全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(4)：364～367
Journal of Wuhan Botanical Research
水稻中期染色体和DNA纤维的高效制备技术
彭莉莉，赵丽娟，宋运淳，李立家
(武汉大学教育部植物发育生物学重点实验室，武汉 430072)
摘 要：水稻中期染色体和 DNA纤维制备是水稻分子细胞遗传学研究中的关键技术。目前 ，这两个技术还有很多
不足，该研究建立了高效制备水稻中期染色体和DNA纤维的方法。该方法制备的染色体，分裂相多、杂质少、背景
清晰、染色体分散且形态好，水稻根尖分生组织细胞的分裂指数高达 25 。植物细胞的细胞壁是制备 DNA纤维的
最大障碍，所以必须先提取细胞核 ，然后裂解细胞核释放出 DNA纤维。在这个研究中，还建立了一个用刀切法分离
细胞核，进而用 SDS裂解核膜，用载玻片拖出DNA来制备水稻 DNA纤维的方法。该方法制备的DNA纤维多呈平
行的细线，背景清晰，伸展的程度均匀，适合于原位杂交。
关键词：水稻；中期染色体；DNA纤维；高效制备
中图分类号 ：$511；Q813．4 文献标识码：A 文章编号 ：1000—470X(2004)04—0364—04
The Highly Efficient M ethods for Preparation of Rice M etaphase
Chromosomes and DNA Fibres
PENG Li—Li，ZHAO Li—Juan，SONG Yun—Chun，LI Li—Jia‘
(Key Laboratory of MOE for Plant Developmental Biology，Wuhan University，Wuhan 430072．China)
Abstract：The preparation of mataphase chromosomes and DNA fibres of rice iS the key technique
in the research of rice genome structure．However these techniques are still in deficiency at pre—
sent．In this study，a method to prepare metaphase chromosomes with high efficiency was deve—
lopped in rice． In the chromosome slides prepared using this method。there were mass of
metaphase cells，less impurity，clear background，well dispersed chromosomes and well presered
chromosome morphologies．The mitotic index of root cells iS up to 25 ．W e also established a
DNA fibres preparing method．Since cell wall iS a main abstacle in the preparation of DNA fi—
bres，thus nuclei ware isolated by chopping first，then lysed by SDS to release DNA，and DNA
fibers were prepared by drawing DNA using a cover side．DNA fibres prepared by this method
showed equally spread parallel thread with clear background，and were suitable for in situ hy—
bridization analysis． The highly efficient methods to prepare rice metaphase chromosomes and
DNA fibres will surely accelerate rice genome mapping and organization analysis．
Key words：Rice；Metaphase chromosomes；DNA fibres；High efficiency
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。在我国
其总面积、总产量和单位面积产量均居各类粮食作
物的首位 。水稻还是公认的禾谷类作物、遗传和分
子生物学研究中的模式植物。
如何制备出分裂相多、杂质少、背景清晰、染色
体分散且形态好的染色体标本，一直是分子细胞遗
传学研究者关注的问题。植物细胞与动物细胞不同，
他含有纤维素的细胞壁，细胞壁间还有果胶质，这给
收稿 日期：2003—11一O5，修回日期：2003—12-30。
基金项 目：国家自然科学基金资助项目(30270678，30270740)。
作者简介：彭莉莉(198z一)，女，武汉大学生命科学学院学生，主要从事植物分子细胞遗传学研究。
通讯作者(Author of correspondence．E—mail：ljia88@yahoo．tom．cn)。
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第 4期 彭莉莉等：水稻中期染色体和DNA纤维的高效制备技术 365
获得分裂相多、杂质少、中期染色体分散且形态好的
染色体带来了困难。目前在各种植物中染色体制片
使用较广的方法是压片法和去壁低渗火焰干燥法，
使用根尖压片法观察植物染色体并不困难，但获得
染色体分散好、分裂相多的细胞频率比较低，染色体
易丢失，特别是对染色体数 目较多，形态又小的植
物，如水稻(Oryza sativa L，2n=24)。而去壁低渗火
焰干燥法则是以酶消化细胞壁而获得无壁的裸体细
胞，以低渗液使细胞膜吸胀和火焰干燥吸水表面张
力而使染色体 自行展开，本研究就是在此方法的基
础上，建立了一套高效制备水稻染色体分裂相的技
术。
由于植物细胞与人类和动物细胞有不同的结构
特点，DNA纤维技术在人类和动物上发展应用 4年
后[ 才引入植物中[引。与人类和动物 DNA纤维上
进行原位杂交时用游离单细胞作为制备 DNA纤维
的材料不同[6]，植物细胞的细胞壁是制备 DNA纤
维的最大障碍，还应尽可能地减少染色体 DNA 的
降解和避免细胞器 DNA对基因组 DNA的污染。
目前人们主要用液氮研磨法制备 DNA纤维，
但此法需用到有毒物疏基乙醇，而且研磨的时间也
很难掌握。本研究参照 Li等的方法((Chromosome
research》，待发表 ，2004)加以改进，以水稻嫩叶为
材料用刀切的方法分离出细胞核，然后用 SDS破坏
细胞核膜并使 DNA分子与复合的蛋白质分离而形
成游离的DNA纤维。实验中省去了疏基乙醇的使
用，建立了从水稻嫩叶中制备 DNA纤维的简易、安
全快速的方法。
1 材料和方法
植物材料 水稻(Oryza sativa L．)由中国科学
院国家基因研究中心提供。
材料培养 水稻种子在通气情况下用自来水浸
泡过夜。培养皿中垫湿滤纸 3层，种子分散其上，间
留间隔，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，
置于 28℃恒温暗箱中培养，每天水洗一二次，当根
尖长至 1 cm左右时，切取生长旺盛的根尖约 2 mm
用于染色体制备；取完根的水稻放入 28℃恒温暗箱
中用泥沙种植，2～3 d后取水稻幼嫩子 叶，用于
DNA纤维的制备。
染色体制备 采用宋运淳等的方法[7]，稍作修
改。刚取下的水稻根尖立即置于新鲜卡诺固定液[甲
醇 ：冰乙酸一3：1(体积比)]中 4℃下固定过夜，充
分水洗后用柠檬酸缓冲液(pH4．2)配制的 2 纤维
素酶、0．3 果胶酶、1．5 macerozyma的混合酶液
于 28℃酶解 3～4 h，吸去酶液 ；用蒸馏水水洗 2～3
次，在双蒸水中后低渗 30 min；再用尖嘴吸管吸 4～
5个根尖置于经处理的干净载玻片中央，滴半滴固
定液，用解剖针先敲至浆状，再滴上 2～3滴固定液
使材料分散，于酒精灯上火烤至着火。玻片经显微镜
镜检后，一2O℃保存备用。
提取细胞核及制备水稻核 DNA纤维 参照Li
等的方法((Chromosome research》，待发表，2004)，
取健康水稻的幼嫩叶片(黄化苗)，越嫩越好，加冰冷
细 胞 核提 取缓 冲液 (Mgsou 4 Bufer 5 760 L，
DTT 6 g，10 Trition一100 150 L)用锋利的手术
刀将叶片切碎至极其细小的匀浆状，将此匀浆混合
液在 33 m孔径的尼龙膜上过滤到 1．5 mL离心管
中，13 200 r／min高速离心 40 S，沉淀重悬，此时得
到的分散均一的重悬液即是浓度适中的细胞核提取
液，置于冰上直接用于 DNA纤维的制备，或者加等
体积的甘油于-20℃保存。DNA纤维制备采用钟筱
波的方法[6]稍作改进，具体步骤如下：吸取 2 L细
胞核提取液置于经处理的干净载玻片的一端，用枪
头轻轻地均匀地涂成一条直线，空气中室温下晾至
半干状态，约 3 min，在细胞核提取液的痕迹上覆盖
35 L核裂解缓冲液 STE(O．5 SDS，5 mmol／L
EDTA，10 mmol／L Tris，pH 7．O)，室温下(冬季一
般放 25~C水中预热)在载玻片上充分裂解细胞核
8～9 min；用干净玻片侧斜 45。，其边缘刚好与进行
裂解细胞核的原载玻片表面接触，使核裂解液缓慢
地、平稳地从载玻片的一端一直铺展到另一端 (注
意不4能用压力)，游离的 DNA分子便会形成平行
DNA纤维，室温干燥 10 min；甲醇 t冰乙酸(3：1)
固定2 min；60~C烘干 30 min，选样片 DAPI染色，在
荧光显微镜下检查 DNA纤维的质量，制片可贮于
- 20℃下干燥保存备用。
照相 制片经 DAPI和 PI染色后 ，(每张制片
加 40 tL(10~g／mL)含 2O 抗灭剂 Vectashield的
DAPI和 PI。在荧光显微镜下用 UV滤片，2O倍和
6O倍镜头观察，并用VH软件照相。Photoshop软件
进行图片处理。
2 结果与讨论
2．1 中期染色体的制片
由于水稻染色体小，植物细胞有细胞壁和较为
浓厚的细胞质对染色体严重覆盖，笔者在去壁低渗
火焰干燥法——涂片法的基础上，建立了一套高效
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第 卷
的制备水稻tp斯染色体的方法 传统的嗨解法亿仅
使用 1 纤维雍酶和 l 皋畦酶 在本研究中．通过
反复摸索 比较．栽们发现使用 2 纤维索酶 0．3
果胶酶，l 5 maccrozym~l混合酶能充分酶斛击壁
和去膜，使太 分裂相得以辉露．陡染色体分裂指数
高选 25 (如图 1：A)．去壁低侉火焰干能法另 一个
奖键 是酶解去壁时间是哲适宜，他直接影响染色
体制片的质蚺 酶解时间太短达不到处理效果．使细
胞壁不易破裂．染色体不易分敞．细瞻不容易分散，
细胞碎片较多；酶解H 同过长则会造成染色体形态
的破坏干口分裂橱下完挫．甚至 色体完全 先 同定
对保持染色体完好形态很重要．井能使染色悻梭蛋
白保持丽育站构．^吏染色体更接近活悼状志 常选用
的同定液为卡诺同定剂(掣醇 冰己醢一3 1，应在
使用前临时配制。甲酵使蛋白质隧固。组 收缩；冰
乙酸 渗透能力强．能固定按蛋白．岛使组织膨目长，
二者混合能起到拮抗作用 取计后成尽快将村料放
八同定液中固定，若不固定则可围细胞 蛋白质分
解而导致结构变化。低渗直接*禾刮染色体分散的
质地，低侉时间过长．刚细咆喷过早破裂，造成染色
体丢失；如低惨处理不够．细咆尚卡胀开．吼I 色体
往往分散不好，仍成团，不l刊于观察汁敬分析 我们
采用蒸埔水进行后低渗处理 30min效果最佳 据我
们的经骑 ．在制片时，敲得越碎越妤．敲至同定液_F
舌．再滴半滴【酮定液，迅建涂开．火焰干燥．千垛后向
眼观察应为规则干净的小雨点状，若小雨点 h象有
瑶不透明的薄层，说叫聘解时阿不罅
尽管术稻染色休觳目较多． 志叉小．但使用我
们建立曲这个技术．制备的水稻染色悼巾获得的染
色悼分散好．陈 丁丹裂相多外．在荧光显微髓下．可
清晰地观察到中期染色体的形态完好(如图 1；B)
过些制舒的染色体分裂柑能狸奸地适 合 DNA原
也杂空的细胞学定位
2 2 DNA纤维制 备
DNA纤维屉将问蚓细咆梭里染色质 DNA 拉
出来 在勒物和人曲 fiber FISH实验中可以直接破
A 啦船 色俸( 2oo)：l 水稻染色件(×∞O】}(-1水 纲弛惰(×600)；D 水稽螂袍植fx：00)：E 显
示机山的 行H细小的 DNA钎 『F 旺示术稻 DNA}F维从悟中 出来
A R【 ehromosome~t 20 c)．B Rice c_lrmn∞⋯ sI fⅢ)}C Rl⋯ Il nuclei(x 600’{D Ri⋯ lI
n1】 lc1( 2‘m){￡ High qu“it 0f rlc DNA flhr s F Ri e DNA [ihres r le dfrom T1ucle J
围 I 水措中期染色体．间期细胞桔和 DNA纤摊
Fig 1 Rl e n1 t h⋯ hr0I l⋯ me8．1¨terph~ nu cl⋯ aI1d DNA flb r s
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第 4期 彭莉莉等：水稻中期染色体和 DNA纤维的高效制备技术
裂细胞的原生质体，释放出DNA纤维，但是植物细
胞有细胞壁，阻碍了直接提取 DNA纤维。所以先提
取细胞核，然后裂解细胞核放出DNA纤维就成为
很多学者的首选了。提取好的细胞核用甘油就可以
长期保存。间期细胞核中的染色质是6个核小体绕
成一圈的一级折迭包装结构，直径 20～3O nm，但是
这个数量级在显微镜下是看不见的，可以看见的是
纠缠在一起的染色质束。使用我们建立的技术从水
稻细胞核中拉出的 DNA纤维 (图 1：F)，制备出的
DNA纤维伸展程度均匀，多呈平行的细线(图 1：
E)。更重要的是，这个技术重复性高，核的纯度适中
(图 1：D)，完整性好(图 1：C)，成功率几乎是百分之
百。这个技术应该也能通过简单的改进以适合于其
他植物种。
在进行 DNA纤维制片的过程中应注意以下几
点：
(1)DNA纤维制片所采用的是新鲜幼叶，应尽
量用黄化苗，这样就避免了植物细胞中的叶绿体对
制备 DNA纤维产生的障碍，而且幼叶越嫩越好。
(2)空气干燥。核悬浮液置于载玻片一端干燥
时，核悬浮液应是半干半湿的状态，悬浮液太干或太
湿，会对核的形态产生很大的影响。
(3)STE裂解。这一步骤极为重要，它直接关系
到DNA纤维的质量。用STE裂解时，应控制在 8～
9 rain之内，裂解时间不够，则细胞核破裂不理想，
难以释放出 DNA纤维，DNA纤维形态不好；裂解
时间过长，则细胞核中的 DNA散出 ，造成 DNA纤
维缠绕。
(4)细胞核的浓度。浓度太低拉出来的DNA纤
维就少，浓度太高则纤维交联在一起。
我们正在利用制备出的 DNA纤维进行水稻基
因组 DNA的细胞遗传学定位分析。
致谢：在研究的过程中，得到了刘静宇，熊志勇等博士的大力
帮助，特此表示感谢。
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