全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(2)：123～126
Jouma／at"Wulum Botanical Research
大戟甲羟戊酸途径关键酶基因 hmgr的克隆与分析
曹小迎 ，蒋继宏 ，刘群 ，戴传超 ，陈凤美
(1．徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州 221 1 16；2．南京师范大学生命科学学院，南京 210097)
摘 要 ：通过 比较 6种植物 8条甲羟戊酸途径关键酶3一羟基-3．-甲基戊二酰辅酶 A还原酶 (HMGR)基因同源区域，
设计简并引物，利用 RT-PCR技术成功地从大戟(Euphorbia pekinensi~)叶中扩增出458 bp的基因片段。通过 BlastP
比较，所推断 的大戟 HMGR蛋 白序列与杜仲 Eucomm／a u／mok／~s(AAV54051)、穿心莲 Andrographi5 paniculata
(AAP14352)、胡黄连P／crorh／za kl／,rrooa(ABC／4565)、橡胶树Hevea brasiliensis(AAU08214)、海岛棉Gossypium barba-
dense(ABC71314)、龙胆草 Gent／ana lutea(BAE9273o)的一致性分别达到 9O％、86％、86％、92％、87％和 88％。蛋
白质保守区、特征区以及进化树分析，初步证实该基因为hmgr基因，这是首次报道从药用植物大戟中克隆到甲羟
戊酸途径关键酶 HMGR的基因片段。
关键词：大戟；3-羟基-3．甲基戊二酰辅酶A还原酶；基因克隆
中图分类号：q781 文献标识码：A 文章编号 ：1000—470X(2007)02—0123—04
Cloning and Analysis of a cDNA Encoding Key Enzyme Gene(hmgr)
of the M VA Pathway in M edicinal Plant Euphorbia pekinensis
CAO Xiao—Ying ，JIANG Ji—Hong ’，LIU Qua ，DAI Chuan—Chao ，CHEN Feng—Mei
(1．XudaouNormal Unh~rdty，Key Labom~ryo，Bioteehno／ogyforMeal／e／ha／P／ant，Xuzhou，Jiangsu 221116，China；
2．Colege D，Life Sciences，Nanii．g Normal ，Nanjing 210097，China)
Abstract：Based on the design of degenerated oligonucleotides according to the conservative regions of
eight 3-hydroxy-3-·methylglutaryl-·CoA reductasos from six plants an d total RNA extracted from Euphorbia
pekinensis，a 458 bp fragment of hmgr was obtained using reverse transcription PCR strategy．Thmugh se—
quence analysis by BlastP online．the resulting protein showed high homology to 3-hydroxy一3一methylgluta—
ryl—CoA reductase，with 90％ identifcation compared with Eucommia ulmoides(AAV5405 1)，86％ with
Andrographispaniculata(AAP14352)，86％ with Picrorhiza kurrooa(ABC74565)，92％ with Hevea bra—
siliensis(AAU08214)，87％ with Gosypium barbadense(ABC71314)and 88％ with Gent／ana lutea
(BAE92730)．Deduced amino acid sequence were also analyzed by PROSITE，ClustalX and Phylogenic
tree，an d data present evidence for the existence of 3-hydroxy一3一methylghtaryl—CoA reductase in E．peki—
nensis，which is the first report of the hmgr gene isolated from E．pekinensis．
Key words：Euphorbia pekinensis；3-hydroxy-3一methyl—glutaryl—coenzyme A reductase(HMGR)；Gene
cloning
许多植物萜类化合物(如抗肿瘤药物紫杉醇和
抗疟药青蒿素)都具有很好的药理活性，为解决当
前西药毒副作用及治疗癌症、艾滋病等疑难疾病提
供了一条新的药物来源，因此植物萜类化合物引起
了人们浓厚的兴趣。随着植物基因工程的飞速发
展，植物萜类代谢途径的研究取得了突破性的进展，
人们通过对关键酶基因的分离克隆，表达调控进而
对萜类次生代谢的合成途径和调控机制有了更为深
入的了解 ¨ 。现代研究认为萜类在植物体中的合
成是分为两部分的，一部分是甲羟戊酸途径，在细胞
质中进行 ，产生倍半萜和三萜 ¨；另一部分是非 甲
羟戊酸途径，在细胞的质体中进行，产生单萜、二萜
和四萜 。在甲羟戊酸途径中 3一羟基-3一甲基戊二
酰辅酶 A还原酶(3-hydroxy-3一methylglutaryl CoA re—
ductase，HMGR)是主要的关键酶之一。目前，hmgr
基因已先后从苹果 】、红豆杉 及甜瓜[6 等植物中
得到分离克隆。
药用植物大戟 (Euphorbia pekinensis)又名龙虎
收藕日期：2006—10—19，修回日期：2006—12—14。
基金项 目：徐州师范大学科研重点项 目(04XLA14)资助。
作者简介：曹小迎(1975一)，女，江苏通州人 ，博士研究生，主要从事药用植物生物技术的研究工作。
· 通讯作者(E-mail：jhjiang~xznu．edu．cn)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
草、将军草、九头狮子等，在植物分类学上属大戟科，
为多年生草本植物。全株含乳汁。现代医学研究发
现，药用植物大戟的根具有多种药理作用，如致泻、
利尿、降压等。临床一般用于治疗急、慢性肾炎水肿
及晚期血吸虫病腹水或其他肝硬变腹水。研究发现，
药用植物大戟根含三萜类成分大戟甙、生物碱、大戟
色素体 A、B、c，另含树胶、树脂等 。若能通过基
因工程手段来调控萜类代谢途径的关键酶如 HlVIGR
等继而促进萜类活性代谢产物的合成积累将是一件
十分有意义的事件。但迄今为止，国内外尚未见到
有关大戟萜类物质代谢合成途径及其关键酶基因如
hrngr等的研究报道。此外，从不同物种中分离克隆
hrngr基因，从而进一步研究 hrngr基因的结构特征、
分子进化以其生物学功能都是非常有意义的。我们
首次克隆了药用植物大戟hmgr基因的eDNA片段，
并用生物信息学手段对其序列进行了分析。
1 材料与方法
1．1 材料
大戟(Euphorb／a pekinenais)原植物采自安徽省
琅琊山森林公园，经安徽师范大学生命科学学院周
守标教授鉴定。
1．2 总 RNA的提取
大戟总RNA提取参照庄军平等[8 报道的方法
略加改动，可以概括为：取1 g大戟的幼嫩叶片，液氮
速冻后研磨成粉末，移人50 mL离心管。加人10 mL
65~C预热的抽提缓冲液[2％ (IV／V)CTAB(十六烷
基三甲基溴化铵)，100 mmol／L Tris／HCl(pH 7．4)，
2 mol／L NaCI，25 mmol／L EDTA(乙二胺四乙酸)，
2％ (W／V)PVPP(交联聚 乙烯 吡咯烷酮)和 4％
(WV)B一巯基乙醇]。剧烈震荡 1 rain后65~C温育
10 min。冷却至室温后加入等体积的氯仿／异戊醇
(24：1)，混匀后于 11 000×g 4~C离心 15 min。取上
清液，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)，混
匀后于 11000×g4~C离心 15 min。取上清液，加人
2倍体积的无水乙醇和 1／10体积的3 mol／L醋酸钠
(pH 5．2)，一80℃沉淀 1 h。取出后于 11 000×g
4~C离心 15 min。沉淀用 3 mol／L醋酸钠(pH 5．6)
淋洗后于 15 000×g 4"C离心 10 min。沉淀溶于
500 IL DEPC水中。继续再用氯仿／异戊醇抽提一
次。取上清液，加人2倍体积的乙醇和 1／10体积的
3 mol／L醋酸钠(pH 5．2)，一80~C沉淀 1 h后离心，
用 70％乙醇洗涤沉淀并溶于 500 IL DEPC(焦碳酸
二乙酯)水中，然后再加入 2／3体积的8 mol／L氯化
锂溶液，4~C存放过夜。第 2天取出后 15 000×g
4℃离心 30 min。沉淀再用 70％乙醇洗 2次后溶于
DEPC水中，一80~C冰箱中保存，备用。
1．3 引物的设计与合成
引物的设计依据 6种植物的8条 HIGRs保守
序列设计(Genbank中的序列号为：CAU72145、CM—
CHMGCOAR、 AB021862、 ATHHMG1、 AY352338、
AF429388、1AU43711)。上游引物序列为：5’一GG
[G／C／T]GATGC[A／T／C]ATGGGf G／A]ATGAA
[C／T]ATG，下游引物序列为：5’一AC[A／T／C]GT
[A／C／G]CC[A／C]ACCTCAATNGA f A／T／G]
GGCAT-3’。由北京奥科生物技术有限公司合成。
1．4 eDNA克隆及序列分析
以大戟总 RNA为模板，用 RACE试剂盒(Clon—
teeh)并按试剂盒操作步骤反转录合成 5’RACE
eDNA，以合成的5’RACE eDNA为模板，用两个上
下游引物进行 PCR扩增。PCR扩增体系为：5O L
体系中含2 ILL5’RACE eDNA，兼并引物各25 pmol，
dNTPs 10 t~rnol，Ex PCR bufer 5 ILL．Ex Taq Polyme—
mse 5U。PCR反应条件为 94℃ 3 min，1个循环；
94℃ 1 min，60cI=1 min，72oC 2 min，35个循环；72℃
10 min，1个循环。用 1％琼脂糖电泳分离 PCR产
物，回收目的条带并纯化，pGEN．T Easy载体连接，
转化 DH5ot大肠杆菌。在 LB／AMP／IPTG／x—Gal平
板上筛选阳性克隆，然后随机挑选经 PCR和EcoR I
酶切确认的重组质粒并测序，测序工作由北京奥科
生物技术有限公司完成。将所测定的序列结果通过
BLASTP或 BLASTX搜索 National Center for Biotech—
nology Information(NCBI)的核苷酸和蛋白质数据
库，将所测序列通过 Dnarnan软件翻译成氨基酸序
列并寻找最大读码框，用Prosite软件在线分析该蛋
白质的基本结构域，并通过 ClustalX分析软件与其
它植物 hrngr的氨基酸序列进行多重比较，用 IEGA
方法构建系统进化树。
2 结果与分析
2．1 RNA提取
大戟总 RNA的甲醛变性凝胶的电泳结果见图
1，从图1中可以清晰地看出 rRNA的2条条带(18S
rRNA、28S rRNA)，其中28S rRNA条带的亮度大约
为 18S rRNA的2倍，说明总 RNA有良好的完整性。
在紫外分光光度计上测得吸光值，A猢／A 舳比值为
1．996，说明所提取的 RNA质量较好，酚类、蛋白质
和无机盐等杂质已基本排除。此 RNA提取方法适
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126 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
Picrorhiza kurrooa(植物)ABC74565
Andrographis paniculata(植物)AAPI4352
Eucommia ulmoides(植物)AAV5405 l
Morus alba(植物)AAD03789
Nicotiana tabacum (植物)AAL54878
Cucumis melo(植物)BAA3629l
Hevea brasiliensis(植物)BAA3629l
Arabidopsis thaliana(植物)AAG51957
Euphorbiapekinensi(植物)
Dendroctonusjefreyi(昆虫)AFI59136
／ps pini(昆虫)AAL0935l
B．germanica(昆虫 )BGHMGCOA
Tribolium caslaneum (昆虫 )XP 973160
Xenopus laevis(动物)XELHMGCOA
Dicentrarchus labrax(动物)AAR02862
Sus scrofa(动物)ABD96089
Mesocricetus auratus(动物)CAA25l89
Saccharomyces cerevisiae(真菌)AAB67527
Penicilium citrinum (真菌)BAC20567
Aspergilus fumigatus(真菌)CAE47850
图 4 20个物种 HMGR蛋白在进化上的关系
Fig．4 Phylogentie relationship among HMGR proteins in 20 diferent species
杆细胞中组胺释放的抑制率为 87．3％，对拟巨噬细
胞株 RAW264．7中 NO产生的抑制率为 50．7％。
除此之外对大戟的萜类化学成分及活性成分的研究
几乎未见报道。对大戟萜类化合物的生物合成及其
分子调控更是知之甚少。
近每一，研究发现 HMGR是甲羟戊酸途径中的
一 个关键酶。3一羟基-3一甲基戊二酸单酰辅酶 A在
HMGR的作用下生成甲羟戊酸(MVA)。由于该反
应是一个不可逆过程，因此 HMGR被认为是该合成
途径中第一个最关键的限速酶【1¨。HMGR对细胞
质中萜类物质的代谢起重要调控作用，作为早期酶
类 ，它决定“碳流”的流向。利用转基因技术将 hmgr
基因导人目标植物来提高有效成分的含量有许多成
功的报道 引。本文实验结果首次成功地从大戟中
扩增出甲羟戊酸途径的关键酶基因 hmgr，通过同源
性比较、保守性区域比较以及蛋白特征性位点分析，
发现与前人所报道的 HMGR蛋白特性非常相似，因
此可以推断克隆得到的片段就是药用植物大戟
HMGR的 eDNA片段。为从大戟中克隆 HMGR的
全长基因进而通过基因工程手段提高大戟中的萜类
化合物的研究和应用作了必要的前期准备。
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