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Cryopreservation of Jiangxi Yanshan Red Bud Taro Embryogenic Calli by Encapsulation-vitrification

江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存



全 文 :植物科学学报  2014ꎬ 32(1): 80 ~ 87
Plant Science Journal
    DOI:10􀆰 3724 / SP􀆰 J􀆰 1142􀆰 2014􀆰 10080
江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
洪森荣ꎬ 尹明华∗ꎬ 王艾平
(上饶师范学院生命科学学院ꎬ 江西上饶 334001)
摘  要: 为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源ꎬ 本文以江西铅山红芽芋的胚性愈伤组织为对象ꎬ 研究了包埋
玻璃化冻存过程中各因素对细胞活力和愈伤组织成活率的影响ꎬ 优化建立了江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存体系ꎮ 将约 0􀆰 2 g胚性愈伤组织块包埋成海藻酸钙凝胶珠后ꎬ 在25℃下转入MS+2 mg / L TDZ+
1 mg / L NAA+0􀆰 75 mol / L蔗糖的培养基中于14 h / d光周期下预培养1 dꎻ 预培养后的胚性愈伤组织块用 2 mol / L
甘油和 0􀆰 4 mol / L蔗糖的混合物在 25℃下装载 40 minꎻ 采用 PVS2在 25℃下脱水 30 minꎬ 更换 PVS2后直接投入
液氮保存 1 dꎻ 再将胚性愈伤组织块置于 37℃恒温水浴中化冻 3 minꎬ 然后用 MS +2 mg / L TDZ +1 mg / L NAA +
1􀆰 2 mol / L蔗糖的液体培养基洗涤 3 次ꎬ 每次 10 minꎻ 洗涤后的胚性愈伤组块转入 MS+2 mg / L TDZ+1 mg / L
NAA固体培养基上先暗培养 7 d再转到 14 h / d 光周期中培养ꎮ 7 d 后胚性愈伤组织块开始恢复生长ꎬ 并且在
30 d 内分化出胚状体ꎻ 将胚状体再次转入 MS+2 mg / L TDZ +1 mg / L NAA固体培养基上ꎬ 60 d后形成完整的
植株ꎮ 红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为 60%ꎬ 并且红芽芋胚性愈伤组织冻后再
生苗没有发生形态性状和染色体数目的变异ꎬ 此结果为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源奠定了良好的
基础ꎮ
关键词: 江西铅山红芽芋ꎻ 胚性愈伤组织ꎻ 包埋玻璃化ꎻ 超低温保存
中图分类号: S632􀆰 3ꎻ Q943􀆰 1          文献标识码: A          文章编号: 2095 ̄0837(2014)01 ̄0080 ̄08
      收稿日期: 2013 ̄ 06 ̄ 04ꎬ 修回日期: 2013 ̄ 08 ̄ 13ꎮ
  基金项目: 江西省科技厅 2012 年农业科技支撑项目 ( 20122BBF60126)ꎻ 2013 年度江西省高等学校科技落地计划项目
(KJLD13088)ꎮ
  作者简介: 洪森荣(1974-)ꎬ 男ꎬ 硕士ꎬ 副教授ꎬ 研究方向为植物生物技术(E ̄mail: hongsenrong@163􀆰 com)ꎮ
  ∗通讯作者(Author for correspondence. E ̄mail: yinminghua04@163􀆰 com)ꎮ
Cryopreservation of Jiangxi Yanshan Red Bud Taro Embryogenic
Calli by Encapsulation ̄vitrification
HONG Sen ̄Rongꎬ YIN Ming ̄Hua∗ꎬ WANG Ai ̄Ping
(College of Life Sciencesꎬ Shangrao Normal Universityꎬ Shangraoꎬ Jiangxi 334001ꎬ China)
Abstract: To ensure the long ̄term conservation of Jiangxi Yanshan red bud taro (Colocasia
esculenta L􀆰 Schott var􀆰 cormosus ‘Hongyayu’) germplasm resourceꎬ the effect of the
cryopreservation process by encapsulation ̄vitrification on cell viability and calli survival was
studied using embryogenic calliꎬ and the cryopreservation system was optimized􀆰 About
0􀆰 2 g of embryogenic calli were encapsulated into alginate ̄gel beads and then precultured in
liquid MS medium supplemented with 2 mg / L TDZꎬ 1 mg / L NAA and 0􀆰 75 mol / L sucrose
and maintained under a 14 h photoperiod at 25℃ for 1 d􀆰 Precultured encapsulated
embryogenic calli were loaded with a mixture of 2 mol / L glycerol plus 0􀆰 4 mol / L sucrose for
40 min at 25℃ and then dehydrated with PVS2 at 25℃ for 30 min􀆰 The encapsulated and
dehydrated embryogenic calli were plunged directly into liquid nitrogen (LN) for 1 d􀆰 After
rapidly thawing in a 37℃ water bath for 3 minꎬ the embryogenic calli were washed three times
with liquid MS medium supplemented with 2 mg / L TDZꎬ 1 mg / L NAA and 1􀆰 2 mol / L sucrose
for 10 min at 25℃ꎬ and were post ̄cultured on solidified MS medium supplemented with 2 mg / L
TDZ and 1 mg / L NAA in the dark for 7 days and then transferred to a 14 h photoperiod􀆰
Successfully vitrified and warmed embryogenic calli resumed growth within a week and
differentiated embryoids within 30 days􀆰 Embryoids were transferred onto fresh solidified MS
medium supplemented with 2 mg / L TDZ and 1 mg / L NAA under a 14 h photoperiod to
develop into whole plantlets within 2 months of culture􀆰 The average survival rate of the
embryogenic calli after freezing was about 60%􀆰 Plantlets regenerated from cryopreserved
embryogenic calli had no morphological and chromosomal variationꎬ laying a good foundation
for the long ̄term safe storage of Jiangxi Yanshan red bud taro germplasm resources.
Key words: Jiangxi Yanshan red bud taroꎻ Embryogenic calliꎻ Encapsulation ̄vitrificationꎻ
Cryopreservation
芋头(Colocasia esculenta (L􀆰 ) Schott)是天
南星科(Araceae)多年生宿根草本植物ꎬ 具有较高
的营养和医疗保健价值ꎬ 现已成为我国出口创汇的
重要蔬菜ꎮ 芋头按种芽的颜色可分为红芽芋、 白荷
芋和紫荷芋 3 个品种[1]ꎮ 红芽芋(Colocasia escu ̄
lenta L􀆰 Schott var􀆰 cormosus ‘Hongyayu’)是江
西省铅山县传统优势产品ꎬ 其碳水化合物含量较
高ꎬ 脂肪含量较低ꎬ 蛋白质、 维生素及矿物质元素
含量丰富ꎬ 营养价值高ꎬ 具有良好的食用价值和开
发前景[2]ꎮ 江西铅山红芽芋种植历史悠久[3]ꎬ 2007
年它已获得国家无公害绿色食品证书ꎬ 并被中国绿
色食品委员会和农业部命名为“红芽芋全国绿色食
品标准化生产基地县” [4]ꎻ 2012 年铅山县红芽芋
种植面积发展到 6800 hm2ꎬ 该县也因此成为华东
地区规模最大的红芽芋基地ꎮ 但目前ꎬ 江西铅山红
芽芋种质资源保存仍采用大田保种的方法ꎬ 不仅需
要投入大量的人力、 物力和财力ꎬ 而且还不可避免
地会受到各种自然灾害(如病虫害、 干旱、 低温
等)和人为失误(疏于管理、 挂错标签等)的影响ꎬ
最终可能造成江西铅山红芽芋特有种质的遗失或混
杂ꎮ 因此ꎬ 探索江西铅山红芽芋种质资源超低温保
存的方法具有十分重要的意义ꎮ
体细胞胚状体发生途径是植物再生的一种有
效途径ꎬ 它可以在短时间内萌发出大量的体细胞
胚应用于生产[5] ꎮ 同时ꎬ 一个成熟的再生体系是
转基因的重要基础ꎬ 一个良好的受体系统更是实
现转基因的重要前提ꎬ 胚性愈伤组织就是一种良
好的转基因受体[6] ꎮ 然而有研究表明ꎬ 组织细胞
在不断的再培养过程中ꎬ 会发生染色体和基因型
的变异ꎬ 如产生多倍体、 非整倍体、 染色体消失
及基因突变等现象[7] ꎮ 超低温保存技术是目前唯
一可行的、 不需继代的种质资源长期保存方
式[8] ꎮ 超低温保存是指在-196℃(液氮)下保存
植物材料ꎬ 可以降低甚至完全抑制植物材料生活
力及基因变异可能性ꎬ 因此能够保持植物材料的
遗传稳定性[9] ꎮ
近年来出现的包埋玻璃化法是在玻璃化法和包
埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的
新技术ꎬ 它兼容了两者保存种质资源的优点ꎬ 显示
了巨大的应用潜力[10]ꎮ 包埋玻璃化法具有能同时
处理大量材料、 对材料的毒害作用较小、 处理后材
料恢复生长快及成芽率高等优点[11]ꎬ 在国内已成
功应用于怀山药[12]、 怀地黄[13]和甜柿[14]等作物ꎮ
目前ꎬ 关于芋头的超低温保存报道较少ꎮ Taka ̄
gi等[15]和 Rajnesh等[16ꎬ17]分别报道了芋头茎尖的
玻璃化超低温保存ꎬ 在国内尚无芋头超低温保存的
报道ꎬ 也未见红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超
低温保存的研究ꎮ 本文以江西铅山红芽芋的胚性愈
伤组织为对象ꎬ 研究了包埋玻璃化冻存过程中各因
素对细胞活力和愈伤组织成活率的影响ꎬ 拟建立江
西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存
体系ꎬ 为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源ꎬ
以及进一步建立其遗传转化体系和定向改良江西铅
山红芽芋种质奠定良好的基础ꎮ
1  材料和方法
1􀆰 1  材料
江西铅山红芽芋 ( Colocasia esculenta L􀆰
Schott var􀆰 cormosus ‘Hongyayu’)脱毒苗(由江
西省江天农业科技有限公司提供)ꎮ
18  第 1期                  洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
1􀆰 2  方法
1􀆰 2􀆰 1  胚性愈伤组织诱导
将江西铅山红芽芋脱毒苗的球茎切成 1~2 mm
厚ꎬ 分别接种到诱导培养基上ꎮ 诱导培养基为
MS +2 mg / L TDZ+1 mg / L 2ꎬ4 ̄D+30 g / L蔗糖 +
7 g / L琼脂ꎬ pH 5􀆰 8~6􀆰 0ꎮ 暗培养ꎬ 温度为 25 ±
1℃ꎮ 每天观察愈伤组织诱导情况ꎬ 记录愈伤组织
出现的时间、 数量、 颜色及其生长情况ꎮ 60 d 后ꎬ
选取浅黄色果冻状的胚性愈伤组织继代 2次ꎬ 每次
30 dꎮ
1􀆰 2􀆰 2  胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存程序
参照 Hirai和 Sakai[18]的方法进行改良ꎮ 包埋
过程: (1)温度条件为 25±1℃ꎬ 将约 0􀆰 2 g 的红
芽芋胚性愈伤组织块转入含 2%海藻酸钠和
1 mol / L蔗糖的MS培养基中后ꎬ 再把包含胚性愈伤
组织的混合物滴入含有 0􀆰 1 mol / L CaCl2和1 mol / L
蔗糖的 MS 液体培养基中 30 minꎬ 以充分形成直
径约 4 mm的球形包埋珠(每个包埋珠含 1 个胚性
愈伤组织块)ꎻ (2)在无菌条件下ꎬ 取出包埋珠ꎬ
用 MS+2 mg / L TDZ +1 mg / L NAA液体培养基洗
涤并用无菌滤纸片吸干后ꎬ 分别将包埋珠转入 MS +
2 mg / L TDZ +1 mg / L NAA +0~1 mol / L 蔗糖的
液体培养基中 (预培养 1 d)ꎬ 和 MS + 2 mg / L
TDZ +1 mg / L NAA +0􀆰 75 mol / L蔗糖的液体培养
基中(预培养 0 ~7 d)ꎮ 预培养条件: 光照时间
14 h / dꎬ 光照强度 1000 ~2000 lxꎬ 温度为 25 ±
1℃ꎻ (3)将包埋的红芽芋胚性愈伤组织块在 25 ±
1℃下转入装载液(MS +2 mol / L甘油 +0􀆰 4 mol / L
蔗糖)中 0~90 minꎻ (4)红芽芋胚性愈伤组织块装
载后ꎬ 再用玻璃化保护剂 PVS2 (30%甘油 +15%
乙二醇 +15% DMSO +0􀆰 4 mol / L蔗糖ꎬ pH 5􀆰 8)
在 0℃和 25℃下分别脱水 0~90 minꎻ (5)将包埋
脱水后的红芽芋胚性愈伤组织块转入冷冻管中ꎬ 更
换新的 PVS2ꎬ 然后再迅速置于液氮中保存 1 dꎻ
(6)从液氮中取出冷冻管ꎬ 分别放入 25℃、 30℃、
37℃和 42℃中水浴化冻 3 minꎻ (7)化冻后ꎬ 用MS+
2 mg/ L TDZ+1 mg / L NAA+0~1􀆰 6 mol / L蔗糖的
液体培养基将红芽芋胚性愈伤组织块在 25 ±1℃下
洗涤 3次ꎬ 每次 10 minꎮ
1􀆰 2􀆰 3  胚性愈伤组织细胞活力测定
采用 TTC 法[7]对洗涤后的红芽芋胚性愈伤组
织块进行细胞活力的测定ꎮ 细胞活力 =(超低温保
存后胚性愈伤组织 TTC值 /未超低温保存胚性愈伤
组织 TTC值)× 100%ꎮ
1􀆰 2􀆰 4  胚性愈伤组织再培养及成活率检测
将洗涤后的红芽芋胚性愈伤组织块转入分化培
养基 (MS +2 mg / L TDZ +1 mg / L NAA +30 g / L
蔗糖+7 g / L 琼脂)中进行恢复培养ꎬ 培养条件:
(1)光周期培养ꎮ 光照时间 14 h / dꎬ 光照强度
1000~ 2000 lxꎬ 温度为 25 ±1℃ꎻ (2)在 25 ±1℃
下暗培养 7 d后再转入光周期培养ꎮ 光周期培养条
件同(1)ꎮ 60 d后统计胚性愈伤组织块的成活率及
恢复生长的时间ꎮ 红芽芋胚性愈伤组织块的成活以
其能分化出胚状体为标志ꎮ 成活率 =(超低温保存
后胚性愈伤组织分化出胚状体的块数 /超低温保存
后胚性愈伤组织的总块数)× 100%ꎮ
1􀆰 2􀆰 5  超低温保存后胚性愈伤组织再生苗的形态
性状和染色体数目检测
以未进行超低温保存处理的红芽芋胚性愈伤组
织块为对照ꎬ 将超低温保存后的红芽芋胚性愈伤组
织块接入分化培养基ꎬ 30 d 后将分化出的胚状体
再次转入分化培养基ꎬ 分化培养基为 MS +2 mg / L
TDZ +1 mg / L NAA + 30 g / L 蔗糖 + 7 g / L 琼脂ꎮ
60 d后对分化出的再生苗进行形态性状和染色体
数目的检测ꎮ 形态性状包括株高、 芽数、 根数、 根
长等ꎮ 染色体数目的检测采用根尖压片的方法[19]ꎮ
1􀆰 2􀆰 6  统计方法
以上实验均设置 3 次重复ꎬ 所有数据表示为
Mean ±SDꎮ 在统计处理细胞活力和成活率的实验
数据时发现ꎬ 大部分数据不在 30%~70%范围内ꎬ
为提高显著性检验的精确度ꎬ 我们对本文细胞活力
和成活率数据进行反正弦转换ꎬ 然后用 SPSS19􀆰 0
软件进行 One ̄Way ANOVA 分析ꎬ 再进行 LSD 法
检验ꎮ
2  结果与分析
2􀆰 1  预培养对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存的影响
从表 1可知ꎬ 预培养对红芽芋胚性愈伤组织包
埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当用 0 ~
1 mol / L蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养 1 d时ꎬ
28 植 物 科 学 学 报 第 32卷 
表 1  预培养对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 1  Effect of preculture on the cryopreservation of embryogenic calli by
encapsulation ̄vitrification of Jiangxi Yanshan red bud taro
蔗糖浓度(mol / L) /预培养 1 d
Sucrose concentration
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
预培养时间(d) / 0􀆰 75 mol / L蔗糖
Preculture time
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
0 58􀆰 4 ±6􀆰 2 dD 16􀆰 4 ±3􀆰 6 dD 0 49􀆰 6 ±7􀆰 2 dE 15􀆰 5 ± 4􀆰 1 eE
0􀆰 25 75􀆰 6 ±8􀆰 6 cC 35􀆰 7 ±4􀆰 9 cC 1 94􀆰 5 ±2􀆰 3 aA 61􀆰 5 ± 6􀆰 3 aA
0􀆰 5 82􀆰 9 ±6􀆰 9 bB 54􀆰 6 ±6􀆰 5 bB 3 86􀆰 4 ±9􀆰 2 bBC 50􀆰 9 ± 6􀆰 4 bBC
0􀆰 75 92􀆰 5 ±3􀆰 6 aA 63􀆰 8 ±5􀆰 8 aA 5 81􀆰 5 ±7􀆰 5 bCD 43􀆰 7 ± 5􀆰 8 cC
1 84􀆰 6 ±5􀆰 5 bB 49􀆰 2 ±8􀆰 4 bB 7 75􀆰 4 ±5􀆰 9 cD 32􀆰 9 ±4􀆰 9 dD
    注: 同一列中大、 小写字母分别表示在 0􀆰 01和 0􀆰 05水平上的差异性ꎬ 下同ꎮ
    Note: Capital and small letters in the same volume refer to significance at the 0􀆰 01 and 0􀆰 05 levelꎬ respectively. The same below.
结果表明ꎬ 随着蔗糖浓度的提高ꎬ 红芽芋胚性愈伤
组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加ꎬ 但当蔗
糖浓度超过 0􀆰 75 mol / L时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的
冻后细胞活力和成活率显著下降ꎮ 当用 0􀆰 75 mol / L
蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养 0~7 d 时ꎬ 结
果表明ꎬ 预培养时间过长ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织
的冻后细胞活力和成活率显著下降ꎬ 适宜的预培
养时间为 1 dꎮ 因此ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤
组织包埋玻璃化超低温保存的适宜预培养条件为
0􀆰 75 mol / L蔗糖预培养 1 dꎮ
2􀆰 2  装载时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化
超低温保存的影响
从表 2可知ꎬ 装载时间对红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当用 2 mol / L
甘油和 0􀆰 4 mol / L蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织装载
0 ~90min时ꎬ结果表明ꎬ随着装载时间的延长ꎬ
表 2  装载时间对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 2  Effect of loading time on cryopreservation
of embryogenic calli by encapsulation ̄vitrification
of Jiangxi Yanshan red bud taro
装载时间(min)
Loading time
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
0 46􀆰 5 ±10􀆰 2 d 12􀆰 4 ±2􀆰 0 fD
10 75􀆰 6 ±9􀆰 8 cC 31􀆰 6 ±3􀆰 2 eC
20 81􀆰 4 ±8􀆰 6 bB 46􀆰 8 ±5􀆰 2 bcB
30 82􀆰 2 ±8􀆰 5 bB 50􀆰 8 ±8􀆰 2 bB
40 90􀆰 8 ±5􀆰 6 aA 63􀆰 0 ±6􀆰 4 aA
50 84􀆰 2 ±6􀆰 4 bB 52􀆰 1 ±5􀆰 1 bB
60 82􀆰 3 ±6􀆰 2 bB 44􀆰 5 ±5􀆰 4 cB
70 76􀆰 8 ±5􀆰 9 cC 42􀆰 6 ±6􀆰 7 cdB
80 74􀆰 2 ±4􀆰 9 cC 38􀆰 4 ±8􀆰 5 deC
90 65􀆰 6 ±4􀆰 7 dD 24􀆰 9 ±6􀆰 7 fD
红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显
著增加ꎬ 但当装载时间超过 40 min 时ꎬ 红芽芋胚
性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著下降ꎮ
因此ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超
低温保存的适宜装载时间为 40 minꎮ
2􀆰 3  脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化
超低温保存的影响
从表 3可知ꎬ 脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当用 PVS2
对红芽芋胚性愈伤组织脱水 0~90 min 时ꎬ 结果表
明ꎬ 随着脱水时间的延长ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的
冻后细胞活力和成活率均显著增加ꎮ 但当在 25℃
脱水时间超过 30 min 或在 0℃脱水时间超过
60 min时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力
和成活率均显著下降ꎮ 由于 25℃ PVS2脱水 30 min
的细胞活力和成活率大于 0℃ PVS2脱水 60 min的
细胞活力和成活率ꎬ 故江西铅山红芽芋胚性愈伤组
织包埋玻璃化超低温保存的适宜脱水条件为 25℃
PVS2脱水 30 minꎮ
2􀆰 4  化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化
超低温保存的影响
从表 4可知ꎬ 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 将红芽芋冻
后胚性愈伤组织置于不同温度(25℃、 30℃、 37℃
和 42℃)下进行水浴化冻并检测其细胞活力和成活
率ꎬ 结果表明ꎬ 随着化冻温度的增加ꎬ 红芽芋胚性
愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加ꎮ 但
当化冻温度超过 37℃时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的
冻后细胞活力和成活率均显著下降ꎮ 因此ꎬ 江西铅
山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适
宜化冻温度为 37℃ꎮ
38  第 1期                  洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
表 3  脱水时间对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 3  Effect of dehydration time on cryopreservation of embryogenic calli by encapsulation ̄vitrification of
Jiangxi Yanshan red bud taro
0℃脱水时间(min)
Dehydration time at 0℃
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
25℃脱水时间(min)
Dehydration time at 25℃
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
0 23􀆰 6 ±4􀆰 3 fE   0 ±0 fF 0 35􀆰 9 ±5􀆰 4 gE   0 ±0 gF
10 56􀆰 4 ±3􀆰 9 eD 26􀆰 4 ±2􀆰 9 eE 10 79􀆰 8 ±4􀆰 3 bB 49􀆰 4 ±5􀆰 6 bcB
20 68􀆰 4 ±6􀆰 5 dD 36􀆰 8 ±6􀆰 3 dD 20 84􀆰 5 ±8􀆰 5 bB 54􀆰 9 ±5􀆰 2 bB
30 72􀆰 3 ±4􀆰 2 cdCD 41􀆰 6 ±6􀆰 1 cC 30 95􀆰 6 ±6􀆰 4 aA 62􀆰 8 ±3􀆰 9 aA
40 79􀆰 2 ±8􀆰 2 bcB 43􀆰 2 ±5􀆰 3 cC 40 81􀆰 6 ±5􀆰 2 bcB 53􀆰 4 ±8􀆰 6 bB
50 82􀆰 6 ±9􀆰 6 bB 51􀆰 6 ±8􀆰 2 bB 50 76􀆰 3 ±6􀆰 7 cdB 49􀆰 8 ±7􀆰 2 bcB
60 92􀆰 8 ±3􀆰 2 aA 61􀆰 9 ±6􀆰 4 aA 60 71􀆰 2 ±9􀆰 6 deBC 45􀆰 6 ±9􀆰 3 cdBC
70 80􀆰 6 ±6􀆰 5 bB 49􀆰 6 ±8􀆰 4 bBC 70 64􀆰 5 ±4􀆰 3 eC 40􀆰 6 ±4􀆰 2 dC
80 75􀆰 5 ±5􀆰 3 cBC 42􀆰 5 ±4􀆰 2 cC 80 58􀆰 9 ±5􀆰 8 fD 32􀆰 5 ±5􀆰 8 efD
90 62􀆰 4 ±5􀆰 4 deD 41􀆰 2 ±5􀆰 0 cC 90 55􀆰 4 ±7􀆰 3 fD 24􀆰 8 ±8􀆰 1 fE 
表 4  化冻温度对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 4  Effect of thawing temperature on cryopreservation
of embryogenic calli by encapsulation ̄vitrification of
Jiangxi Yanshan red bud taro
化冻温度(℃)
Thawing temperature
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
25 79􀆰 6 ±9􀆰 6 bB 43􀆰 4 ±3􀆰 9 cC
30 81􀆰 9 ±5􀆰 9 bB 52􀆰 1 ±5􀆰 9 bB
37 93􀆰 6 ±3􀆰 6 aA 62􀆰 0 ±4􀆰 8 aA
42 84􀆰 7 ±6􀆰 8 bB 51􀆰 9 ±7􀆰 2 bB
2􀆰 5  洗涤液蔗糖浓度对红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存的影响
从表 5可知ꎬ 洗涤液蔗糖浓度对红芽芋胚性愈
伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 用
0~1􀆰 6 mol / L 蔗糖对红芽芋冻后胚性愈伤组织进
行洗涤并检测其细胞活力和成活率ꎬ 结果表明ꎬ 随
着蔗糖浓度的增加ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后细
胞活力和成活率均显著增加ꎮ 但当蔗糖浓度超过
1􀆰 2 mol / L时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活
力和成活率均显著下降ꎮ 因此ꎬ 江西铅山红芽芋胚
性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜洗涤条件
为 1􀆰 2 mol / L蔗糖洗涤 10 minꎮ
2􀆰 6  冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻
璃化超低温保存的影响
从表 6可知ꎬ 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤
组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当红芽
芋冻后胚性愈伤组织直接置于光周期中培养或先暗
培养 7 d再转到光周期中培养时ꎬ 结果表明ꎬ 先暗
培养 7 d再转到光周期中培养有利于提高红芽芋胚
性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率ꎮ 因此ꎬ 江西
铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的
适宜冻后培养条件为先暗培养 7 d再转到光周期中
培养ꎮ
表 5  洗涤液蔗糖浓度对江西铅山红芽芋胚性
愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 5  Effect of sucrose concentration in washing
medium on cryopreservation of embryogenic
calli by encapsulation ̄vitrification of Jiangxi
Yanshan red bud taro
洗涤液蔗糖浓度(mol / L)
Sucrose concentration
in washing medium
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
0 76􀆰 5 ± 6􀆰 5 cC 45􀆰 6 ±9􀆰 6 cC
0􀆰 4 82􀆰 5 ± 6􀆰 2 bcBC 53􀆰 4 ±5􀆰 8 bB
0􀆰 8 86􀆰 4 ± 5􀆰 9 bB 56􀆰 3 ±8􀆰 4 bB
1􀆰 2 93􀆰 8 ± 2􀆰 6 aA 65􀆰 5 ±6􀆰 7 aA
1􀆰 6 81􀆰 9 ± 8􀆰 4 bcBC 57􀆰 2 ±10􀆰 2 bB
表 6  冻后培养条件对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存的影响
Table 6  Effect of culture condition after freezing on
cryopreservation of embryogenic calli by
encapsulation ̄vitrification of Jiangxi
Yanshan red bud taro
冻后培养条件
Culture condition after freezing
细胞活力(%)
Cell viability
成活率(%)
Survival rate
直接置于光周期下培养
Direct culture in photoperiod 86􀆰 5 ±9􀆰 6 bB 53􀆰 4 ±6􀆰 3 bB
先暗培养 7d再置于光周期下培养
Culture in dark for 7 dꎬ then in
photoperiod
92􀆰 5 ±2􀆰 6 aA 62􀆰 9 ±4􀆰 8 aA
48 植 物 科 学 学 报 第 32卷 
2􀆰 7  冻后胚性愈伤组织再生苗的形态性状和染色
体数目检测
对红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗与对照再生
苗的染色体数目进行检测发现ꎬ 两者染色体数目相
同(2n = 28)ꎮ 另外ꎬ 从表 7和图 1可知ꎬ 红芽芋
胚性愈伤组织冻后再生苗与对照再生苗在平均株
高、 平均芽数、 平均根数和平均根长等形态性状指
标上虽有差异ꎬ 但未达显著性水平(p > 0􀆰 05)ꎮ
这些结果表明ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存是可行的ꎬ 基本不会影响其遗传
稳定性ꎮ
表 7  超低温保存后江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
再生苗的形态性状和染色体数目检测
Table 7  Morphological traits and number of chromosomes
of regeneration plantlets of embryogenic calli after
cryopreservation of Jiangxi Yanshan red bud taro
形态性状和染色体数目
Morphological traits and
No􀆰 of chromosomes
对照再生苗
Regeneration
plantlet of CK
冻后胚性愈伤组织再生苗
Regeneration plantlet
of embryogenic calli
after cryopreservation
平均株高(cm)
Average plantlet height 5􀆰 8 ±2􀆰 0 aA 5􀆰 4 ±1􀆰 6 aA
平均芽数
Average bud number 3􀆰 6 ±1􀆰 0 aA 3􀆰 2 ±0􀆰 9 aA
平均根数
Average root number 4􀆰 5 ±1􀆰 3 aA 4􀆰 2 ±1􀆰 1 aA
平均根长(cm)
Average root length 4􀆰 6 ±0􀆰 8 aA 5􀆰 1 ±0􀆰 6 aA
染色体数目
Chromosome number 28 aA 28 aA
图 1  江西铅山红芽芋胚性愈伤组织再生苗
(左: 对照再生苗ꎻ 右: 冻后胚性愈伤组织再生苗)
Fig􀆰 1  Regeneration plantlets of embryogenic calli of
Jiangxi Yanshan red bud taro (Left: regeneration plantlet
of CKꎻ Right: regeneration plantlet of embryogenic
calli after cryopreservation)
3  讨论
包埋玻璃化超低温保存的基本程序一般包括预
培养、 装载、 脱水、 化冻、 洗涤及恢复培养等过
程ꎮ 影响植物种质包埋玻璃化超低温保存的因素很
多ꎬ 除材料本身外ꎬ 还有保存所用试剂的种类、 浓
度和处理时间等ꎮ 因此ꎬ 要进行红芽芋包埋玻璃化
超低温保存ꎬ 需对以上步骤的具体影响因子进行
优化ꎮ
预培养一般是使用高浓度的蔗糖对材料进行培
养ꎮ 甜柿休眠芽茎尖在含有 0􀆰 3 mol / L蔗糖的改良
MS培养基(KNO3和 NH4NO3减半)上预培养 1 dꎬ
其成活率接近 100%[14]ꎮ 怀地黄带芽茎段在 MS+
0􀆰 4 mol / L蔗糖 +50 g / L DMSO +10 g / L 乙酰胺
培养基中 4℃低温下预培养 3 dꎬ 成活率和再生率
分别为 66􀆰 93%和 26􀆰 67%[13]ꎮ 怀山药带芽茎段在
MS +0􀆰 1 mol / L 蔗糖 + 0􀆰 1 mol / L 甘油培养基中
4℃低温下预培养 3 dꎬ 成活率可达 64􀆰 29%[12]ꎮ
青岛百合茎尖在MS +0􀆰 4 mol / L蔗糖 +100 g / L海
藻糖 + 1 mg / L ABA 的培养基上预培养 3 dꎬ 用
TTC法检测存活率可达 67􀆰 5%[20]ꎮ 本实验结果表
明ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织在 25℃下转入
MS +2 mg / L TDZ +1 mg / L NAA +0􀆰 75 mol / L蔗
糖的培养基中于 14 h / d 光周期下预培养 1 dꎬ 细
胞活力和成活率也可达到 90%和 60%以上ꎮ
在预培养之后ꎬ 植物材料一般要用甘油和蔗糖
等混合物在 25℃下进行装载ꎬ 并且装载液的种类
和装载时间也因植物种类而不同ꎮ 当装载液为 MS +
1 mol / L蔗糖 +2 mol / L 甘油时ꎬ 高山红景天茎尖
适宜的装载时间为 60 min[21]ꎮ 怀山药带芽茎段最
适宜的装载液是MS+0􀆰 2 mol / L蔗糖+2 mol / L甘
油 +50 g / L DMSOꎬ 装载时间为 60 min[12]ꎮ 当装
载液为MS+0􀆰 9 mol / L蔗糖+2 mol / L甘油时ꎬ 树
莓茎尖适宜的装载时间为 90 min[22]ꎮ 本实验结果
表明ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的装载液是
2 mol / L甘油和 0􀆰 4 mol / L 蔗糖的 MS 混合物ꎬ 较
适宜的装载时间为 40 minꎮꎮ
玻璃化保护剂是保证植株再生的关键ꎮ 玻璃化
保护剂一般选择 PVS2ꎬ 其脱水温度和脱水时间对
愈伤组织成活率有较大影响ꎮ 高山红景天茎尖的玻
58  第 1期                  洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
璃化保护剂为改良的 PVS2(30%甘油+15%乙二
醇 + 15%二甲基亚砜 +15%聚乙二醇 +1 mol / L蔗
糖)ꎬ 适宜的脱水温度为 0℃ꎬ 脱水时间为 180 ~
210 min[21]ꎮ 怀地黄带芽茎段的玻璃化保护剂为
PVS2ꎬ 适宜的脱水温度为 0℃ꎬ 脱水时间为
30 min[13]ꎮ 怀山药带芽茎段的玻璃化保护剂为改
良的 PVS2 (30%甘油 +15%乙二醇 +10%二甲基
亚砜 +15%聚乙二醇 +0􀆰 4 mol / L 蔗糖)ꎬ 适宜的
脱水温度为 0℃ꎬ 脱水时间为 60 min[12]ꎮ 青岛百
合茎尖的玻璃化保护剂为 PVS2ꎬ 适宜的脱水温度
为 0℃ꎬ 脱水时间为60 min[20]ꎮ甜柿休眠芽茎尖的
玻璃化保护剂为 PVS2ꎬ 但其适宜的脱水温度为
25℃ꎬ 脱水时间为 120 min[14]ꎮ 沙生柽柳休眠茎
尖的玻璃化保护剂为改良的 PVS2 (40%甘油 +
0􀆰 4 mol / L蔗糖 +10%聚乙二醇+5%二甲基亚砜)ꎬ
适宜的脱水温度为 25℃ꎬ 脱水时间为 20 min[23]ꎮ
灰杨休眠茎尖的玻璃化保护剂为改良的 PVS2
(40%甘油 +0􀆰 4 mol / L蔗糖 +10%聚乙二醇 +5%
二甲基亚砜)ꎬ 适宜的脱水温度为 25℃ꎬ 脱水时间
为 20 min[24]ꎮ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻
璃化保护剂是 PVS2ꎬ 适宜的脱水温度为 25℃ꎬ 脱
水时间为 30 minꎬ 此结果与甜柿、 沙生柽柳和灰
杨的实验结果相类似ꎮ
冻存材料在保存终止后需快速化冻ꎬ 以防止由
于次生结冰对组织和细胞造成的伤害ꎮ 一般来讲ꎬ
冻存材料在进行包埋玻璃化超低温保存后ꎬ 适宜的
化冻条件为 37 ~40℃水浴快速化冻ꎮ 甜柿休眠芽
茎尖[14]、 高山红景天茎尖[21]、 怀地黄带芽茎
段[13]、 怀山药带芽茎段[12]、 树莓茎尖[22]适宜的
化冻条件均为 40℃水浴快速化冻ꎮ 青岛百合茎尖
适宜的化冻条件为 38℃水浴快速化冻[20]ꎮ 本研究
江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的化冻条件为 37℃
水浴快速化冻ꎮ
冻存材料快速化冻后需利用高浓度的蔗糖溶液
洗去对细胞有毒害作用的 PVS2ꎬ 适宜的洗涤液蔗
糖浓度一般设置为 0􀆰 5 ~1􀆰 2 mol / Lꎮ 怀山药带芽
茎段适宜的洗涤液为 0􀆰 5 mol / L 蔗糖[12]ꎮ 高山红
景天茎尖[21]、 树莓茎尖[22]洗涤的适宜蔗糖浓度为
1 mol / Lꎮ 青岛百合茎尖[20]、 怀地黄带芽茎段[13]、
甜柿休眠芽茎尖[14]适宜的洗涤液为 1􀆰 2 mol / L 蔗
糖ꎮ 本研究中江西铅山红芽芋胚性愈伤组织洗涤的
适宜蔗糖浓度也为 1􀆰 2 mol / Lꎮ
化冻后包埋的茎尖比裸露茎尖较耐机械操作ꎬ
且不需除去包裹的褐藻酸钙ꎬ 将其直接转入基本培
养基上可进行恢复培养ꎬ 适宜的培养条件却是决定
包埋玻璃化超低温保存能否成功的因素之一ꎮ 怀山
药带芽茎段适宜的冻后培养条件是先暗培养 14 dꎬ
再转到光下培养[12]ꎮ 甜柿休眠芽茎尖适宜的冻后
培养条件是暗培养 3~5 d 后再转入光下培养[14]ꎮ
高山红景天茎尖适宜的冻后培养条件是先暗培养
2 dꎬ 再转到光下培养[21]ꎮ 灰杨休眠茎尖[24]和沙
生柽柳休眠茎尖[23]适宜的冻后培养条件是暗培养
1 d 后再转入光下培养ꎮ 怀地黄带芽茎段[13]和青
岛百合茎尖[20]适宜的冻后培养条件是先暗培养
7 dꎬ 再转到光下培养ꎬ 这与本研究江西铅山红芽
芋胚性愈伤组织适宜的冻后培养条件是一致的ꎮ 因
此ꎬ 在进行包埋玻璃化超低温保存后ꎬ 需对冻存材
料进行一定时间的暗培养ꎬ 促进其恢复生长ꎬ 提高
成活率和再生率ꎬ 究其原因ꎬ 可能是冻后黑暗培养
有利于修复材料在超低温保存期间所受到的冷冻伤
害[25]ꎮ
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(责任编辑: 刘艳玲)
78  第 1期                  洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存