全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (2) : 179～ 186
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
获取全长 cD NA 若干方法的比较
陶爱林, 林兴华, 张端品Ξ
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 武汉　430070)
关键词: 全长 cDNA ; 信使RNA ; 5′帽子结构; 高保真 PCR; 比较
　　中图分类号: Q 943　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0220179208
Com par ison of the Approaches for Full- length cD NA Enr ichm en t
TAO A i2L in, L IN X ing2H ua, ZHAN G D uan2P in
(N ationa l K ey L abora tory of C rop Genetic Imp rovem en t, H uaz hong A g ricu ltu ra l U n iversity , W uhan　430070, Ch ina)
Abstract: Fu ll2length comp lem en tary DNA s (cDNA ) are crucia l fo r the funct ional anno ta t ion of
genes. Severa l novel experim en ta l app roaches fo r select ive en richm en t of fu ll2length cDNA s are
ou t lined in para llels. Som e k inds of reverse tran scrip tases and h igh fidelity PCR enzym es are in2
t roduced fo r p rom ising h igh eff iciency of accu ra te fu ll2length cDNA syn thesis. T he temperatu re
p rofiles of the reverse tran scrip t ion and PCR are also discu ssed.
Key words: Fu ll2length cDNA ; mRNA ; 5′2CA P; H igh2f idelity PCR; Comparison
　　生物技术突飞猛进大大提高了人类认识自身及
与人类息息相关的生命现象的能力。近几年内, 人
类[1, 2 ]、模式生物拟南芥 (A rabid op sis tha liana ) [3 5 ]
及水稻的基因组测序[6, 7 ]的草图相继完成, 给人类又
提出了新的挑战: 如何鉴定这些序列的功能及如何
解析生命现象的基因本质, 这是一个更加庞大而又
极富挑战性的课题, 正促使一门新的学科即功能基
因组学 (Funct ional genom ics) 的产生与蓬勃发展。
不论功能基因组学多么深奥, 其认识基因功能的基
本前提是获取可能有相关功能的基因之全长编码序
列。其中, 全长 cDNA 序列的获取是正确地注释基
因组序列、进行基因的功能及产物分析的必要前
提[8 ]。
迄今为止, 已报道的 cDNA 平衡化文库大多是
按照 Gub ler 和 Hoffm an 所提出的 cDNA 合成方
法[9 ] (或其衍生体) 进行构建[10 ]。这种方法合成
cDNA 存在两大技术难题。第一, 由于逆转录酶合成
全长 cDNA 的能力有限, 及多数基因距mRNA 5′端
较近的区域存在“CpG 岛”等构成的复杂二级结构,
阻碍了逆转录酶的进一步延伸, 导致逆转录酶从延
伸复合体处解离下来而使 cDNA 合成提前终止; 第
二, 即使逆转录酶的全长 cDNA 合成效率较高, 但
是, 技术上无法将这种全长 cDNA 与非全长 cDNA
进行区别筛选, 结果多数文库存在一个共同的缺点:
文库中的大多数 cDNA 并非全长 cDNA , 不能提供
mRNA 5′端的序列而丢失了大量的信息。如果文库
中克隆片段的长度较小, 则需要若干个克隆才能覆
盖一条完整的 cDNA , 这会增加后续研究工作的难
度。 F rohm an 等首先报道了已知基因序列的全长
cDNA 克隆方法, 即RA CE (R ap id Amp lif ica t ion of
Comp lem en tary2DNA Ends)法[11 ]。这对于合成个别
基因的全长 cDNA 极其有效, 但对于大规模地构建Ξ 收稿日期: 2002207209, 修回日期: 2002212206。基金项目: 国家自然科学基金项目 (30170569) ; 国家“863”计划资助课题 (Z16202201202)。作者简介: 陶爱林 (1968- ) , 男, 博士, 研究方向为分子生物学。通讯作者。
cDNA 文库却显得无能为力。Chench ik 等以加特异
接头的方式及大片段高保真扩增法对全长 cDNA
的合成进行了报道[12 ] , 虽然较容易地获得了比较长
的 cDNA 片段, 但是文章中却缺乏已锚定 (A ncho r)
mRNA 5′末端的证据, 不足为信。
真核生物的非细胞器mRNA 都有一个共同特
征, 即 5′末端存在m 7GpppN (N 为A、T、C、G 中的
任一碱基) 结构 (见图 1: A ) , 通常称为“帽子”结
构[13, 14 ]。随着对这些结构认识的深入及对这种帽子
结构具有专一亲和性蛋白质的鉴定与分离[15, 16 ] , 近
期的全长 cDNA 合成方法则主要围绕这种帽子结
构展开。其中代表性的方法有: CA P2F inder [17, 18 ]、
CapSelect [19 ]、CA P2T rapper [20 ]、CA P tu re [21 ]、O li2
go2Capp ing [22 24 ]等。这些方法虽然都是从mRNA
的 5′2CA P 入手, 但各有侧重, 因此, 操作过程的繁
易、效率的高低及优缺点也各不相同。
所有这些全长 cDNA 合成过程都涉及逆转录
过程、cDNA 的扩增, 因此其中的逆转录酶及相应的
温度参数的选定、扩增过程中不同的保真酶的取舍
等因素必然影响全长 cDNA 的合成效率。谈到全长
cDNA 合成方法则不能不涉及这些因素。
1　全长 cD NA 合成方法的比较
1. 1　CAP-F inder 法
CA P2F inder 法[17, 18 ]依据的原理 (见图 1: B ) 是:
逆转录酶在 cDNA 合成至mRNA 5′帽子端时, 发
生模板转换 (T emp late2sw itch ing ) , 而在 cDNA 3′
端加上 1～ 5 个胞嘧啶。通过调整反应缓冲液中
M g2+ 、M n2+ 等阳离子的浓度, 可使这种活性得到最
大限度地发挥, 从而使 cDNA 第一链 3′端加上 3～
5 个胞嘧啶的概率提高到 90%。事先设计的锚定序
列的 3′末端则含有 GGG, 可与 cDNA 第一链配对。
这段锚定序列与逆转录所用的 po ly (A ) 序列一起作
为扩增的引物, 对全长 cDNA 进行扩增。Ξ
图 1　mRNA 中的帽子结构和二醇结构 (A)及CAP-F inder 和CapSelect 全长 cD NA 合成流程 (B)
F ig11　T he CA P2structu re and flow chart rep resen tat ion of CA P2F inder and CapSelect fu ll2length cDNA m ethods
　
　　该方法是C lonT ech 公司 (Califo rn ia, U SA ) 开
发的全长 cDNA 合成试剂盒 SM A R T TM 　1) 和即将
推 出 的 改 进 版 SuperSM A R T TM 　2) 的 精 髓。
SM A R T TM 的推广应用范围较大。优点在于: 不存在
对mRNA 进行处理的酶促反应, 不仅操作极其简
便, 而且一定程度上提供了全长 cDNA 合成的可能
性。但是, 该方法也存在明显不足: 对全长 cDNA 进
行筛选仅仅依赖 3 个碱基 GGG, 其选择强度过于微
弱, 产生非全长 cDNA 的可能性较大; 同时, 合成的
cDNA 池中还包括其它非全长 cDNA , 专一性不够。
1. 2　CapSelect 法
CapSelect 方法是对 Cap 2F inder 方法的改进,
于 1999 年才见报道[19 ] , 目前被引用的研究报道尚
不多见。其原理与CA P2F inder 法相同 (图 1: B ) , 也
081 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
Ξ 1) h ttp: ööwww. clon tech. com öarch iveöJAN 02U PD öpdföSm artO verview. pdf
　　　2) h ttp: ööwww. clon tech. com öarch iveöOCT 01U PD öpdföSuperSM A RT. pdf
是利用M 2M LV 逆转录酶的末端转移酶特性, 在
cDNA 第一链 3′端先加上 3～ 5 个胞嘧啶, 再进一步
通过控制反应条件, 加入末端转移酶, 在 cDNA 第
一链 3′末端进一步加上 3～ 5 个磷酸腺苷, 理想状态
下加A 效率可达 93%。cDNA 第一链 3′末端因此就
有 6～ 10 个已知的碱基。通过设计带有 5′T T T GGG
或 5′T T T T GGG 拖尾的DNA 接头, 即可选择性地
与全长mRNA 来源的 cDNA 结合, 通过扩增2纯化
即为全长 cDNA。
该方法的优点在于处理mRNA 的过程较少, 这
在一定程度上减少了RNA 降解的风险; 同时所要
求的起始mRNA 量适中, 为多数实验室所能承受。
另外, 与 C lonT ech 的 CA P2F inderTM 方法相比优点
也是明显的, 即增加了全长 cDNA 选择强度, 可靠
性更高。
缺点在于: 即使条件极大地优化, 也仅约有
82% 的全长 cDNA 得到筛选; 另外一个问题是, 无
法剔除 cDNA 混合样中非全长 cDNA。Ξ
1. 3　CAP-Trapper 法
CA P2T rapper 方法首先由 Carn inci 等所在的
研究组进行了报道[20 ] , 后由该研究组进行了不同程
度的改进[25 ] , 并进行了系统性的研究。将该方法与
Chench ik 等连接特异接头再进行扩增的方法[12 ]进
行了整合[26 ] , 建立了 10 多个拟南芥不同发育时期、
不同组织、不同诱导处理的全长cDNA 库及老鼠的
全长cDNA 库 3) ; 与 cDNA 芯片技术进行了结合应
用[27 ] , 提高了基因的发现能力。通过与其它全长
cDNA 合成方法的比较, 研究者认为 CA P2T rapper
方法效果最佳[28 ]。CA P2T rapper 方法合成全长
cDNA 的原理 (见图 2: A ) 是: 依据 mRNA 5′端及
3′端存在一个共同的结构, 即二醇结构 (D io l, 见
图 1: A )来开展工作。首先将这种二醇结构进行氧
化, 再进行生物素修饰, 之后经过沉淀、酒精洗涤、无
RN ase 的双蒸水重新悬浮等筛选步骤, 得到生物素
化的mRNA 经逆转录酶催化进行 cDNA 第一链的
合成, 接着进行 RN ase I 处理, 未被 cDNA 保护的
mRNA (包括非全长 cDNA 与 RNA 杂交体中暴露
的 mRNA 5′端 及 所 有 的 未 被 cDNA 保 护 的
mRNA ) 即被降解。后经链青霉素磁珠吸附并使用
弱碱降解mRNA , 如此得到单链 cDNA , 在末端转
移酶的催化下进行 5′端O ligo (G) 加尾, 之后再进行
第二链的合成, 连接载体即可得到全长 cDNA 库。
图 2　CAP-Trapper (A) 和O ligo-Capp ing (B)全长 cD NA 合成方法图解
F ig12　Full2length cDNA Strategies fo r CA P2T rapper (A ) and O ligo 2Capp ing (B ) m ethods
　
181　第 2 期　　　　　　　　　　　　　　陶爱林等: 获取全长 cDNA 若干方法的比较
Ξ 3) ftp: ööfan tom. gsc. riken. go. jpö
　　这种方法的优点在于: 直接对全长mRNA 进行
筛选, 最后所得到的 cDNA 理论上主要是全长
cDNA ; 所需的开支也较为适中, 适用于一般的课题
组采用。也许正因为这一点, 该方法的应用报道较
多。相比较而言, 其难点在于: 涉及对mRNA 的酶促
反应较多, RNA 降解的危险性较高, 对整个操作的
技术要求高。该方法的缺点也比较明显: 在去除非全
长cDNA 2RNA 杂交体的过程中, 如 RNA 3′端被逆
转录引物 po ly (A ) 完全配对而保护, 则其相应的
cDNA 2RNA 杂交体依旧会被链青霉素磁珠吸附而
被作为全长 cDNA 进行处理; 同时, 由于逆转录酶
的合成能力的限制, 一些完整的mRNA 如果未被有
效地逆转录, 则会被RN ase I清理掉, 因此所得的全
长 cDNA 池并不能代表全部的全长mRNA。
1. 4　CAPture 法
该方法[21 ]的工作原理是: 利用 5′帽子特异亲和
性蛋白 A 2e IF24E 对完整 mRNA 或全长 cDNA :
RNA 杂交体进行选留, 以去除无帽子的非全长
mRNA。全长 cDNA 2RNA 杂交体或完整mRNA 的
解离是通过用过量的 5′帽子类似物m 7GD P 进行多
次洗提来实现的。其后再进行 cDNA 第二链的合成
及全长 cDNA 的克隆。
该方法的优点是: 特异地对 5′帽子进行筛选,
目的性更强; 整个过程中对mRNA 的酶促反应较
少, 减小了RNA 被降解的风险。
该方法也有其缺点: mRNA 帽子亲和性蛋白的
获取需经历相当繁复的纯化步骤[21 ] , 其成本较高;
使用RN ase A 对来自完整mRNA 的非全长 cDNA
进行去除的前提中存在一对矛盾: 即如果mRNA 的
5′帽子结构处还有几个碱基未被逆转录的 cDNA 覆
盖, 则会被RN ase A 切割而引起相应的全长mRNA
与 cDNA 杂交体的解离。因此, 这种全长cDNA 的选
择方法之效率, 如同Cap 2T rapper 方法一样, 最终决
定于逆转录酶合成全长 cDNA 的能力。另外, A 2
e IF24E 只对甲基化的帽子具有较强的亲和力, 而对
未甲基化的帽子则几乎不具有亲和力。如果全长
mRNA 中还存在未曾甲基化的帽子, 则势必会丢失
一部分全长 cDNA 或完整mRNA。
1. 5　O l igo-Capp ing 法
O ligo2Capp ing 方法是 Sum io Sugano 实验室于
1994 年开发[22 24 ]。其具体策略见图 2: B。首先用碱
性磷酸酶对所有mRNA 的 5′端进行去磷酸化, 全
长mRNA 由于有 5′帽子保护而未受影响; 再采用
烟草酸焦磷酸酶去掉mRNA 的 5′端帽子而露出磷
酸基团, 在 T 4 RNA 连接酶催化下, 只有那些带有
5′磷酸根的mRNA 才能加上事先设计的核酸接头,
逆转录后依据 5′接头及 3′逆转录引物合成的 PCR
引物进行扩增, 最后连接载体建立全长 cDNA 库。
该方法的设计巧妙而新颖, 只要引物设计合理、
逆转录酶的效率充分, 则全长 cDNA 应是扩增产物
中的主要成分。理论上, 能够对所有的全长mRNA
进行筛选, 从而避免了上述方法的缺陷。在结合长距
离高保真 PCR 方法[12 ]的前提下, 得到全长 cDNA
应该不成问题。 Sugahara 等通过比较不同全长
cDNA 合成方法后也认为[28 ]: 不同方法都有其不足
之处, 而 CA P2T rapper 方法与O ligo2Capp ing 方法
的效率较高。
O ligo2Capp ing 方法也有其缺点, 即涉及的酶促
反应较多, 因此对 RNA 的操作技术水平和操作环
境都有较高的要求; 另外, 这种方法与其它多数全长
cDNA 合成方法相似的弱点是: 所谓的全长 cDNA
库中, 也不能排除非全长 cDNA 的掺杂。再者, 由于
不可知的原因, 该方法中的烟草酸焦磷酸酶的价格
从 2001 年 6 月开始一路猛涨, 使该方法的应用成本
大幅度上升, 这必然在一定程度上限制其应用范围。
2　全长 cD NA 合成过程中的酶促反应
通过以上全长 cDNA 合成方法的比较不难看
出: 不同的合成方法各有优缺点, 选择合适的方法固
然重要, 但是其中的酶促反应特别是逆转录酶的性
质对于全长 cDNA 的合成却至关重要。
2. 1　逆转录酶的选用
从来源来分, 逆转录酶主要有禽源逆转录酶
AM V R T (A vian m yelob lasto sis viru s reverse
tran scrip tase ) 和 鼠 源 逆 转 录 酶 M 2M LV R T
(M o loney m u rine leukem ia viru s reverse tran scri2
p tase) 两大类。逆转录酶的合成效率取决于其越障
能力即读通mRNA 中二级结构[29 ]的能力, 以及逆
转录反应温度[30 ]。逆转录反应的温度取决于逆转录
酶的耐热性能。不同的逆转录酶的越障能力及耐热
性能各不相同。未曾改造的禽源逆转录酶早期版本
的特点是: 对温度的耐受力强, 越障能力强, 对起始
RNA 的要求相对较低, 即在总RNA 中仍能进行逆
转录[30 ] , 但是其RN ase H 活性却比较明显, 使得逆
转录过程中mRNA 降解的危险大大增加。未曾改造
鼠源逆转录酶的耐热性能及越障能力都相对较差,
但是其RN ase H 活性却相对较低, 这为保持逆转录
过程中 mRNA 的完整性提供了条件。单纯出于
281 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
mRNA 完整性的考虑, 稍早的文献因此对鼠源逆转
录酶则有所倚重[31 ]。随着生物工程技术水平的提
高, 针对二者特点的技术改造也不断完善。此后, 二
者的综合性能都得到了提高[28 ]。经过改造后,
AM V 2R T 的 RN ase H 活性得到灭活, 其耐热性能
也有所提高。如 Sigm a 公司推出的改进型的AM V
逆转录酶的逆转录反应温度可高达 65℃ 4)。L ife
T echno logies 公司则介绍经过他们改良后的RN ase
H - M 2M LV R T (Superscrip t IITM )能够忍受 50℃的
高温[32 ]。这为解除mRNA 中的二级结构、提高全长
cDNA 合成效率奠定了基础。
除了以上所述的 2 种逆转录酶之外, 还有 1 种
逆转录2扩增两用酶值得一提, 那就是 T th DNA
po lym erase。这种酶的最适工作温度可达 70℃, 在
M n2+ 离子存在的条件下, 可以进行逆转录, 这对于
解除mRNA 的二级结构相当有利[33 ]。然而, 有报道
认为: M n2+ 参入缓冲液中却易于使 mRNA 降
解[34 ] , 这又会使全长 cDNA 的合成目标大打折扣。
耐热性逆转录酶的采用给逆转录及扩增引物的
设计提出了难题, po ly (dT ) 过短, 则引物退火温度
不够; po ly (dT ) 较长, 则特异性较强, 难免丢失部分
并不完全匹配的全长mRNA。只有进行特殊的设
计, 才能使逆转录达到最佳的效果[35 ]。A ndo 等采用
po ly (dT )VN 进行逆转录, 发现这种引物有利于合
成片段较长的 cDNA 第一链[32 ]。
2. 2　高保真D NA 聚合酶的选用
全长 cDNA 的平均长度究竟为多长, 目前未见
报道。见诸报道的最长的全长 cDNA 约 19 kb 5)。常
规的DNA 聚合酶由于存在较高的错配率而难以准
确地扩增如此长的 cDNA 链; 同时, 由于逆转录酶
没有 3′→5′的外切活性, 逆转录时存在错配的倾向,
因此进行全长 cDNA 的扩增大多采用具有高保真
性能的DNA 聚合酶如 Pf u、D eep V en t、V en t、Pw o
等[36 40 ]。也有采用 T th DNA po lym erase 进行扩增
的报道[41, 42 ]。但是只要反应液中存在短的RNA 链,
后一种酶即可以在无模板的条件下, 聚合po ly (A -
T ) [43, 44 ] , 从而产生大片段的拖尾。因此, 选用该酶应
首先谨慎地以RN ase A 去除 cDNA 第一链合成反
应液中的RNA 6) , 才能获得较为理想的结果。Ξ
由于各种保真酶的价格一般都较贵, 很多使用
者便将其与常规的DNA 聚合酶进行混合使用[10 ] ,
所得效果也比较理想。
使用保真酶的一个不足之处是: 必须进行热启
动 PCR , 以免引物或模板受保真酶的外切酶活性的
破坏。当然, 在有高精度移液器条件下操作少数几管
反应时, 热启动并不会影响 PCR 结果。
最近, 又有报道开发了一种热启动蛋白质, 即在
常温下, 高保真酶的外切活性或普通酶的聚合特性
得到抑制而在高温下酶活性得到释放。这为简便操
作高保真长距离 PCR 奠定了基础。而C lonT ech 则
采用一种抗体来抑制高保真酶在低温下的活性, 其
作用也相当于热启动蛋白。
2. 3　其它辅助技术
为了准确地获取全长 cDNA , 人们从全长
cDNA 合成过程的各个方面进行了探索。除了以上
一些结果之外, 另有对比试验显示[30 ]: 逆转录之前
将引物与 RNA 模板进行短暂的变性, 可破坏
mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板的正确配
对, 从而提高 cDNA 的合成效率。另据报道: 一种称
为海藻糖 (T rehalo se) 的有机物可提高厌热逆转录
酶如M 2M LV R T 等的热稳定性及热激活性, 使得
常规的逆转录酶也能在 55～ 60℃的高温下进行稳
定的逆转录反应[34 ]。Sek i 等将这种海藻糖引入拟南
芥全长 cDNA 的合成, 并构建了全长 cDNA 库[8 ]。
3　结语
mRNA 5′非翻译区 (5′2U TR ) 与 3′2U TR 在真
核生物基因的表达与调控方面都起着十分重要的作
用。分析表明, mRNA 5′的非翻译区 (5′2U TR ) 较
3′2U TR具有更为复杂的结构[45 ]。启始密码子的前
导 序 列 背 景、5′2U TR 序 列 中 的 开 放 阅 读 框
(uOR F s)、特异蛋白或反义RNA 结合区等的存在
与否、5′2U TR 序列的长度等因素将更深地影响翻
译的效率, 这暗示52U TR可能在基因的表达调控中
扮演更为重要的角色。对不同状态的相同基因型材
料中mRNA 5′2U TR 进行研究显得更为重要。随着
一些生物基因组的测序完成, 取得全长 cDNA 并正
确解析基因的功能是功能基因组学的重要内容。只
有站在全长 cDNA 的高度, 并透彻了解与其具有级
联关系的各基因的全长 cDNA , 才能真正洞悉基因
381　第 2 期　　　　　　　　　　　　　　陶爱林等: 获取全长 cDNA 若干方法的比较
Ξ 4) A 4464: : h ttp: ööwww. sigm a2aldrich. com
　　　5) h ttp: ööwww. riken. go. jpöengnör2wo rldöresearchölabögenom eögeneöindex. h tm l
　　　6) Ken2ich i H anak i, 私人通讯。
功能的实质。建成全长 cDNA 库后, 采用 PCR 的方
法即可获得某标记基因的全长 cDNA 及其剪接变
种[46 ] , 其容易程度一如探囊取物。也许基于这一点
认识, 聪明的日本人从 20 世纪 90 年代初期即开始
探索全长cDNA 的合成方法, 并因此在该领域取得
霸主地位。网上进入日本一些涉及基因组的研究机
构, 其基本起点即是从全长 cDNA 开始, 有的整个
研究所几乎全部以全长 cDNA 为研究基础 7) , 这不
能不给人以警示。Ξ
近几年来, 差异展示 PCR 与 cDNA 芯片技术
不断发展, 并进行了结合应用[8, 27, 47, 48 ] , 从而使分析
样品的数量和效率成海量地增加。然而, 对不同处理
(或状态) 的样品进行分析, 所得到的差异基因 (片
段)数目惊人, 在还未弄清楚这些片段的相互关系之
前, 它们对于揭示生命 (疾病生理现象) 的本质似乎
并无大的帮助; 即使借助进一步的生物信学分析, 将
这些基因 (片段) 进行拼接, 并消除冗余序列也是一
项庞大而繁复的工作, 最终的结果也只能是回头从
全长 cDNA 开始工作。日本的科学家则又先行一
步, 他们已将全长 cDNA 与 cDNA 芯片结合, 从而
建立了多个全长 cDNA 数据库[8, 49 ]。我国在相关领
域相对落后, 应该引起有关方面的重视。
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