全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(4)：346—350
Journal of Wuhan Botanical Research
水稻红莲型细胞质雄性不育系小孢子
不同发育时期花药总蛋白质比较分析
文李 ，刘盖 ，万翠香 ，王坤 ，彭晓珏 ，朱英国
(1．长沙理工大学生物与食品工程学院，长沙 410076；2．武汉大学生命科学学院，植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：采用双向凝胶电泳对水稻红莲型细胞质雄性不育的不育系小孢子发育单核期和二核期花药总蛋白进行了
分离，通过银染显色 ，获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱 ，且单核期和二核期花药总蛋白质在双向电泳胶
上分布的图谱十分相似。PDQuest 2DE图像分析软件在等电点(pI)3．0—10．0、分子量(M．w．)9．0—98．0 kD之
间可识别约 1 800个蛋白质点。比较分析发现单核期和二核期花药中共有 241个差异表达的蛋白质点，其 中仅在
单核期中表达的点数为 125，仅在二核期中表达的为 13点；表现为表达量差异的 105点，其中在二核期表达下调的
点数为 70点，表达上调的为33点。还对蛋白质点集中的区域 (pI4．5—8．0，M．W．25．0—70．0 kD)中的41个差
异蛋白质点进行了分子量和等电点分析。
关键词：水稻 ；花药；双向电泳；细胞质雄性不育
中图分类号：Q946．1：S511 文献标识码：A 文章编号：1000-470x(2006)04-0346-05
A Comparative Analysis about Two-dimensional Gel Electr0ph0resis
of Anther Total Proteins from Honglian Cytoplasmic M ale Sterile
Rice during the Diferent Developing Stages of the Microspores
WEN Li 一，LIU Gai ，WAN Cui—Xiang ，WANG Kun ，PENG Xiao．Jue ，ZHU Ying．Guo
(1．Department ofBiologi~oZ and Food Engineering ofChangsha University ofScience and Technology，Changsha 410076，China；
2．Key Laboratory ofMOEfor Plant D~lopmental Biology，Colege ofLife Sciences，Wuhan Unlvers ，Wuhan 430072，China)
Abstract：Cytoplasmic male sterility(CMS)，which eliminates the possibility of self-polination，is a
commonly observed phenomenon in the plant kingdom and has been exploited for hybrid seed production．
Rice(Oryza sativa L．)is one of the most important food crops in which CMS has been used successfuly
for commercial hybrid seed production．Two dimensional gel electrophoresis technique was used to inves—
tigate the protein expression profile in uninucleate·-stage and binucleate·-stage anthers of the rice CMS line
(YTA)．After silver staining and analysis by PDQuest 2 DE software，about 1 800 protein spots，inclu—
ding 24 1 differentially accumulated spots，were detected reproducibly．Out of those diferentially accumu-
lated spots，1 25 spots were specialy accumulated in uninucleate—stage，1 3 spo ts were specially accumu‘
lated in binucleate-stage，and 70 spots were down-regulated and 33 spo ts were up—regu alted in binucleate-
stage．The results showed that proteins distribution of uninucleate-stage and binucleate—stage anthers were
similar and the protein spots were mainly focusing on pI 4．5—8．0，and molecular weight ranging from
25．0 kD to 70．0 kD，and 41protein spots in this area were analyzed．
Key words：Rice(Oryza sativa L．)；Anther；Two-dimensional gel electrophoresis；Cytoplasmic male
sterility
细胞 质雄性不育 (cytoplasmic male sterility，
CMS)是一种广泛存在于高等植物中由核基因和细
胞质基因共同控制的生物学现象。对细胞质雄性不
育机理的研究，不仅有助于对核质互作及小孢子发
育和成花机理的深人了解，而且对一系列重大的发
育生物学问题也有着推动作用⋯。本实验室在此
方面已进行了大量的分子生物学研究 ，获得了水
稻红莲型细胞质雄性不育基因的嵌合基因 引，并且
通过遗传作图的方法对该基因的恢复基因进行了染
色体定位 ，但是 目前对水稻细胞质雄性不育及
收稿日期：2006-02-06，修回日期：2006-04—13。
基金项 目：国家重大基础研究 973项目 (2001CB108806)；中国高校博士点专项研究基金(20020486037)。
作者简介：文李(1971一)，女，长沙理工大学生物与食品工程学院讲师 ，武汉大学生命科学学院博士研究生，主要从事有关水稻蛋白质
组学及水稻雄性不育机理研究。
· 通讯作者(E—mail：zhuyg@public．wh．hb．an)。
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第 4期 文 李等 ：水稻红莲型细胞质雄性不育系小孢子不同发育时期花药总蛋白质比较分析
育性恢复的分子基础仍不清楚。
水稻红莲型细胞质雄性不育材料主要表现在小
孢子发育二核期花粉败育，对花药蛋白质的研究有
助于了解水稻红莲型细胞质雄性不育的败育机理。
在对水稻红莲型细胞质雄性不育的不育系和保持系
花药总蛋白质比较研究的基础上 ，我们利用蛋白
质组技术对水稻红莲型细胞质雄性不育的不育系小
孢子不同发育时期花药总蛋白质进行了分析，为进
一 步开展水稻红莲型细胞质雄性不育败育机理的研
究打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
水稻红莲型细胞质雄性不育系(YTA)于2004
年夏天栽种于武汉大学试验田。根据形态学和显微
镜观察，确定小孢子发育时期。取花粉发育至单核
期(YTAu)和二核期(YqAb)穗子，4~C剥取花药，立
即置 一70℃冰箱备用。
1．2 方法
1．2．1 花药蛋白质提取方法
临用前取出花药，加液氮研磨成粉末，用 TCA／
丙酮法提取总蛋白‘。 。用 一20~C预冷蛋白提取液
(10％ TCA，0．07％B—ME)沉淀蛋白质，置 一20~C沉
淀过夜，期间振荡多次，18000 g离心 30 rain，弃上
清，用含0．07％ B—ME丙酮溶液冲洗沉淀，18 000 g
离心 30 rain，重复5～6次，直至蛋 白质沉淀物为纯
白色。取沉淀物，冻干，制成干粉，一20℃备用。在
提取 的过程 中，全程低温操作且加入 1 mmol／L
PMSF以防蛋白质水解。
1．2．2 第一向固相 pH梯度等电聚焦
主要按 懿唱等 7j的方法和 IPGphorⅢ等电聚焦
系统指南进行。花药总蛋 白质提取物与水化液
I 8 mol／L尿素 +4％CHAPS +18 mmoL／L DTI"+
2 mmol／L TBP(tributylphosphine)+0．5％ IPG缓
冲液]充分混合，室温震荡处理 30 rain，上样前
14000 g离心 1 h。采用 Bradford方法测定蛋白质
浓度，将含样本蛋白质 500 Ixg和 2DE蛋白质标准
(购自安玛西亚公司)的样本液(总体积为350 IxL)
加入 IPG strip持胶槽。将 IPG非线性干胶条(安玛
西亚公 司)pH 3～10 NL(180 mm x 3 mm x 0．5 mm)
去保护膜，胶面朝下，轻轻置人持胶槽中，覆盖一
层矿物油盖好持胶槽盖子，置于 IPGphorⅢ等电聚焦
仪(安玛西亚公司)的电极板上，水化和聚焦在20~C
自动进行，总电压时间积为 55 890 V·h，其中水化
在30 V低 电压进行 13 h，然后 经过500 V，1 h、
1 000 V，1 h，最后稳定在 8 000 V下进行。
1．2．3 第二向垂直板 SDS-PAGE电泳
等电聚焦结束后，迅速取出带样品的 IPG胶条
分别 于 20 mL平衡 液 A (50 mmol／L Tris—HC1
pH 8．8+6 mmol／L尿素 +30％甘油 +2％SDS+
0．2％ DTT+ 痕 量溴 酚蓝 )和 20 mL平衡 液
B(50 mmol／L Tris—HC1 pH 8．8+6 mmol／L尿素 +
30％甘油 +2％SDS+3％碘乙酰胺 +痕量溴酚
蓝)中各平衡 15 rain。将平衡后 IPG胶条移至厚度
为0．75 mm的 l2％连续分离胶上端，并在其一端
的外侧加上SDS标准蛋白质，排净气泡用 1％琼脂
糖凝胶封闭，15℃循环水冷却，用25 mA／2块胶恒
流电泳30 min，换用50 mA／2块胶恒流电泳直至溴
酚蓝到达距胶底边约 1 em处停止电泳。
1．2．4 银染
按Pharmacia公司的蛋 白质银染试验盒的操作
手册进行。其基本过程依次是：40％乙醇 +10％冰乙
酸固定30 min；30％乙醇 +0．2％ Na2S203+6．8％乙
酸钠；洗 涤 3次，每 次 5 rain；0．25％ AgNO3+
0．0148％甲醛染色 20 rain；洗涤 2次，每次1 rain；
2．5％ Na CO +0．0074％ 甲醛显影至斑点清晰为
止；加入 1．46％ EDTA Na2·2t20终止10 rain；洗涤
3次，每次5 rain；用 30％乙醇 +4．6％甘油保存。
1．2．5 凝胶图像分析
银染显色的凝胶扫描获取 图像，用 PDQuest
7．40(Bio—Rad)分析软件对图像进行背景消减、斑
点检测、匹配和获取斑点位置坐标等。
2 结果与分析
2．1 花药总蛋白质双向电泳图谱分析
采用固相 pH梯度 IEF／SDS—PAGE双向凝胶电
泳对水稻红莲型细胞质雄性不育系单核期和二核期
花药总蛋白进行了分离，通过银染显色，获得了分辨
率和重复性较好的双向电泳图谱(图 1：A，B)。比
较分析发现单核期和二核期花药总蛋白质在双向电
泳胶上分布的图谱十分相似。用 PDQuest 2DE图像
分析软件对图 1：A和 B进行分析，发现在等电点
(pI)3．0～10．0、分子量(M．w．)9．0～98．0 kD之
间均可识别约 1 800个蛋 白质点。蛋白质点在 2D
胶上的重复性为：图 1：A沿等电聚焦(IEF)方向偏
差为(2．50-tO．19)film (n=3)，沿十二烷基硫酸
钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)方 向偏差为
(3．82±0．25)mm(n=3)；图 1：B沿等电聚焦方向
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
偏差为(2．48±0．21)[rim(n=3)，沿SDS—PAGE方
向偏差为(3 74±0．32)n1m (n=3)。图 1：A和 B
花药蛋白质点均大多分布在偏酸性区域 (pH 4．0一
凸
8．0)、分 子 量 15．0～70．0 kD范 围 内，而 在
pH 4．5～8．0、分子量25 0～60．0 kD范围内尤为
集中：
．
‘
·
’
。
。
’
一 茹
： ‘ 赫。． 1l
· r
’ ‘ ． c 。 ⋯ 。·：‘ ． 0
：^革棱埘；l ：二接蜊。c．D：^ 和 J{巾 掷丹区域(I，I 4．5～8 0．M W．25 0-70．0 kD)放太 C和D中的数字和jiIf头标
2l最井丧这质变I}l】量变3倍以 的蛋白质点．图中数字为 Pl~uest闭像分析较件 自动 E成．黑色箭头袁 表达量 J二调，空
心箭头 鞋示表达 鼠下洞
^：Uninucleate-slage：J{-Binucl~te一 r ．C．D：The efl】ar terI『s ofthe⋯ p【fimusiag 4 5—8．0，and m·1l ’ul盯 wei曲1
m“ ng from 25 O kD m 70 0 kD in^ and B~ pecfively rhe p~3teilts shown qu~．1it]／and q~ tity nw edwith⋯ and m一
}一 automaticaly p=Muced bv tW盯e PI)Quest Onlv山 pn~ieins that the exp~ sion quanti竹 dife．⋯ of ⋯ un}shl】⋯
Ih绷 3 folds a po int~l 1)ur Th 】一~k,ulate(I spots ℃marke1]with black⋯ ．and the dnwn 陀 IⅡl sf~ts a Ⅷarked wlth 1he
h c·lh⋯ ⋯
图1 YTA单核期和二核期花药蛋白质双向电泳银染图谱{采用PDQu~I 7．40软件分析)
F l 2一DE silver-slaim~ maps of YTA anther p~)teins jii unJnucleate and hlnuclea ages
fWhich artalyz~d by POQuest 7．,40 sofrlgate)
2．2 YTA小孢子发育至单核期和二核期花药蛋白
质比较
通过 PDQucst 2DE图像分析软件对 丫TA单核
期和二核期花药总蛋白质电泳图谱进行匹配分析，
计算出二核期中每个点的丰度相对于单核期蛋白点
的比值(YTA}]／YTAu)后发现．比值 为0．0的点 为
【25点．比他为0 00～0．．50之问的为了1)点，比值在
l 5O一10．{30之间的为24点．比值在 l0．1O～2O oo
之问的为9点，比值大于2O的为 I 3点。即单核期
和二核期花药总蛋白质总的差异点为24l点．其中
仅在单核中表达的点数为 125 仅在二核中表达的
为 l3点。其它 105点表现为量的差异，其中在二核
期表达下调 的点数为 7O点 ，表达上调的为 33点。
其他绝大部分点的比值在0．5I～1．49之间．不考虑
：z 叫●中
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为量变的蛋白质点。
重复电泳实验发现，2DE凝胶边缘的蛋白质的
重复性相对于凝胶中间部分的表现较差，考虑到双
向电泳技术本身的限制，主要对蛋白质点集中的区
域(pI 4．5～8．0，M．W．25．0—70．0 kD)进行分析。
图 l：C，D中列出了部分差异表达蛋白质点(包括量
变和质变的点)。表 l中列出了图 l：C，D中所标明
的差异蛋白质点的 M．w．和pI值，该 M．w．和pI值
为PDQuest分析软件根据2DE marker和SDS—PAGE
marker计算出的结果。各蛋白质点的表达量(Nor-
malized volume)由PDQuest分析软件根据点的密度
和灰度计算出。图2中柱形图表示图 1：C，D中所
标明的蛋 白质点的表达量差异。图 2中表示点
121 1 221 1 2504 2709 3205、341 1、3516、3522、3523、
．
3603、36ll、3620、4203、4509、5408、7106、7607、7610和
8207仅在单核期表达，而点 3209、3310、5107和 8407
仅在二核期表达。其它点在单核期和二核期的花药
中显示出表达量的差异，其中8601、7304、6414、8301、
34O9、7605、7104、8604、2503、3408、6411和 2105在单
核期表达上调，而点 2410、4103、8311、4604、1109和
5104 在单核期表达量下调。
l OO
0
E
" -
。6 60
>
兰
互40
2O
O
表 1 图 1：C．D中差异点的分子量(M．w．)和
等电点 (pI)值
Table 1 The molecular weight and pI
ofthe protein spots shown in Fig．1 C and D
Spots no．
钝
pl
点 鼬
Spots no． 等暑点
1109 28．4 4．6 4203 31．4 5．8
1211 33．4 4．7 4509 44．0 5．9
2105 30．3 5．0 4604 53．9 5．7
2211 36．3 5．1 51O4 29．9 6．1
2410 41．2 4．8 5107 28．5 6．3
2503 47．5 4．9 54O8 40 ．9 6．3
25o4 45．4 4．9 6411 41．9 6．6
27O9 59．9 5．1 64 14 42．4 6．7
32O5 32．6 5．4 7104 30．1 7．1
32O9 35．2 5．4 71O6 29．7 7．2
3310 37．7 5．4 73o4 37．2 6．9
3408 42．2 5．4 76o5 57．2 6．9
3409 40．4 5．4 76O7 55．3 7．0
34l1 41．1 5．4 7610 56．5 7．0
3516 45．9 5．5 8207 31．8 7．6
3522 43．9 5．6 8301 38．2 7．4
3523 44．2 5．2 8311 39．5 7．8
3603 50．5 5．2 84O7 40 ．5 7．7
3611 58．8 5．4 86o1 56．8 7．4
3620 56．7 5．6 86o4 51．4 7．6
41O3 27．0 5．7
2II 22lI 23(M 270q 3205 34ll 16 3522 3523Ⅻ 3 361I 3629 4203 4509 54(8 7106 7607 761(}8207 8601 73(gl 6414 8301 a,4~O 7605 7104 8604 2503 34138 641I 2105 2410 4103 83II 46(}4 II(N l(H ¨07 3310 3209 5107
Protein spot
■ y丁Au 口 y丁Ab
图 2 图 1：C。D中差异表达蛋白质点在 YTA单核期(YTAu)和二核期(YTAb)表达量(％)差异
Fig．2 The changes in amount(％ )of the diferentialy expressed proteins of YTA between uninucleate(YTAu)
and binueleate(YTAb)stages．Th e protein spots are mrked in Fig．1 C and D
3 讨论
尽管分子水平的研究以及不育相关基因的克隆
有助于了解水稻雄性不育的机理 · ，可是 目前仍
不清楚这些雄性不育相关基因是如何导致花粉功能
丧失的。大量研究表明，在细胞质雄性不育系中线
粒体 DNA出现异常，能够特异性地破坏花粉正常发
育 J。对于细胞质雄性不育，普遍认为在植物小孢
子发育过程中，线粒体对绒毡层或雄配子的减数分
裂起着重要的作用 J。近年来，分子水平的研究也
发现许多物种中细胞质雄性不育基因也是线粒体
ORFs，如水稻 叫和玉米 ¨等，但是水稻红莲型细胞
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350 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
质雄性不育的机理目前还是不很清楚。
双向电泳作为蛋白质组学技术核心技术之一，
目前已广泛地应用在植物领域 ¨’” ，并且成功应用
于水稻代谢和调节等方面的研究 ¨。利用蛋白质
组学技术分析花药总蛋白，旨在找到花粉发育过程
中与CMS相关的蛋白质，为更进一步了解水稻红莲
型细胞质雄性不育败育发生的机理提供依据。在比
较不育系和可育系花药总蛋白质 及线粒体膜蛋
白质 ¨时发现，不育系花粉发育过程中氮代谢、碳
代谢、淀粉和蛋白质的合成受到影响，引起花粉发育
所必需的底物和能量降低，可能是导致花粉败育的
重要原因。
水稻红莲型细胞质雄性不育为配子体不育，不
育系花粉在二核期败育，选用花粉发育至单核期和
二核期花药为实验材料，旨在找到与花粉败育密切
相关的蛋白质。通过比较单核期和二核期花药蛋白
质发现，二核期的花药蛋白质较单核期数 目和部分
蛋白质表达量下降，说明在花粉败育后，有大量蛋白
质损失。Li等 ¨证明了水稻红莲型细胞质雄性不
育的败育过程是细胞程序化死亡(programmed cel
death，PCD)过程，在花粉败育过程中观察到了典型
的PCD现象，如细胞色素 C的释放，细胞核和细胞
质浓缩、DNA降解等。在 PCD过程中细胞发生自
溶，必然导致大量蛋白质的降解或 肖失，本实验的结
果与之吻合。
本研究利用双向电泳技术初步探讨了水稻红莲
型细胞质雄性不育在小孢子发育过程中蛋白质表达
的变化，为进一步探讨水稻该类型细胞质雄性不育
的机理打下了基础。实验中获得了大量的差异表达
蛋白质信息，分析这些蛋白质的结构、功能以及蛋白
质之间的相互作用，并探讨这些蛋白质和细胞质雄
性不育的关系，还有待于更进一步的研究。
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