddH2O 13.4 μL。
扩增反应的程序: 94°C预变性 15 min; 94°C
变性 45 s, 53°C退火 1 min, 72°C延伸 2 min, 40
个循环; 72°C延伸 15 min。
1.2.4 BAC 克隆大小的鉴定
参照 Sambrook 等 [12]的方法小量制备 BAC
DNA, Not Ⅰ 酶 切 后 , 以 MidRange Ⅰ PFG
Marker(New England Biolabs)为分子量标准, 脉
冲电泳检测插入片段大小, 电泳条件: 1.2%琼脂
糖凝胶, 1×TAE, 泵 80, 温度 8°C,电压 6 V/cm,角
度 120o,脉冲时间 5～25 s, 运行 18 h。
2 结果与分析
2.1 各连锁群 BAC克隆的筛选
用四维 PCR法筛选 BAC文库, 得到了 A基因
组 10个连锁群的 BAC克隆。下面以第 9连锁群
Ol10-C01标记筛选阳性 BAC克隆为例进行说明。

662 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷


Piquemal等[10]构建的甘蓝型油菜遗传图谱中
Ol10-C01 SSR 分子标记特异存在于第九连锁群
上, 依据 Ol10-C01 SSR分子标记两端的保守序列
合成引物 (Fo rward : 5 ′ -ATGACTGCTTAAA
CAGCGCC-3′, Reverse: 5′-CTTCTCCAACAAA
AGCTCGG-3′)。用该引物筛选 BAC文库一级池
的 18个一级池, 结果显示第 18 个 Super Plate
pool含有阳性克隆(图 1：A, D)。接着用该引物筛

A~C：四维 PCR筛选过程; D：SSR Ol10-C01筛选 18个一级池; E：Ol10-C01筛选 10个二级池; F：Ol10-C01筛选 16个三级池; G：Ol10-C01
筛选 24个四级池
A-C：Screening course of four-dimensional PCR; D：Screening of eighteen super plate pools with the primers of SSR Ol10-C01;
E：Screening of ten plate pools with the primers of SSR Ol10-C01; F：Screening of sixteen RP pools with the primers of SSR Ol10-C01;
G：Screening of twenty-four pools with the primers of SSR Ol10-C01
图 1 BAC 克隆四维 PCR 筛选
Fig. 1 Screening of BAC clones by four-dimensional PCR

第 6期 王太霞等: 甘蓝型油菜 A基因组候选 BAC克隆的筛选及其插入片段大小分析 663


表 1 筛选所得 10 个连锁群阳性克隆所在 BAC 库中的位置及插入片段大小
Table 1 Sites of BAC clones screened from ten linkage groups of Brassica napus A genome
in the library and insert sizes
连锁群
Linkage
group
引物
Primer
pair
克隆在文库中的位置∗
Site in the BAC
library
克隆插入片段大小(kb)
Insert sizes of BAC
clones
连锁群
Linkage
group
引物
Primer
pair
克隆在文库中的位置∗
Site in the BAC
library
克隆插入片段大小(kb)
Insert sizes of BAC
clones
N1 CB10081 124-G-8 145 N6 CB10330 28-B-1 80
Na12-C06 113-L-18 48 CB10006 154-A-3 145
Na14-D07 112-H-12 75 Ol10-D01 97-H-10 80
Ra3-H09 99-K-6 70

CB10143 56-J-17 110
CB10597 127-B-21 160 N7 CB10594 90-O-20 80

Bras043 93-I-13 100 Ol10-F09 114-G-17 75
N2 CB10416 153-K-6 145 CB10439 159-D-11 145
Ol13-E08 159-M-18 175 Bras004 155-D-17 175
CB10471 87-A-7 115

CB10278 157-D-22 275
Bras083 160-9-21 150 N8 CB10578 120-J-21 145
CB10172 151-P-3 140 Ra2-E12 59-B-24 60
N3 Bras029 108-G-6 90 N9 CB10347 86-M-18 85
CB10403 171-M-24 170 Ol10-C01 171-I-6 130 Ra3-D04 112-E-10 95 MR172 146-E-22 175
N4 MR036 109-N-13 85 N10 Ol10-A02 157-C-24 135
Ol10-B06 121-K-21 130 CB10524 136-M-16 194 CB10302 170-K-2 150 MR156 18-M-20 95
N5 CB10545 131-D-17 155 CB10124 10-P-17 90
Na14-H12 164-O-16 135


MR014 168-H-20 175
CB10080 84-B-10 75
∗克隆位置：板数-行数-列数。
∗ Site of BAC clones in the library: No. of 384-well plate -No. of row -No. of column.

选组成第 18个 Super Plate pool的 171～180的
10个二级池, 阳性克隆存在于第 171号 384孔板
(图 1：B, E)。用该引物继续筛选第 171板的 A～
P共 16个 RP pools, 在该板的 I行(图 1：C, 箭头
所示)含有阳性克隆(图 1：F)。最后用该引物筛选
第 171板 I行的 24个 pools, 得到第 171板 I行第
6个 pool中的 BAC克隆(图 1：C, G), 即为对应于
第九连锁群 Ol10-C01 SSR分子标记的特异 BAC
克隆。筛选所得 10个连锁群阳性克隆在 BAC库
中的位置见表 1。
2.2 所得阳性克隆大小的鉴定
为检测阳性克隆的插入片段大小, 需要对所
得阳性 BAC克隆的插入片段酶切鉴定, 结果表明
其插入片段介于 50～300 kb 之间, 绝大部分在
100 kb以上, 平均为 120 kb(表 1)。油菜属于双子
叶植物, NotⅠ酶切位点比较稀少 [13],大部分克隆
表现为一条带, 有个别表现为两条带(图 2), 将两
条带加在一起可得到 BAC克隆片段的实际长度。
3 讨论
甘蓝型油菜是与拟南芥亲缘关系最近的重要
农作物。拟南芥是开展有花植物细胞学、遗传学、
基因组学及分子生物学等研究的模式物种, 甘蓝
型油菜则被看做芸薹属作物的模式物种, 是研究
多倍体植物基因组构成与进化的合适材料[14]。
从 BAC文库筛选 BAC克隆主要是通过 PCR
技术或杂交技术两种方法 [15,16], 但杂交筛选法其
信噪比高, 已渐被 PCR方法所淘汰。PCR结合多
级混合池的筛选方法经济方便、快速可靠。BAC
基因组大片段(＞100 kb)的成功分离, 有助于基因

664 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷



图 2 BAC克隆插入片段电泳结果
Fig. 2 Electrophoresis of BAC clone inserts
组物理标签和长距离物理图谱的构建, 因此 BAC
克隆已成为基因组测序的“序列准备”模板
(sequence-ready template)。
在筛选 BAC克隆过程中, 有时没有阳性信号,
有时出现多个阳性结果, 有时出现假阳性信号, 出
现这些情况的原因可能有以下几个方面: ① 在构
建 BAC文库的时候, 基因组的某一部分可能被漏
掉了, 而某一部分又可能被多次重复。基因组覆盖
率只是一个平均值。如果筛选的目的片段恰好是
被漏掉的部分, 进行 PCR筛选时就没有阳性信号;
如果要筛选的目的片段恰好被重复了, 则可能出
现多个阳性信号, 这在筛选过程中是相当普遍的。
出现多个阳性信号时, 就选择了信号最强的样品
继续下一级池的筛选。② 单克隆生长速度的不同
导致其在混合 DNA池中的浓度不同。为此, 要将
各个 DNA池稀释或浓缩到大致相同的浓度, 以减
少 PCR筛选过程中由于 DNA模板浓度的不同而
造成的误差。③ 在超级池的构建过程中, 不含阳
性克隆的超级池若被阳性克隆污染, 该阳性超级
池在二级池筛选时便没有了阳性信号, 通过筛选
此二级池, 可将此假阳性超级池剔除。与阳性超级
池对应的二级池的构建过程中, 若未将阳性克隆
混进该混合池, 该阳性克隆将被漏掉。④ 插入片
段上的酶切位点还可以引起筛选结果出现两条
带。⑤ 出现假阳性的情况也存在多种解释, Cai L[17]
等认为原因不详 , Green, Olson[15]等则推断认为
这些片段有可能只在非常高的浓度下才有可能被
扩增。
甘蓝型油菜是由二倍体白菜(Brassica rapa,
AA, 2n = 20)与二倍体甘蓝(B. oleracea, CC, 2n =
18)复合而成的异源四倍体, 染色体小且染色体形
态十分相似, 利用连锁群特异 BAC 克隆, 有助于
识别特定染色体 [18−22]。当利用 BAC 克隆作为
BAC-FISH(fluorescence in situ hybridization)及
Fiber-FISH 的探针时, 可制作高分辨率的物理图
谱, 对目的基因或基因组片段进行精细定位[23−25]。
随着更多物种基因组测序工作的展开, BAC-FISH
技术也将发挥着越来越重要的作用[26]。
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(责任编辑：王豫鄂)