全 文 ：植物科学学报　 ２０１４ꎬ ３２(１): ８０ ~ ８７
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 ３７２４ / ＳＰ􀆰 Ｊ􀆰 １１４２􀆰 ２０１４􀆰 １００８０
江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
洪森荣ꎬ 尹明华∗ꎬ 王艾平
(上饶师范学院生命科学学院ꎬ 江西上饶 ３３４００１)
摘　 要: 为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源ꎬ 本文以江西铅山红芽芋的胚性愈伤组织为对象ꎬ 研究了包埋
玻璃化冻存过程中各因素对细胞活力和愈伤组织成活率的影响ꎬ 优化建立了江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存体系ꎮ 将约 ０􀆰 ２ ｇ胚性愈伤组织块包埋成海藻酸钙凝胶珠后ꎬ 在２５℃下转入ＭＳ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ＋
１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ＋０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的培养基中于１４ ｈ / ｄ光周期下预培养１ ｄꎻ 预培养后的胚性愈伤组织块用 ２ ｍｏｌ / Ｌ
甘油和 ０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的混合物在 ２５℃下装载 ４０ ｍｉｎꎻ 采用 ＰＶＳ２在 ２５℃下脱水 ３０ ｍｉｎꎬ 更换 ＰＶＳ２后直接投入
液氮保存 １ ｄꎻ 再将胚性愈伤组织块置于 ３７℃恒温水浴中化冻 ３ ｍｉｎꎬ 然后用 ＭＳ ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ＋
１􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的液体培养基洗涤 ３ 次ꎬ 每次 １０ ｍｉｎꎻ 洗涤后的胚性愈伤组块转入 ＭＳ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ＋１ ｍｇ / Ｌ
ＮＡＡ固体培养基上先暗培养 ７ ｄ再转到 １４ ｈ / ｄ 光周期中培养ꎮ ７ ｄ 后胚性愈伤组织块开始恢复生长ꎬ 并且在
３０ ｄ 内分化出胚状体ꎻ 将胚状体再次转入 ＭＳ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ固体培养基上ꎬ ６０ ｄ后形成完整的
植株ꎮ 红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存后的平均成活率约为 ６０％ꎬ 并且红芽芋胚性愈伤组织冻后再
生苗没有发生形态性状和染色体数目的变异ꎬ 此结果为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源奠定了良好的
基础ꎮ
关键词: 江西铅山红芽芋ꎻ 胚性愈伤组织ꎻ 包埋玻璃化ꎻ 超低温保存
中图分类号: Ｓ６３２􀆰 ３ꎻ Ｑ９４３􀆰 １　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０１￣００８０￣０８
　 　 　 收稿日期: ２０１３￣ ０６￣ ０４ꎬ 修回日期: ２０１３￣ ０８￣ １３ꎮ
　 基金项目: 江西省科技厅 ２０１２ 年农业科技支撑项目 ( ２０１２２ＢＢＦ６０１２６)ꎻ ２０１３ 年度江西省高等学校科技落地计划项目
(ＫＪＬＤ１３０８８)ꎮ
　 作者简介: 洪森荣(１９７４－)ꎬ 男ꎬ 硕士ꎬ 副教授ꎬ 研究方向为植物生物技术(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｏｎｇｓｅｎｒｏｎｇ＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ. Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｉｎｍｉｎｇｈｕａ０４＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ Ｒｅｄ Ｂｕｄ Ｔａｒｏ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
Ｃａｌｌｉ ｂｙ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＨＯＮＧ Ｓｅｎ￣Ｒｏｎｇꎬ ＹＩＮ Ｍｉｎｇ￣Ｈｕａ∗ꎬ ＷＡＮＧ Ａｉ￣Ｐｉｎｇ
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｈａｎｇｒａｏ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈａｎｇｒａｏꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ３３４００１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｔｈｅ ｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ (Ｃｏｌｏｃａｓｉａ
ｅｓｃｕｌｅｎｔａ Ｌ􀆰 Ｓｃｈｏｔｔ ｖａｒ􀆰 ｃｏｒｍｏｓｕｓ ‘Ｈｏｎｇｙａｙｕ’) ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅꎬ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃａｌｌｉ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｗａｓ
ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ􀆰 Ａｂｏｕｔ
０􀆰 ２ ｇ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｌｇｉｎａｔｅ￣ｇｅｌ ｂｅａｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ
ｌｉｑｕｉｄ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺꎬ １ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ａｎｄ ０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ
ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ａ １４ ｈ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ａｔ ２５℃ ｆｏｒ １ ｄ􀆰 Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ２ ｍｏｌ / Ｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｌｕｓ ０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｆｏｒ
４０ ｍｉｎ ａｔ ２５℃ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＶＳ２ ａｔ ２５℃ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ􀆰 Ｔｈｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｄ
ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｐｌｕｎｇｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ (ＬＮ) ｆｏｒ １ ｄ􀆰 Ａｆｔｅｒ
ｒａｐｉｄｌｙ ｔｈａｗｉｎｇ ｉｎ ａ ３７℃ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｆｏｒ ３ ｍｉｎꎬ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｗａｓｈｅｄ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ
ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺꎬ １ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ａｎｄ １􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ
ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ａｔ ２５℃ꎬ ａｎｄ ｗｅｒｅ ｐｏｓｔ￣ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ２ ｍｇ / Ｌ
ＴＤＺ ａｎｄ １ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｒｋ ｆｏｒ ７ ｄａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａ １４ ｈ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ􀆰
Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｗａｒｍｅｄ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｒｅｓｕｍｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｗｅｅｋ ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｉｄｓ ｗｉｔｈｉｎ ３０ ｄａｙｓ􀆰 Ｅｍｂｒｙｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｏｎｔｏ ｆｒｅｓｈ ｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄ ＭＳ
ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ａｎｄ １ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ｕｎｄｅｒ ａ １４ ｈ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ｔｏ
ｄｅｖｅｌｏｐ ｉｎｔｏ ｗｈｏｌｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ２ ｍｏｎｔｈｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ􀆰 Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ６０％􀆰 Ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｈａｄ ｎｏ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎꎬ ｌａｙｉｎｇ ａ ｇｏｏｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍ ｓａｆｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏꎻ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉꎻ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ
Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
芋头(Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ (Ｌ􀆰 ) Ｓｃｈｏｔｔ)是天
南星科(Ａｒａｃｅａｅ)多年生宿根草本植物ꎬ 具有较高
的营养和医疗保健价值ꎬ 现已成为我国出口创汇的
重要蔬菜ꎮ 芋头按种芽的颜色可分为红芽芋、 白荷
芋和紫荷芋 ３ 个品种[１]ꎮ 红芽芋(Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕ￣
ｌｅｎｔａ Ｌ􀆰 Ｓｃｈｏｔｔ ｖａｒ􀆰 ｃｏｒｍｏｓｕｓ ‘Ｈｏｎｇｙａｙｕ’)是江
西省铅山县传统优势产品ꎬ 其碳水化合物含量较
高ꎬ 脂肪含量较低ꎬ 蛋白质、 维生素及矿物质元素
含量丰富ꎬ 营养价值高ꎬ 具有良好的食用价值和开
发前景[２]ꎮ 江西铅山红芽芋种植历史悠久[３]ꎬ ２００７
年它已获得国家无公害绿色食品证书ꎬ 并被中国绿
色食品委员会和农业部命名为“红芽芋全国绿色食
品标准化生产基地县” [４]ꎻ ２０１２ 年铅山县红芽芋
种植面积发展到 ６８００ ｈｍ２ꎬ 该县也因此成为华东
地区规模最大的红芽芋基地ꎮ 但目前ꎬ 江西铅山红
芽芋种质资源保存仍采用大田保种的方法ꎬ 不仅需
要投入大量的人力、 物力和财力ꎬ 而且还不可避免
地会受到各种自然灾害(如病虫害、 干旱、 低温
等)和人为失误(疏于管理、 挂错标签等)的影响ꎬ
最终可能造成江西铅山红芽芋特有种质的遗失或混
杂ꎮ 因此ꎬ 探索江西铅山红芽芋种质资源超低温保
存的方法具有十分重要的意义ꎮ
体细胞胚状体发生途径是植物再生的一种有
效途径ꎬ 它可以在短时间内萌发出大量的体细胞
胚应用于生产[５] ꎮ 同时ꎬ 一个成熟的再生体系是
转基因的重要基础ꎬ 一个良好的受体系统更是实
现转基因的重要前提ꎬ 胚性愈伤组织就是一种良
好的转基因受体[６] ꎮ 然而有研究表明ꎬ 组织细胞
在不断的再培养过程中ꎬ 会发生染色体和基因型
的变异ꎬ 如产生多倍体、 非整倍体、 染色体消失
及基因突变等现象[７] ꎮ 超低温保存技术是目前唯
一可行的、 不需继代的种质资源长期保存方
式[８] ꎮ 超低温保存是指在－１９６℃(液氮)下保存
植物材料ꎬ 可以降低甚至完全抑制植物材料生活
力及基因变异可能性ꎬ 因此能够保持植物材料的
遗传稳定性[９] ꎮ
近年来出现的包埋玻璃化法是在玻璃化法和包
埋脱水法基础上发展起来的超低温保存植物种质的
新技术ꎬ 它兼容了两者保存种质资源的优点ꎬ 显示
了巨大的应用潜力[１０]ꎮ 包埋玻璃化法具有能同时
处理大量材料、 对材料的毒害作用较小、 处理后材
料恢复生长快及成芽率高等优点[１１]ꎬ 在国内已成
功应用于怀山药[１２]、 怀地黄[１３]和甜柿[１４]等作物ꎮ
目前ꎬ 关于芋头的超低温保存报道较少ꎮ Ｔａｋａ￣
ｇｉ等[１５]和 Ｒａｊｎｅｓｈ等[１６ꎬ１７]分别报道了芋头茎尖的
玻璃化超低温保存ꎬ 在国内尚无芋头超低温保存的
报道ꎬ 也未见红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超
低温保存的研究ꎮ 本文以江西铅山红芽芋的胚性愈
伤组织为对象ꎬ 研究了包埋玻璃化冻存过程中各因
素对细胞活力和愈伤组织成活率的影响ꎬ 拟建立江
西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存
体系ꎬ 为长期安全保存江西铅山红芽芋种质资源ꎬ
以及进一步建立其遗传转化体系和定向改良江西铅
山红芽芋种质奠定良好的基础ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
江西铅山红芽芋 ( Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ Ｌ􀆰
Ｓｃｈｏｔｔ ｖａｒ􀆰 ｃｏｒｍｏｓｕｓ ‘Ｈｏｎｇｙａｙｕ’)脱毒苗(由江
西省江天农业科技有限公司提供)ꎮ
１８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 胚性愈伤组织诱导
将江西铅山红芽芋脱毒苗的球茎切成 １~２ ｍｍ
厚ꎬ 分别接种到诱导培养基上ꎮ 诱导培养基为
ＭＳ ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ＋１ ｍｇ / Ｌ ２ꎬ４￣Ｄ＋３０ ｇ / Ｌ蔗糖 ＋
７ ｇ / Ｌ琼脂ꎬ ｐＨ ５􀆰 ８~６􀆰 ０ꎮ 暗培养ꎬ 温度为 ２５ ±
１℃ꎮ 每天观察愈伤组织诱导情况ꎬ 记录愈伤组织
出现的时间、 数量、 颜色及其生长情况ꎮ ６０ ｄ 后ꎬ
选取浅黄色果冻状的胚性愈伤组织继代 ２次ꎬ 每次
３０ ｄꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存程序
参照 Ｈｉｒａｉ和 Ｓａｋａｉ[１８]的方法进行改良ꎮ 包埋
过程: (１)温度条件为 ２５±１℃ꎬ 将约 ０􀆰 ２ ｇ 的红
芽芋胚性愈伤组织块转入含 ２％海藻酸钠和
１ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的ＭＳ培养基中后ꎬ 再把包含胚性愈伤
组织的混合物滴入含有 ０􀆰 １ ｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２和１ ｍｏｌ / Ｌ
蔗糖的 ＭＳ 液体培养基中 ３０ ｍｉｎꎬ 以充分形成直
径约 ４ ｍｍ的球形包埋珠(每个包埋珠含 １ 个胚性
愈伤组织块)ꎻ (２)在无菌条件下ꎬ 取出包埋珠ꎬ
用 ＭＳ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ液体培养基洗
涤并用无菌滤纸片吸干后ꎬ 分别将包埋珠转入 ＭＳ ＋
２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ＋０~１ ｍｏｌ / Ｌ 蔗糖的
液体培养基中 (预培养 １ ｄ)ꎬ 和 ＭＳ ＋ ２ ｍｇ / Ｌ
ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ＋０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的液体培养
基中(预培养 ０ ~７ ｄ)ꎮ 预培养条件: 光照时间
１４ ｈ / ｄꎬ 光照强度 １０００ ~２０００ ｌｘꎬ 温度为 ２５ ±
１℃ꎻ (３)将包埋的红芽芋胚性愈伤组织块在 ２５ ±
１℃下转入装载液(ＭＳ ＋２ ｍｏｌ / Ｌ甘油 ＋０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ
蔗糖)中 ０~９０ ｍｉｎꎻ (４)红芽芋胚性愈伤组织块装
载后ꎬ 再用玻璃化保护剂 ＰＶＳ２ (３０％甘油 ＋１５％
乙二醇 ＋１５％ ＤＭＳＯ ＋０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖ꎬ ｐＨ ５􀆰 ８)
在 ０℃和 ２５℃下分别脱水 ０~９０ ｍｉｎꎻ (５)将包埋
脱水后的红芽芋胚性愈伤组织块转入冷冻管中ꎬ 更
换新的 ＰＶＳ２ꎬ 然后再迅速置于液氮中保存 １ ｄꎻ
(６)从液氮中取出冷冻管ꎬ 分别放入 ２５℃、 ３０℃、
３７℃和 ４２℃中水浴化冻 ３ ｍｉｎꎻ (７)化冻后ꎬ 用ＭＳ＋
２ ｍｇ/ Ｌ ＴＤＺ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ＋０~１􀆰 ６ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的
液体培养基将红芽芋胚性愈伤组织块在 ２５ ±１℃下
洗涤 ３次ꎬ 每次 １０ ｍｉｎꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 胚性愈伤组织细胞活力测定
采用 ＴＴＣ 法[７]对洗涤后的红芽芋胚性愈伤组
织块进行细胞活力的测定ꎮ 细胞活力 ＝(超低温保
存后胚性愈伤组织 ＴＴＣ值 /未超低温保存胚性愈伤
组织 ＴＴＣ值)× １００％ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 胚性愈伤组织再培养及成活率检测
将洗涤后的红芽芋胚性愈伤组织块转入分化培
养基 (ＭＳ ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ＋３０ ｇ / Ｌ
蔗糖＋７ ｇ / Ｌ 琼脂)中进行恢复培养ꎬ 培养条件:
(１)光周期培养ꎮ 光照时间 １４ ｈ / ｄꎬ 光照强度
１０００~ ２０００ ｌｘꎬ 温度为 ２５ ±１℃ꎻ (２)在 ２５ ±１℃
下暗培养 ７ ｄ后再转入光周期培养ꎮ 光周期培养条
件同(１)ꎮ ６０ ｄ后统计胚性愈伤组织块的成活率及
恢复生长的时间ꎮ 红芽芋胚性愈伤组织块的成活以
其能分化出胚状体为标志ꎮ 成活率 ＝(超低温保存
后胚性愈伤组织分化出胚状体的块数 /超低温保存
后胚性愈伤组织的总块数)× １００％ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５　 超低温保存后胚性愈伤组织再生苗的形态
性状和染色体数目检测
以未进行超低温保存处理的红芽芋胚性愈伤组
织块为对照ꎬ 将超低温保存后的红芽芋胚性愈伤组
织块接入分化培养基ꎬ ３０ ｄ 后将分化出的胚状体
再次转入分化培养基ꎬ 分化培养基为 ＭＳ ＋２ ｍｇ / Ｌ
ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ＋ ３０ ｇ / Ｌ 蔗糖 ＋ ７ ｇ / Ｌ 琼脂ꎮ
６０ ｄ后对分化出的再生苗进行形态性状和染色体
数目的检测ꎮ 形态性状包括株高、 芽数、 根数、 根
长等ꎮ 染色体数目的检测采用根尖压片的方法[１９]ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ６　 统计方法
以上实验均设置 ３ 次重复ꎬ 所有数据表示为
Ｍｅａｎ ±ＳＤꎮ 在统计处理细胞活力和成活率的实验
数据时发现ꎬ 大部分数据不在 ３０％~７０％范围内ꎬ
为提高显著性检验的精确度ꎬ 我们对本文细胞活力
和成活率数据进行反正弦转换ꎬ 然后用 ＳＰＳＳ１９􀆰 ０
软件进行 Ｏｎｅ￣Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ 分析ꎬ 再进行 ＬＳＤ 法
检验ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 预培养对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存的影响
从表 １可知ꎬ 预培养对红芽芋胚性愈伤组织包
埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当用 ０ ~
１ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养 １ ｄ时ꎬ
２８ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
表 １　 预培养对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ
ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
蔗糖浓度(ｍｏｌ / Ｌ) /预培养 １ ｄ
Ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
预培养时间(ｄ) / ０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖
Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
０ ５８􀆰 ４ ±６􀆰 ２ ｄＤ １６􀆰 ４ ±３􀆰 ６ ｄＤ ０ ４９􀆰 ６ ±７􀆰 ２ ｄＥ １５􀆰 ５ ± ４􀆰 １ ｅＥ
０􀆰 ２５ ７５􀆰 ６ ±８􀆰 ６ ｃＣ ３５􀆰 ７ ±４􀆰 ９ ｃＣ １ ９４􀆰 ５ ±２􀆰 ３ ａＡ ６１􀆰 ５ ± ６􀆰 ３ ａＡ
０􀆰 ５ ８２􀆰 ９ ±６􀆰 ９ ｂＢ ５４􀆰 ６ ±６􀆰 ５ ｂＢ ３ ８６􀆰 ４ ±９􀆰 ２ ｂＢＣ ５０􀆰 ９ ± ６􀆰 ４ ｂＢＣ
０􀆰 ７５ ９２􀆰 ５ ±３􀆰 ６ ａＡ ６３􀆰 ８ ±５􀆰 ８ ａＡ ５ ８１􀆰 ５ ±７􀆰 ５ ｂＣＤ ４３􀆰 ７ ± ５􀆰 ８ ｃＣ
１ ８４􀆰 ６ ±５􀆰 ５ ｂＢ ４９􀆰 ２ ±８􀆰 ４ ｂＢ ７ ７５􀆰 ４ ±５􀆰 ９ ｃＤ ３２􀆰 ９ ±４􀆰 ９ ｄＤ
　 　 注: 同一列中大、 小写字母分别表示在 ０􀆰 ０１和 ０􀆰 ０５水平上的差异性ꎬ 下同ꎮ
　 　 Ｎｏｔｅ: Ｃａｐｉｔａｌ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｆｅｒ ｔｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ０􀆰 ０１ ａｎｄ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
结果表明ꎬ 随着蔗糖浓度的提高ꎬ 红芽芋胚性愈伤
组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加ꎬ 但当蔗
糖浓度超过 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的
冻后细胞活力和成活率显著下降ꎮ 当用 ０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ
蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养 ０~７ ｄ 时ꎬ 结
果表明ꎬ 预培养时间过长ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织
的冻后细胞活力和成活率显著下降ꎬ 适宜的预培
养时间为 １ ｄꎮ 因此ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤
组织包埋玻璃化超低温保存的适宜预培养条件为
０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖预培养 １ ｄꎮ
２􀆰 ２　 装载时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化
超低温保存的影响
从表 ２可知ꎬ 装载时间对红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当用 ２ ｍｏｌ / Ｌ
甘油和 ０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织装载
０ ~９０ｍｉｎ时ꎬ结果表明ꎬ随着装载时间的延长ꎬ
表 ２　 装载时间对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏａｄｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
装载时间(ｍｉｎ)
Ｌｏａｄｉｎｇ ｔｉｍｅ
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
０ ４６􀆰 ５ ±１０􀆰 ２ ｄ １２􀆰 ４ ±２􀆰 ０ ｆＤ
１０ ７５􀆰 ６ ±９􀆰 ８ ｃＣ ３１􀆰 ６ ±３􀆰 ２ ｅＣ
２０ ８１􀆰 ４ ±８􀆰 ６ ｂＢ ４６􀆰 ８ ±５􀆰 ２ ｂｃＢ
３０ ８２􀆰 ２ ±８􀆰 ５ ｂＢ ５０􀆰 ８ ±８􀆰 ２ ｂＢ
４０ ９０􀆰 ８ ±５􀆰 ６ ａＡ ６３􀆰 ０ ±６􀆰 ４ ａＡ
５０ ８４􀆰 ２ ±６􀆰 ４ ｂＢ ５２􀆰 １ ±５􀆰 １ ｂＢ
６０ ８２􀆰 ３ ±６􀆰 ２ ｂＢ ４４􀆰 ５ ±５􀆰 ４ ｃＢ
７０ ７６􀆰 ８ ±５􀆰 ９ ｃＣ ４２􀆰 ６ ±６􀆰 ７ ｃｄＢ
８０ ７４􀆰 ２ ±４􀆰 ９ ｃＣ ３８􀆰 ４ ±８􀆰 ５ ｄｅＣ
９０ ６５􀆰 ６ ±４􀆰 ７ ｄＤ ２４􀆰 ９ ±６􀆰 ７ ｆＤ
红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显
著增加ꎬ 但当装载时间超过 ４０ ｍｉｎ 时ꎬ 红芽芋胚
性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著下降ꎮ
因此ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超
低温保存的适宜装载时间为 ４０ ｍｉｎꎮ
２􀆰 ３　 脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化
超低温保存的影响
从表 ３可知ꎬ 脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当用 ＰＶＳ２
对红芽芋胚性愈伤组织脱水 ０~９０ ｍｉｎ 时ꎬ 结果表
明ꎬ 随着脱水时间的延长ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的
冻后细胞活力和成活率均显著增加ꎮ 但当在 ２５℃
脱水时间超过 ３０ ｍｉｎ 或在 ０℃脱水时间超过
６０ ｍｉｎ时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活力
和成活率均显著下降ꎮ 由于 ２５℃ ＰＶＳ２脱水 ３０ ｍｉｎ
的细胞活力和成活率大于 ０℃ ＰＶＳ２脱水 ６０ ｍｉｎ的
细胞活力和成活率ꎬ 故江西铅山红芽芋胚性愈伤组
织包埋玻璃化超低温保存的适宜脱水条件为 ２５℃
ＰＶＳ２脱水 ３０ ｍｉｎꎮ
２􀆰 ４　 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化
超低温保存的影响
从表 ４可知ꎬ 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 将红芽芋冻
后胚性愈伤组织置于不同温度(２５℃、 ３０℃、 ３７℃
和 ４２℃)下进行水浴化冻并检测其细胞活力和成活
率ꎬ 结果表明ꎬ 随着化冻温度的增加ꎬ 红芽芋胚性
愈伤组织的冻后细胞活力和成活率均显著增加ꎮ 但
当化冻温度超过 ３７℃时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的
冻后细胞活力和成活率均显著下降ꎮ 因此ꎬ 江西铅
山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适
宜化冻温度为 ３７℃ꎮ
３８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
表 ３　 脱水时间对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
０℃脱水时间(ｍｉｎ)
Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｔ ０℃
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
２５℃脱水时间(ｍｉｎ)
Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｔ ２５℃
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
０ ２３􀆰 ６ ±４􀆰 ３ ｆＥ 　 ０ ±０ ｆＦ ０ ３５􀆰 ９ ±５􀆰 ４ ｇＥ 　 ０ ±０ ｇＦ
１０ ５６􀆰 ４ ±３􀆰 ９ ｅＤ ２６􀆰 ４ ±２􀆰 ９ ｅＥ １０ ７９􀆰 ８ ±４􀆰 ３ ｂＢ ４９􀆰 ４ ±５􀆰 ６ ｂｃＢ
２０ ６８􀆰 ４ ±６􀆰 ５ ｄＤ ３６􀆰 ８ ±６􀆰 ３ ｄＤ ２０ ８４􀆰 ５ ±８􀆰 ５ ｂＢ ５４􀆰 ９ ±５􀆰 ２ ｂＢ
３０ ７２􀆰 ３ ±４􀆰 ２ ｃｄＣＤ ４１􀆰 ６ ±６􀆰 １ ｃＣ ３０ ９５􀆰 ６ ±６􀆰 ４ ａＡ ６２􀆰 ８ ±３􀆰 ９ ａＡ
４０ ７９􀆰 ２ ±８􀆰 ２ ｂｃＢ ４３􀆰 ２ ±５􀆰 ３ ｃＣ ４０ ８１􀆰 ６ ±５􀆰 ２ ｂｃＢ ５３􀆰 ４ ±８􀆰 ６ ｂＢ
５０ ８２􀆰 ６ ±９􀆰 ６ ｂＢ ５１􀆰 ６ ±８􀆰 ２ ｂＢ ５０ ７６􀆰 ３ ±６􀆰 ７ ｃｄＢ ４９􀆰 ８ ±７􀆰 ２ ｂｃＢ
６０ ９２􀆰 ８ ±３􀆰 ２ ａＡ ６１􀆰 ９ ±６􀆰 ４ ａＡ ６０ ７１􀆰 ２ ±９􀆰 ６ ｄｅＢＣ ４５􀆰 ６ ±９􀆰 ３ ｃｄＢＣ
７０ ８０􀆰 ６ ±６􀆰 ５ ｂＢ ４９􀆰 ６ ±８􀆰 ４ ｂＢＣ ７０ ６４􀆰 ５ ±４􀆰 ３ ｅＣ ４０􀆰 ６ ±４􀆰 ２ ｄＣ
８０ ７５􀆰 ５ ±５􀆰 ３ ｃＢＣ ４２􀆰 ５ ±４􀆰 ２ ｃＣ ８０ ５８􀆰 ９ ±５􀆰 ８ ｆＤ ３２􀆰 ５ ±５􀆰 ８ ｅｆＤ
９０ ６２􀆰 ４ ±５􀆰 ４ ｄｅＤ ４１􀆰 ２ ±５􀆰 ０ ｃＣ ９０ ５５􀆰 ４ ±７􀆰 ３ ｆＤ ２４􀆰 ８ ±８􀆰 １ ｆＥ　
表 ４　 化冻温度对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈａｗｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
化冻温度(℃)
Ｔｈａｗｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
２５ ７９􀆰 ６ ±９􀆰 ６ ｂＢ ４３􀆰 ４ ±３􀆰 ９ ｃＣ
３０ ８１􀆰 ９ ±５􀆰 ９ ｂＢ ５２􀆰 １ ±５􀆰 ９ ｂＢ
３７ ９３􀆰 ６ ±３􀆰 ６ ａＡ ６２􀆰 ０ ±４􀆰 ８ ａＡ
４２ ８４􀆰 ７ ±６􀆰 ８ ｂＢ ５１􀆰 ９ ±７􀆰 ２ ｂＢ
２􀆰 ５　 洗涤液蔗糖浓度对红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存的影响
从表 ５可知ꎬ 洗涤液蔗糖浓度对红芽芋胚性愈
伤组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 用
０~１􀆰 ６ ｍｏｌ / Ｌ 蔗糖对红芽芋冻后胚性愈伤组织进
行洗涤并检测其细胞活力和成活率ꎬ 结果表明ꎬ 随
着蔗糖浓度的增加ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后细
胞活力和成活率均显著增加ꎮ 但当蔗糖浓度超过
１􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌ时ꎬ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后细胞活
力和成活率均显著下降ꎮ 因此ꎬ 江西铅山红芽芋胚
性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的适宜洗涤条件
为 １􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖洗涤 １０ ｍｉｎꎮ
２􀆰 ６　 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋玻
璃化超低温保存的影响
从表 ６可知ꎬ 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤
组织包埋玻璃化超低温保存具有显著影响ꎮ 当红芽
芋冻后胚性愈伤组织直接置于光周期中培养或先暗
培养 ７ ｄ再转到光周期中培养时ꎬ 结果表明ꎬ 先暗
培养 ７ ｄ再转到光周期中培养有利于提高红芽芋胚
性愈伤组织的冻后细胞活力和成活率ꎮ 因此ꎬ 江西
铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的
适宜冻后培养条件为先暗培养 ７ ｄ再转到光周期中
培养ꎮ
表 ５　 洗涤液蔗糖浓度对江西铅山红芽芋胚性
愈伤组织包埋玻璃化超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｗａｓｈｉｎｇ
ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｉ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ
Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
洗涤液蔗糖浓度(ｍｏｌ / Ｌ)
Ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｉｎ ｗａｓｈｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
０ ７６􀆰 ５ ± ６􀆰 ５ ｃＣ ４５􀆰 ６ ±９􀆰 ６ ｃＣ
０􀆰 ４ ８２􀆰 ５ ± ６􀆰 ２ ｂｃＢＣ ５３􀆰 ４ ±５􀆰 ８ ｂＢ
０􀆰 ８ ８６􀆰 ４ ± ５􀆰 ９ ｂＢ ５６􀆰 ３ ±８􀆰 ４ ｂＢ
１􀆰 ２ ９３􀆰 ８ ± ２􀆰 ６ ａＡ ６５􀆰 ５ ±６􀆰 ７ ａＡ
１􀆰 ６ ８１􀆰 ９ ± ８􀆰 ４ ｂｃＢＣ ５７􀆰 ２ ±１０􀆰 ２ ｂＢ
表 ６　 冻后培养条件对江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
包埋玻璃化超低温保存的影响
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｏｎ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ
ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ
Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
冻后培养条件
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ
细胞活力(％)
Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
成活率(％)
Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ
直接置于光周期下培养
Ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ ８６􀆰 ５ ±９􀆰 ６ ｂＢ ５３􀆰 ４ ±６􀆰 ３ ｂＢ
先暗培养 ７ｄ再置于光周期下培养
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｄａｒｋ ｆｏｒ ７ ｄꎬ ｔｈｅｎ ｉｎ
ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ
９２􀆰 ５ ±２􀆰 ６ ａＡ ６２􀆰 ９ ±４􀆰 ８ ａＡ
４８ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
２􀆰 ７　 冻后胚性愈伤组织再生苗的形态性状和染色
体数目检测
对红芽芋胚性愈伤组织冻后再生苗与对照再生
苗的染色体数目进行检测发现ꎬ 两者染色体数目相
同(２ｎ ＝ ２８)ꎮ 另外ꎬ 从表 ７和图 １可知ꎬ 红芽芋
胚性愈伤组织冻后再生苗与对照再生苗在平均株
高、 平均芽数、 平均根数和平均根长等形态性状指
标上虽有差异ꎬ 但未达显著性水平(ｐ > ０􀆰 ０５)ꎮ
这些结果表明ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋
玻璃化超低温保存是可行的ꎬ 基本不会影响其遗传
稳定性ꎮ
表 ７　 超低温保存后江西铅山红芽芋胚性愈伤组织
再生苗的形态性状和染色体数目检测
Ｔａｂｌｅ ７　 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ａｆｔｅｒ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ
形态性状和染色体数目
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ
Ｎｏ􀆰 ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
对照再生苗
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｐｌａｎｔｌｅｔ ｏｆ ＣＫ
冻后胚性愈伤组织再生苗
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ
ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ
ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
平均株高(ｃｍ)
Ａｖｅｒａｇｅ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｈｅｉｇｈｔ ５􀆰 ８ ±２􀆰 ０ ａＡ ５􀆰 ４ ±１􀆰 ６ ａＡ
平均芽数
Ａｖｅｒａｇｅ ｂｕｄ ｎｕｍｂｅｒ ３􀆰 ６ ±１􀆰 ０ ａＡ ３􀆰 ２ ±０􀆰 ９ ａＡ
平均根数
Ａｖｅｒａｇｅ ｒｏｏｔ ｎｕｍｂｅｒ ４􀆰 ５ ±１􀆰 ３ ａＡ ４􀆰 ２ ±１􀆰 １ ａＡ
平均根长(ｃｍ)
Ａｖｅｒａｇｅ ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ ４􀆰 ６ ±０􀆰 ８ ａＡ ５􀆰 １ ±０􀆰 ６ ａＡ
染色体数目
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｕｍｂｅｒ ２８ ａＡ ２８ ａＡ
图 １　 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织再生苗
(左: 对照再生苗ꎻ 右: 冻后胚性愈伤组织再生苗)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｏｆ
Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ (Ｌｅｆｔ: ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ
ｏｆ ＣＫꎻ Ｒｉｇｈｔ: ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｌｉ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ)
３　 讨论
包埋玻璃化超低温保存的基本程序一般包括预
培养、 装载、 脱水、 化冻、 洗涤及恢复培养等过
程ꎮ 影响植物种质包埋玻璃化超低温保存的因素很
多ꎬ 除材料本身外ꎬ 还有保存所用试剂的种类、 浓
度和处理时间等ꎮ 因此ꎬ 要进行红芽芋包埋玻璃化
超低温保存ꎬ 需对以上步骤的具体影响因子进行
优化ꎮ
预培养一般是使用高浓度的蔗糖对材料进行培
养ꎮ 甜柿休眠芽茎尖在含有 ０􀆰 ３ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖的改良
ＭＳ培养基(ＫＮＯ３和 ＮＨ４ＮＯ３减半)上预培养 １ ｄꎬ
其成活率接近 １００％[１４]ꎮ 怀地黄带芽茎段在 ＭＳ＋
０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖 ＋５０ ｇ / Ｌ ＤＭＳＯ ＋１０ ｇ / Ｌ 乙酰胺
培养基中 ４℃低温下预培养 ３ ｄꎬ 成活率和再生率
分别为 ６６􀆰 ９３％和 ２６􀆰 ６７％[１３]ꎮ 怀山药带芽茎段在
ＭＳ ＋０􀆰 １ ｍｏｌ / Ｌ 蔗糖 ＋ ０􀆰 １ ｍｏｌ / Ｌ 甘油培养基中
４℃低温下预培养 ３ ｄꎬ 成活率可达 ６４􀆰 ２９％[１２]ꎮ
青岛百合茎尖在ＭＳ ＋０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖 ＋１００ ｇ / Ｌ海
藻糖 ＋ １ ｍｇ / Ｌ ＡＢＡ 的培养基上预培养 ３ ｄꎬ 用
ＴＴＣ法检测存活率可达 ６７􀆰 ５％[２０]ꎮ 本实验结果表
明ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织在 ２５℃下转入
ＭＳ ＋２ ｍｇ / Ｌ ＴＤＺ ＋１ ｍｇ / Ｌ ＮＡＡ ＋０􀆰 ７５ ｍｏｌ / Ｌ蔗
糖的培养基中于 １４ ｈ / ｄ 光周期下预培养 １ ｄꎬ 细
胞活力和成活率也可达到 ９０％和 ６０％以上ꎮ
在预培养之后ꎬ 植物材料一般要用甘油和蔗糖
等混合物在 ２５℃下进行装载ꎬ 并且装载液的种类
和装载时间也因植物种类而不同ꎮ 当装载液为 ＭＳ ＋
１ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖 ＋２ ｍｏｌ / Ｌ 甘油时ꎬ 高山红景天茎尖
适宜的装载时间为 ６０ ｍｉｎ[２１]ꎮ 怀山药带芽茎段最
适宜的装载液是ＭＳ＋０􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖＋２ ｍｏｌ / Ｌ甘
油 ＋５０ ｇ / Ｌ ＤＭＳＯꎬ 装载时间为 ６０ ｍｉｎ[１２]ꎮ 当装
载液为ＭＳ＋０􀆰 ９ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖＋２ ｍｏｌ / Ｌ甘油时ꎬ 树
莓茎尖适宜的装载时间为 ９０ ｍｉｎ[２２]ꎮ 本实验结果
表明ꎬ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的装载液是
２ ｍｏｌ / Ｌ甘油和 ０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ 蔗糖的 ＭＳ 混合物ꎬ 较
适宜的装载时间为 ４０ ｍｉｎꎮꎮ
玻璃化保护剂是保证植株再生的关键ꎮ 玻璃化
保护剂一般选择 ＰＶＳ２ꎬ 其脱水温度和脱水时间对
愈伤组织成活率有较大影响ꎮ 高山红景天茎尖的玻
５８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存
璃化保护剂为改良的 ＰＶＳ２(３０％甘油＋１５％乙二
醇 ＋ １５％二甲基亚砜 ＋１５％聚乙二醇 ＋１ ｍｏｌ / Ｌ蔗
糖)ꎬ 适宜的脱水温度为 ０℃ꎬ 脱水时间为 １８０ ~
２１０ ｍｉｎ[２１]ꎮ 怀地黄带芽茎段的玻璃化保护剂为
ＰＶＳ２ꎬ 适宜的脱水温度为 ０℃ꎬ 脱水时间为
３０ ｍｉｎ[１３]ꎮ 怀山药带芽茎段的玻璃化保护剂为改
良的 ＰＶＳ２ (３０％甘油 ＋１５％乙二醇 ＋１０％二甲基
亚砜 ＋１５％聚乙二醇 ＋０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ 蔗糖)ꎬ 适宜的
脱水温度为 ０℃ꎬ 脱水时间为 ６０ ｍｉｎ[１２]ꎮ 青岛百
合茎尖的玻璃化保护剂为 ＰＶＳ２ꎬ 适宜的脱水温度
为 ０℃ꎬ 脱水时间为６０ ｍｉｎ[２０]ꎮ甜柿休眠芽茎尖的
玻璃化保护剂为 ＰＶＳ２ꎬ 但其适宜的脱水温度为
２５℃ꎬ 脱水时间为 １２０ ｍｉｎ[１４]ꎮ 沙生柽柳休眠茎
尖的玻璃化保护剂为改良的 ＰＶＳ２ (４０％甘油 ＋
０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖 ＋１０％聚乙二醇＋５％二甲基亚砜)ꎬ
适宜的脱水温度为 ２５℃ꎬ 脱水时间为 ２０ ｍｉｎ[２３]ꎮ
灰杨休眠茎尖的玻璃化保护剂为改良的 ＰＶＳ２
(４０％甘油 ＋０􀆰 ４ ｍｏｌ / Ｌ蔗糖 ＋１０％聚乙二醇 ＋５％
二甲基亚砜)ꎬ 适宜的脱水温度为 ２５℃ꎬ 脱水时间
为 ２０ ｍｉｎ[２４]ꎮ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的玻
璃化保护剂是 ＰＶＳ２ꎬ 适宜的脱水温度为 ２５℃ꎬ 脱
水时间为 ３０ ｍｉｎꎬ 此结果与甜柿、 沙生柽柳和灰
杨的实验结果相类似ꎮ
冻存材料在保存终止后需快速化冻ꎬ 以防止由
于次生结冰对组织和细胞造成的伤害ꎮ 一般来讲ꎬ
冻存材料在进行包埋玻璃化超低温保存后ꎬ 适宜的
化冻条件为 ３７ ~４０℃水浴快速化冻ꎮ 甜柿休眠芽
茎尖[１４]、 高山红景天茎尖[２１]、 怀地黄带芽茎
段[１３]、 怀山药带芽茎段[１２]、 树莓茎尖[２２]适宜的
化冻条件均为 ４０℃水浴快速化冻ꎮ 青岛百合茎尖
适宜的化冻条件为 ３８℃水浴快速化冻[２０]ꎮ 本研究
江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的化冻条件为 ３７℃
水浴快速化冻ꎮ
冻存材料快速化冻后需利用高浓度的蔗糖溶液
洗去对细胞有毒害作用的 ＰＶＳ２ꎬ 适宜的洗涤液蔗
糖浓度一般设置为 ０􀆰 ５ ~１􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌꎮ 怀山药带芽
茎段适宜的洗涤液为 ０􀆰 ５ ｍｏｌ / Ｌ 蔗糖[１２]ꎮ 高山红
景天茎尖[２１]、 树莓茎尖[２２]洗涤的适宜蔗糖浓度为
１ ｍｏｌ / Ｌꎮ 青岛百合茎尖[２０]、 怀地黄带芽茎段[１３]、
甜柿休眠芽茎尖[１４]适宜的洗涤液为 １􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌ 蔗
糖ꎮ 本研究中江西铅山红芽芋胚性愈伤组织洗涤的
适宜蔗糖浓度也为 １􀆰 ２ ｍｏｌ / Ｌꎮ
化冻后包埋的茎尖比裸露茎尖较耐机械操作ꎬ
且不需除去包裹的褐藻酸钙ꎬ 将其直接转入基本培
养基上可进行恢复培养ꎬ 适宜的培养条件却是决定
包埋玻璃化超低温保存能否成功的因素之一ꎮ 怀山
药带芽茎段适宜的冻后培养条件是先暗培养 １４ ｄꎬ
再转到光下培养[１２]ꎮ 甜柿休眠芽茎尖适宜的冻后
培养条件是暗培养 ３~５ ｄ 后再转入光下培养[１４]ꎮ
高山红景天茎尖适宜的冻后培养条件是先暗培养
２ ｄꎬ 再转到光下培养[２１]ꎮ 灰杨休眠茎尖[２４]和沙
生柽柳休眠茎尖[２３]适宜的冻后培养条件是暗培养
１ ｄ 后再转入光下培养ꎮ 怀地黄带芽茎段[１３]和青
岛百合茎尖[２０]适宜的冻后培养条件是先暗培养
７ ｄꎬ 再转到光下培养ꎬ 这与本研究江西铅山红芽
芋胚性愈伤组织适宜的冻后培养条件是一致的ꎮ 因
此ꎬ 在进行包埋玻璃化超低温保存后ꎬ 需对冻存材
料进行一定时间的暗培养ꎬ 促进其恢复生长ꎬ 提高
成活率和再生率ꎬ 究其原因ꎬ 可能是冻后黑暗培养
有利于修复材料在超低温保存期间所受到的冷冻伤
害[２５]ꎮ
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(责任编辑: 刘艳玲)
７８　 第 １期　 　 　 　 　 　 　 　 　 洪森荣等: 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋玻璃化超低温保存