全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20( 3) : 236～240
Journal of Wuhan Botanical Research
南瓜种子萌发及子叶发育时谷氨酰胺合成酶
和其它氨同化酶的变化
魏国威 林清华 张楚富 袁永泽 王其海
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉 430072)
关键词: 发育; 谷氨酰胺合成酶; 谷氨酸合酶; 谷氨酸脱氢酶 ; 同工酶; 南瓜
中图分类号: Q945; Q946. 5 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2002) 03-0236-05
Changes of Glutamine Synthetase and Other Ammonia-Assimilating
Enzymes during the Germination of the Seed and the Development
of the Cotyledon in Cushaw
WEI Guo-Wei, LIN Qing-Hua, ZHANG Chu-Fu
* , YUAN Yong-Ze, WANG Qi-Hai
( K ey Labor atory of MOE f or Plant Dev elop mental Biology, Wuhan Univ ersity Wuhan 430072, C hina)
Abstract: T he change of g lutamine synthetase ( GS ) iso fo rm was determined by Native-PAGE
and the act ivity staining as w ell as Wester n blot t ing . T he act ivity changes of GS, NADH-depen-
dent glutamate synthase ( NADH-GOGAT ) , and NADH-dependent g lutamate dehydrogenase
( N ADH-GDH) w ere also analyzed by enzyme assay . T he results indicateded that only one form
of GS isozyme w as detected during the germinat ion o f cushaw seed and the dif ferent development
stages of the co ty ledon g row n in l ight or in dar kness. GS act ivity w as increaseed w ith the germi-
nat ion o f the seed unt ill the coty ledon to begin g reen and then w as reduced g radually. T he ten-
dency of the act ivity change of NADH-GOGAT was similar to GS. The act ivity change of
NADH-GDH was contrary to that of GS and NADH-GOGAT . T he results suggested that the ex-
pression of GS isofo rm w as not ef fected by the tr eatments of light and darkness in the experiment
condit ions. GS/ GOGAT cycle may play a main role for assimilat ing ammonium during the germi-
nat ion of the seeds and the initial stage o f the cotyledon development , and the cycle w as weaken
and GDH pathw ay w as st rengthened af ter the green of the coty ledon by comparing these enzyme
act ivit ies.
Key words: Development ; Glutamine synthetase; Glutamate synthase; Glutamate dehydroge-
nase; Isozyme; Cushaw ( Cucurbita moschata)
在发育的新生组织中,来自种子胚乳储存蛋白
的降解和氨基酸分解代谢产生的氨由谷氨酰胺合成
酶( Glutam ine synthetase, GS)重新同化, 生成的谷
氨酰胺( Gln)被转运到正在生长着的部分。GS 是高
等植物氮素代谢的关键酶[ 1] ,这个酶能同化不同来
源的氨。GS有多种同工酶,存在于植物的各种组织
和器官中。它们是由一小的同源但分离的核基因家
族编码的[ 2 3] ,这些不同的 GS 在植物氮素同化中起
着非重叠的作用[ 4] , 它们的表达受到环境、发育进
程以及组织或细胞类型等许多因素的影响。在大多
收稿日期: 2001-08-26,修回日期: 2001-11-28。
作者简介: 魏国威( 1977- ) ,男,硕士生,从事植物生理、生化和分子生物学研究。
通讯作者。E-mail : cfz hang@ whu. ed u. cn
数已研究过的植物叶片中存在两种 GS, 即胞液型
GS( GS1)和叶绿体/质体型 GS( GS2) [ 1]。
在高等植物中, 谷氨酸合酶( Glutamate syn-
thase, GOGAT )也存在两种不同的同工酶, 一种是
以 NADH 作为还原剂( NA DH-GOGAT ) , 另一种
以铁氧还蛋白作还原剂( Fd-GOGAT ) [ 1]。前者主要
存在于非光合组织中, 后者在光合组织中占优势。
GS/ GOGAT 构成的循环途径是将无机氮转化为有
机氮的主要途径[ 1]。谷氨酸脱氢酶( Glutamate de-
hydro genase,GDH)存在着依赖于 NAD( H)和依赖
于NADP( H)两种类型的同工酶 [ 1]。由于 GDH 对氨
的高Km, 它在氨同化中的作用是有争议的[ 5]。研究
这些氨同化酶在发育的新生组织中的活性变化,有
助于深入了解氨同化、转运的机制和氮素利用情况。
南瓜属于葫芦科植物, 这些植物中的氨同化酶的研
究尚未见报道。我们对南瓜种子萌发及子叶发育阶
段氨同化酶的变化做了初步研究, 以便了解这些酶
在葫芦科植物氨同化中的作用。
1 材料和方法
1. 1 材料和培养
南瓜 ( Cucurbita moschata) (黄狼)种子从种子
站购买。种子经消毒后,置于蒸馏水中于 30℃浸泡
24 h, 然后将种子移栽到盛有用营养液浸湿沙土的
钵中进行无氮培养, 营养液含有 0. 32 mmol / L
NaH2PO 4 · 2H 2O, 0. 51 mmol / L K 2SO 4,
1. 63 mmol / L MgSO47H2O, 0. 8 mmo l/ L H3BO 3,
0. 98 mmol/ L CaCl2 , 0. 15 mol/ L ZnSO47H2O,
1. 32 mol/ L CuSO 45H2O, 35. 7 mol/ L FeCl3
6H2O, 8. 9 mol/ L MnCl24H2O 和70 mol/ L 柠檬
酸。若在有氮条件下培养, 则在营养液中加入
1. 43 mmol / L ( NH4) 2SO 4。温室昼夜温度为30℃～
25℃, 每天光照(白炽灯) 12 h, 光照强度为 100～
120 mo lm- 2s- 1。于播种后不同培养时间取样,所
有材料于- 30℃冰箱中短暂保存或立即用于酶液的
抽提。从浸种开始计算播种时间, 包括浸种 0～
24 h、种子萌发至子叶开始转绿( 48～120 h) , 继续
绿化( 120～168 h)。
1. 2 酶液的提取
按文献[ 6]介绍的方法分别从子叶中提取酶液。
每克样品加入 2 mL 抽提缓冲液。
1. 3 GS活性的测定
按文献[ 7]介绍的方法测定 GS 的活性。一个
GS 活性单位定义为在 37℃条件下每分钟催化
1 mo l的 -谷 氨 酰 异 羟 月兮 酸 ( -g lutamylhy-
droxamate)的产生所需要的酶量。总 GS 活性计算
以每小时每克鲜重材料催化产生的 -谷氨酰异羟
月兮酸 mol数表示。
1. 4 GS同工酶的分离和活性染色
提取液中的 GS同工酶的分离以及电泳后胶中
的 GS 活性带的检测按文献[ 6]介绍的方法进行。
1. 5 GS同工酶蛋白印迹检测
提取液中的 GS 同工酶经 Native-PAGE 分离
后, 转移到硝酸纤维素膜上, 按文献[ 6]介绍的程序
进行蛋白质印迹检测。所用抗体是抗水稻根 GSra
的抗体。
1. 6 NADH-GOGAT活性的测定
NADH-GOGAT 活性的测定按文献[ 8]进行。
当加入酶液后立即加入 L-谷氨酰胺启动反应。在
30℃条件下每分钟反应液减少 1 mol的 NADH 所
需的酶量定义为 1 个酶活性单位。总 NADH-
GOGAT 活性计算以每小时每克鲜重材料催化
NADH 减少的 mol数表示。
1. 7 NADH-GDH活性的测定
NADH-GDH 活性的测定按文献[ 8]进行。当加
入酶提取液后立即启动反应。以每分钟反应液于
30℃减少 1 mol的 NADH 所需的酶量定义为 1个
酶活性单位。总NADH-GDH 活性计算以每小时每
克鲜重材料催化 NADH 减少的 mol数表示。
所有实验重复 3次。
2 结果
2. 1 种子萌发及子叶发育过程中 GS活性的变化
图 1表明, 浸种 24 h 的种子子叶的 GS 活性较
低, 萌发期间活性不断升高; 至72 h , GS活性升高
图 1 南瓜种子萌发及子叶发育时 GS活性的变化
F ig . 1 T he changes o f their GS activit ies dur ing t he
germination of the seeds and the development o f
t he co tyledon of cushaw
237 第 3 期 魏国威等: 南瓜种子萌发及子叶发育时谷氨酰胺合成酶和其它氨同化酶的变化
1. 6倍;至子叶开始绿化(即播种后 120 h) , 活性升
高约 4倍。尔后, 子叶的 GS 活性呈现逐步下降趋
势。在有氮培养的条件下, GS活性变化的趋势与无
氮下基本相同。
2. 2 子叶发育时 GS同工酶及其蛋白水平的变化
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( Nat ive-PAGE)和
活性染色表明, 在无氮条件下, 无论在暗处或在光
照下培养,均只观察到 1种 GS 活性带。从子叶开始
绿化后(播种 120 h) , GS 活性带逐渐减弱。如图2中
1～4所示, 子叶 GS 同工酶谱带的深浅变化与它的
GS活性变化(图 1中的 120～168 h)是一致的。
泳道 1～4 分别为播种 120、132、144 和 168 h 后的子叶;泳道5为暗处生长144 h的子叶。每个泳道上样量为80 L。
No . 1～4, t he coty leton ex tr act s after sow ing 120, 132,
144, and 168 h, r espectiv ely . No . 5, the cot yleton ex-
tr act g r ow n in the dark for 144 h. T he amount o f each
sample applied to the slo t of the gel was 80 L
图 2 子叶不同发育期GS同工酶的
Native-PAGE和活性染色
F ig . 2 Nativ e-PAGE and activit y staining of GS from
the different development stag es of cushaw coty ledon
Nat iv e-PAGE 和蛋白质印迹实验表明,在种子
萌发及子叶发育过程中, 只检测到 1种 GS 同工酶
蛋白, 其电泳迁移率与它们的活性染色所观察到的
谱带的位置是一致的(图 3)。
No . 1～4 为子叶在无氮下分别生长 120、132、144 和
168 h的样品; N o . 5 为暗处生长 144 h 的样品; a 和 b分别为萌发 48、72 h 的样品。每个泳道上样量为 80 L
No . 1～4, t he samples g row n in the nitr og en-fr ee con-
dition after sow ing 120, 134, 144, and 168 h, respectiv e-
ly. No. 5, the ext ract g r ow n in the dark for 144 h. a
and b w ere the samples germinating 48 and 72 h, r e-
spect ively . T he amount of ea ch sample applied to the
slot o f the gel w as 80 L
图 3 子叶不同发育期 GS同工酶蛋白的
Native-PAGE和蛋白质印迹
F ig . 3 Nativ e-PAGE and West ern blo tting of GS from
the differ ent development stages o f cushaw co tyledon
2. 3 种子萌发及子叶生长时NADH-GOGAT活性
的变化
图 4表明, 南瓜种子浸种,萌发期的种子子叶的
NADH-GOGAT 活性不断升高, 至 120 h 时,活性
为最初的近3倍,子叶绿化后,其活性下降。这与GS
活性变化趋势基本一致, 但在有氮的条件下,
NA DH-GOGAT 活性的变化稍有不同,峰位有所推
迟。
图 4 南瓜种子萌发及子叶发育时
NADH-GOGAT的活性变化
F ig . 4 The changes of t heir NADH-GOGAT activ ity
dur ing t he germ ination o f the seeds and the
development o f the coty ledon o f cushaw
2. 4 种子萌发及子叶发育时 NADH-GDH活性的
变化
图 5 结果表明, NA DH-GDH 的活性变化趋势
与 GS 和 NADH-GOGAT 不同, 在种子浸种和萌发
初期,活性较高,但其后迅速下降,至播种后 120 h,
活性下降了 75% , 在子叶绿化后,复又上升。在有氮
条件下, GDH 活性变化趋势与无氮下相同。
图 5 南瓜种子萌发及子叶发育时
NADH-GOGAT的活性变化
F ig . 5 T he changes o f their NADH-GDH activity
dur ing t he germ ination o f the seeds and the
development o f the coty ledon o f cushaw
238 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷
3 讨论
在大多数植物的叶片中都存在两种 GS 同工
酶,即胞液型的 GS1和叶绿体型的 GS2。这两种同
工酶在氮素的同化中起着非重叠的作用[ 4]。光能够
显著升高叶绿体 GS 的活性,但一般认为对胞液型
GS是没有诱导作用的 [ 1, 2, 9]。de la Haba等人[ 10]在
浸湿的向日葵种子中只检测到 1种 GS( GSs)活性
峰,但随着子叶的发育, GSs消失, GS1出现; 随后,
GS1的活性降低, GS2的活性出现, 并最终约占其
总活性的95%。尽管这 3种GS 活性峰并不重叠,但
随着发育的进程,却在发生变化。向日葵子叶 GS同
工酶的这种变化, 在暗处和在光照下都能发生, 只是
光能够加快这种转变。南瓜种子在萌发期间以及子
叶发育过程中,无论是在光照条件下或者在暗处生
长,均只检测到 1种 GS(图 2)。这表明光对南瓜种
子处在萌发、子叶发育及绿化阶段的 GS 同工酶的
表达没有影响, 也没有引起 GS 同工酶的发育上的
变化。Wester n blot t ing 检测到的GS 同工酶蛋白带
的位置与 GS 活性染色的结果是一致的(图 2和图
3)。在本实验中所使用的抗体是抗水稻胞液型GSr a
的抗体 [ 11] ,胞液型抗体能很好地识别来自其它植物
胞液型 GS, 对叶绿体型GS的识别很弱[ 12]。因此,在
南瓜种子和发育的子叶中存在的这种 GS 很可能是
胞液型的同工酶。
研究表明, 氮素或不同的氮源对植物 GS 同工
酶的表达有着不同的影响[ 5]。例如,氨态氮和硝态氮
对水稻根部的 GSrb 和叶片的 GS2都有明显的促进
作用,但有差别[ 6, 13] ,硝态氮亦能促进向日葵 GS2的
活性[ 10]以及大豆 GS1基因的表达 [ 14] ; 但是, 氮素对
玉米的一种胞液型GS1则没有促进作用 [ 15]。在我们
的实验中, 至少氨态氮对南瓜子叶 GS 活性并不表
现出促进作用。
当葫芦科种子发育时, 胚乳被吸收,子叶成为储
藏的主要器官。子叶中的储藏蛋白降解,营养物被转
移。在南瓜种子萌发及子叶发育过程中, GS 和
NADH-GOGAT 活性显著上升(图 1和图 4) ,子叶
发育至绿化初期的活性比浸种时的活性高出 3～4
倍,而 NADH-GDH 的活性则明显下降(图 5) , 至子
叶开始绿化时, NADH-GDH 的活性只是最初的
25%。这表明, 由胞液型 GS 与 NADH-GOGAT 构
成的循环构成为贮存蛋白降解产生的氨被同化的主
要途径。这正是为了满足储存氮源转运的需要。合
成的谷氨酰胺被转运到处在发育的新生组织中,为
合成其它氨基酸提供氮源 [ 16]。NADH-GDH 活性的
降低表明, 该酶在子叶发育进程的初期氨同化中所
起的作用是十分有限的。随着子叶的进一步绿化,
GS 和 NADH-GOGAT 的活性逐渐下降。这提示,
子叶绿化后已开始老化, 氮素营养大多已被转运到
新生组织中。
由于 GDH 催化反应的可逆性以及它对氨的高
Km, 该酶在植物的氨同化中所起的作用是有争议
的[ 5] ,可能是在氨的同化和谷氨酸的分解代谢中起
着独特的作用。在南瓜种子浸种和萌发初期,
NA DH-GDH 的高活性也许是储存蛋白质降解产生
的氨基酸的分解代谢的需要, 因为种子萌发及子叶
发育需要蛋白质降解提供能量和为新生组织氨基酸
的合成提供碳骨架; 在子叶绿化后,它的活性的升高
也许是氨的后期同化的需要, 因为此时 GS/
GOGAT 循环途径的活性已经降低。
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