全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(4)：326～330
Journal oy Wuhan Botanical Research
DREB1A转录因子蛋白的原核表达
张玉宝 ，谢忠奎 ，李同祥 ，王亚军 ，郭志鸿 ，王志力
(1．中国科学院寒区旱区环境与工程研究所皋兰生态与农业综合试验站，兰州 730000；
2．兰州大学生命科学学院，兰州 730000)
摘 要：DREB1A是 DREB转录因子的一员，它们都含有一段与 DNA结合的保守区域 ，由58个氨基酸组成，称为
EREBP／AP2结构域(EREBP／AP2 domain)。一个 DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关
的功能基因表达。从拟南芥中克隆了 DREB1A转录因子基因，成功构建了 DREB1A基因的原核表达载体，转化 最
coli BL21(DE3)，经 1 mmoL／L IPTG诱导表达获得了 DREB1A蛋白，但以包涵体形式存在。为以后深入研究 DREB
转录因子与 DRE顺式作用元件相互作用的具体机制奠定了基础。
关键词：DREB1A；转录因子；蛋白；原核表达
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2007)04—0326—05
Prokaryotic Expression of DREB1 A Transcription Factor
ZHANG Yu—Bao ，XIE Zhong—Kui ，LI Tong．Xiang ，WANG Ya．Jun ，GUO Zhi．Hong ，WANG Zhi．Li
(1．Gaolan Experiment Station for Ecology and Agriculture Research，Cold and Arid Regions Environmental and ， neering Research Institute，
the Chinese Academy ofScience，Lanzhou 730000，China；2．School of Science，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)
Abstract：DREB1 A iS a member of the DREB transcription factors．Each DREB protein contains 58 con．
served amino acids named as EREBP／AP2 domain．which binds cis．acting element named DRE(for dehy．
dration．responsive element)．A DREB transcription factor could regulate multiple functional genes related
to dehydration，low temperature and high salt tolerance of plant．We cloned the DREB1 A gene from Arabi·
dops~thaliana(Columbia ecotype)genome by PC R and constructed the prokaryotic express vector，which
was transferred into E．col BL2 1(DE3)．Expression of the DREB 1 A protein was induced by 1 mmo1／L
IVIG．but the target protein obtained in the foITI of inclusion body．This work provides a foundation for
further understanding of the interaction mechanism between DREB transcription factors and DRE cis—·act—·
ing elements．
Key words：DREB 1 A；Transcription factor；Protein；Prokaryotic expression
转录因子，又称反式作用因子，能够与真核基因
启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，
通过它们之间以及其他相关蛋白之间的相互作用，
激活或抑制转录 目前已从植物中分离到了大
量的植物转录凶 f 。
植物在受到逆境(干旱、盐碱、低温)胁迫时，会
产生一系列蛋白来保护自己免受伤害，以维持活力。
目前，转录因子研究已受到广泛关注，特别是在植物
逆境(干旱、盐碱、低温)诱导基因表达调控研究方
面，已成为重要热点。Liu等 使用rd29A基因启动
子的DRE顺式作用元件通过酵母 One·Hybrid方法，
从拟南芥中克隆了两类共 5个与 DRE元件特异结
合的 DREB转录因子，它们可以在低温、干旱或高盐
胁迫下调控报告基因的表达，分别命名为 DREB1A／
CBF3、DREB1 B／CBF1、DREB1 C／CBF2、DREB2A 和
DREB2B。在蛋 白质结构上，这 5个 DREB转 录因
子都具备反式作用因子的典型特征，即N末端都有
一 段核定位信号 (nuclear localization signal，NLS)，C
末端都有一段酸性活化 区域 (acidic activation re·
gion，AAR)，它们都含有一段与 DNA结合的区域，
该区域非常保守，由58个氨基酸组成，称为EREBP／
AP2结构域(EREBP／AP2 domain) 。一个 DREB
转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性
有关的功能基因的表达 引。目前，在 NCBI网上公布
的各种植物 DREB转录因子的基因就有7O个之多，
DREB基因家族不断得到丰富和完善 ¨。
收稿H期：2007—02—07，修 Lj期：2007—06—04。
肇金项 目：中国科学院农业项目办公室课题(CASN一1 15-06-08)资助。
作者简介：张土宝(1981一)，男，【口]族，甘肃平凉人，硕士，助j二，主要从事基因芯片研究(E-mail：$1／IZg532@sohu．COI1)。
$通讯作者(E—mail：wxhcas@lzb．ac．cFI)。
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第4期 张玉宝等：DREB1A转录因子蛋白的原核表达 327
虽然通过多年的研究，我们对植物转录因子尤
其 DREB类转录因子有了一定的认识，但是对于逆
境抗性相关转录因子的功能及其作用机理，知之甚
少；对 DRE顺式作用元件与 DREB转录因子的相互
作用虽有一定研究l8 J，但不够全面，采取的研究方
法(如凝胶移位分析方法)周期长，耗时多，在研究
中存在一定的缺陷。随着生物芯片技术的发展，
dsDNA(ds DNA，double strand DNA)微阵列芯片已
发展成为高通量检测 DNA结合蛋白的重要技术，已
经证明该技术能够非常有效地用于检测序列特异性
DNA结合蛋白质(转录因子)与大量 DNA靶点(顺
式作用元件)的特异性结合 ¨’ ，可有效分析生物
分子结合作用 m J。大肠杆菌系统 由于其优势而成
为表达许多异源蛋白质的首选表达系统 ¨。所以
将 DREBlA基因在大肠杆 菌系统 中大量表达以得
到足够多的蛋白，为下一步利用 dsDNA芯片技术从
生物分子相互作用的角度研究 DREB转录因子的作
用机理，为人为地控制特定基因的表达、综合提高植
物抗逆性、培育植物抗逆品种，特别是培育抗旱、抗
盐、抗低温的植物品种提供理论支持。
本研究从拟南芥中克隆了 DREB1A转录因子
基因，成功构建了 DREB1A基因的原核表达载体，
转化 E．coli BI21(DE3)，经 1 mmol／L IFFG诱导表
达获得 了 DREB1A蛋 白，这 为以后更广泛深入 的研
究 DREB转录因子与 DRE顺式作用元件相互作用
的具体机制奠定了很好的基础。
1 材料和方法
1．1 材料
拟南芥 (Arabidopsis thaliana L．，Columbia eco—
type)种子由兰州大学生命科学学院提供。
大肠杆 菌 (E．coli)DH5c~由本实验室保存。
pUCm—T载体购自上海生工生物工程技术服务有限
公司。pUCm—T载体图谱见图 l。
各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶均购 自大
连宝生物(TaKaRa)工程有限公司，DNA片断回收
试剂盒购 自安徽优晶生物工程有限公司。卡那霉
素、氨苄亲霉素等购自Amresco公司，其他试剂均为
分析纯。
1．2 实验方法
1．2．1 基因组 DNA的提取 取无菌培养的拟南
芥幼苗叶片0．1 g，用 CTAB法提取植物总 DNA¨ 引。
1．2．2 引物设计与合成 根据文献报道的拟南芥
DREBlA转录因子基因核苷酸序列 J，设计合成
Tthlll II1490 AlwN I 1309 UsedforT／A cloning
图 1 pUCm-T载体图谱
Fig．1 The pUCm—T vector
PCR两端引物。为便于克隆化基因的表达，在其正
向引物上加Nco I位点，在其反向引物上加 Ⅲ
位点，最终确定引物序列如下：
正向引物：5’一TA匝巫 GCATGAACTCATITFCT一3’；
r^cDI
反向引物：5’一GC匦垂 ATAACTCCATAACGAT一
日fndⅢ
ACGTC一3’；
以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
1．2．3 质粒 DNA的提取 参见安徽优晶生物工
程有限公司生产的 H．Q．&．Q质粒微量抽提试剂盒
说明。
1．2．4 电泳、酶切、大肠杆菌感受态制备、转化 参
照参考文献[17]进行。
1．3 PCR扩增
拟南芥转录因子 DREB1A基因中无内含子，因
而直接以拟南芥基因组为模板，在特异引物的作用
下通过 PCR扩增得到 DREB1A基因。取 2．5 ng基
因组 DNA，在普通 Taq DNA聚合酶作用下进行 PCR
扩增。扩增条件为：94％预变性 4 rain；94％变性
30 S，50％退火 1 min，72℃延伸 1 rain，循环扩增 30
次，最后 72℃延伸 7 rain。
扩增完毕，取 5 IxL PCR产物经 1％琼脂糖凝胶
电泳检测。扩增片段用 H．Q．&．Q凝胶回收试剂盒
Ⅱ纯化。
1．4 DREB1A转录因子基因的克隆
将经纯化的扩增片段与 pUCm．T载体直接连
接，连接物转化用 CaC1 法制备的大肠杆菌 DH5c~
感受态细胞，在含有 Amp、IPTG和 x-gal的 LB平板
上挑选白色菌落，用 H．Q．&．Q质粒微量抽提试剂
盒抽提质粒，筛选出重组子。
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第4期 张玉宝等：DREB1A转录因子蛋白的原核表达 329
Lane 1—4：Double digestion product of the recombinant plasmid；
M：TaKaRa DI2000 marker
图4 DREB1A重组表达载体酶切鉴定图
Fig．4 Identifcation of the recombination expression vector
of DREBi A by restriction enzyme digestion
1．3：未插 入靶片断 的空质粒诱导表达 产物 ；2：37℃诱 导 4 h目
标蛋白表达产物；4，5：16c诱导 6 h目标蛋白表达产物；6，7：
16％诱导 1 1 h目标蛋白表达产物；8．9：16℃诱导20 h目标蛋白
表达产物；M：低分子量蛋白 Marker
1．3：Expression of PE一1—28a(十)plasmid；2：DREBlA protein in—
duced for 4 h at 37％ ；4，5：DREB1 A protein induced for 6 h at
16"C；6，7：DREB1 A protein induced for l】h at 】6℃ ；8．9：
DREBI A protein induced for 20 h at 16℃ ：M：low molecular weight
protein marker
图 5 不同温度、不同时间诱导 DREB1A蛋白的表达
Fig．5 DREB1 A protein induced at diferent
temperature and time
PAGE的时候蛋白的净电荷影响了迁移率，另外
DREBIA蛋 白中富含 9个脯氨酸，也会使蛋 白在
SDS—PAGE胶中移动变慢。此外，在不同温度诱导
下，DREBIA蛋白的表达量随温度增高而增多。在
l6℃低温诱导时，随诱导时间的延长表达量也增多。
将 l6℃低温诱导 20 h的菌体，超生破碎，上清和沉
淀分别过 His—Tag亲和纯化柱，发现目的蛋白几乎
都存在于沉淀中，说明即使在低温条件下，DREB1A
蛋白在 E．coli BL21(DE3)中是以包涵体的形式存
在。
3 讨论
植物感受外界干旱、高盐、激素、病害及体内细
胞发育等信号，通过一系列信号传递激发转录因子，
转录因子与基因启动子区域的顺式作用元件结合
后，激活 RNA聚合酶 Ⅱ转录复合物，从而启动基因
的转录表达，最后通过基因产物的作用对外界信号
在生理生化等方面做出适合的调节反应 ¨。DREB
转录因子识别 DRE顺式作用元件，当植物受到外界
环境胁迫时，DREB转录因子与 DRE顺式作用元件
结合，犹如一个开关被打开一样，rdl7、rd29A、kinl、
erdlO、cot6．6、cor15a等相应的胁迫耐受基因得到
表达，最终使植物的抗逆性获得增强 ¨。据 Se—
ki【 研究，DREBIA的超表达将激活至少4O个逆境
应答基因的表达，其产物包括一些转录调控因子、糖
转运蛋白、碳水化合物代谢相关蛋白、胚胎发育晚期
丰富蛋白、冷诱导蛋 白、渗透保护生物合成蛋 白等，
通过这些基因产物的表达以及协同作用综合提高植
物对逆境的抵抗能力。所以 DREB类转录因子在基
因的表达调控方面起着非常重要的作用。
低温诱导获得可溶性蛋白的量增多，可以避免
由于蛋白变性、复性引起的蛋白活性丢失，有利于蛋
白质的纯化、维持 目的蛋白的天然空间结构和保持
蛋白的活性。DREBIA蛋 白在 E．coli BL21(DE3)
中是以包涵体的形式存在，可能是由于表达速度太
快，蛋白表达量过高的缘故；也可能是由于大肠杆菌
内还原性过高导致二硫键不能正确形成，从而使表
达产物不溶。据此可以降低 IPTG浓度，从而降低
表达速度，也可以使用基本培养基有助于可溶性表
达；或者将表达菌株更换为 Novagen的促进二硫键
形成与溶解性增强的 E．coli Roseta．gami 2菌株，
希望得到的蛋白以可溶的形式和有活性 的形式出
现。
本研究从拟南芥中克隆了 DREBIA转录因子
基因。成功构建了DREB1A基因的原核表达载体，转
化 E．coli B[21(DE3)，经1 mmol／L IPTG诱导表达
获得了 DREBIA蛋 白，这为以后更广泛深入的研究
工作奠定了基础。但是，如何获得可溶形式和有活
性形式出现的蛋白，还需进一步摸索和验证。
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更 正
本刊2007年第25卷第3期第267页右半栏，李志能作者文章的“结果与分析”部分；
(1)第 l6行“A 鲫值约为1．9”，改为“A t)L】 0值约为 1．75”；
(2)第 1 8行“产量分别为 186 g／g和198 g／g”，改为“产量分别为166 g／g和 178 g／g”。
特此更正。
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