全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(3)：226～234
Journa／of Wuhan Botanical Research
华中特有珍稀植物裸芸香的 AFLP遗传 多样性分析
杨 佳 ，李晓东 ，李新伟 ，史全芬 ，李建强h
(1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074；2．浙江大学现代农业研究示范中心，杭州 310029)
摘 要：采用选择性扩增片段多态性(AFLP)方法对华中特有单种属植物裸芸香(Psilopeganum sinense)的8个 自然
居群的遗传多样性进行了检测与分析。结果表明：裸芸香的遗传多样性较低，且居群内遗传多样性显著低于物种
水平遗传多样性。筛选出的 5对引物共得到 180个位点 ，76个为多态位点，多态位点百分率为 42．2％，8个居群多
态位点百分率为：3．3％ ～16．7％，居群平均多态位点百分率为 9．4％；8个居群 Nei多样性指数为 0．01987～
0．06987，Shannon’s多样性指数为 0．0197～0．0816。居群间分化系数 Gst=0．5069，居群间基因流为0．2432，不足以
维持居群间的基因交流及现有的遗传结构。AMOVA分析表明总遗传变异的13．17％存在于4个地理区域之间，
50．45％存在于地理区域内的居群间，36．38％的遗传变异存在于居群内个体间。NTSYS分析表明遗传距离与地理
距离不存在相关关系。UPGMA聚类结果表明长江南北两岸的居群并没有产生明显分化。最后，分析了裸芸香的
濒危原因并提出了有效的保育措施。
关键词：Psilopeganum$inen~e；AFLP；三峡库区；遗传变异；濒危机制；保育策略
中图分类号：Q949．752．7 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)03-0226-09
Analysis of AFLP Variation of the Endemic and Rare Species
Psilopeganum sinense in Central China
YANG Jia ， ，LI Xiao—Dong ，LI Xin—Wei ，SHI Quan—Fen ，LI Jian—Qiang ’
(1．Wuhan Botanical Garden，The Chimne Academy of&／ences，Wuhan 430074，China；2．Modern Agriculture
Research and Demonstration Center， 慨 Univer~ ，Hangzhou 310029，China)
Abstract：AFLP variation of 1 64 individuals of eight natural populations of Psilopeganum $irlerl~e．an
endemic and rare plant of Central China，wag an alyzed to investigate the genetic variation and genetic
structure of the species．A moderate low genetic diversity wag observed in the species and average variation
of po pulations signifcan tly lower than the variation of species leve1． A relatively low level of genetic
diversity was observed in the species，and the genetic diversity within populations was sign ifcantly lower
than that within the species． Five AnJP primers prod uced 1 80 ban ds，of which 76 were polymorphie，
aeeouting for 42．2％ ． e percentage of polymorphie bands of eight natural populations was 3．3％ 一
16．7％ ，respectively，with an average percentage of 9．4％ ． e Nei’s gene diversity of eight natural
populations was 0．01987—0．06987 an d the Shannon’s Information Index was 0．0197—0．0816．Average
of Nei’s gene diversity wag 0．03420．an d average of Shan non’s Inform ation Index was 0．05 10．They were
all lower than the average of species of the world leve1．but were higher than the average of the endemic
species leve1．The average of Nei’s gene diversitv an d Shannon’s Inform ation Index was 0．03420 and
0．05 10 respectively．which were lower than the average of species in the world level but higher than the
average of endemic species． In addition， Gst was 0．5069， which indicated that high population
diferentiation occured．Analysis of molecular variance (AMOVA)of 1 64 individual revealed that
13．17％ genetic variation was among the po pulations of four geographical regions an d 50．45％ genetic
variation among the populations within the four regions；an d 36．38％ of total variance was distributed
within po pulations．Nm was 0．2432，which implied that the gene flow was not enough to maintain gene
exchan ge and current genetic structure． e result of UPGMA cluster showed that eight natural
po pulations were genetically clustered in two groups，of which one was Yan duhe po pulation an d the other
included the remaining seven po pulations．Man tel analysis of NTSYS indicated that genetic divergence
wag not corelated with geographical distance．At last． we an alyzed the cause why P．$irlerl~e was
收稿日期：2007-01-12，修回日期：2O0r7 2 8。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30370101，30370153)；中国科学院方向性项目(KSCX2-SW．104)。
作者简介：杨佳(1979一)，女，硕士，从事遗传学相关研究。
· 通讯作者(Author for correspondence．E-mail：jianqlangl@hotmail．com)。
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 3期 杨 佳等：华中特有珍稀植物裸芸香的AFLP遗传多样性分析
endangered．an d we concluded two main factors as~Uows．One was lOW genetic diversity that maybe due
to bottleneck efect．inbreeding depression and the absent of natural selection，the other cause of population
decline of P．sinense appeared to be from human disturban ce．In correspondent with this．we proposed
some efective strategies to conserve the species．
Key words：Psilopeganum sinense；AFLP；The Three—Gorge Reservior Area；Endan gered mechanism；
Genetic variation；Conservation strategies
研究物种的遗传多样性对于保护遗传学研究具
有基础性作用，为了合理有效地开展保护遗传学研
究，首要的一步是了解并保护物种的遗传多样
性【1工】，而对于特有稀有物种遗传多样性的研究则
具有更为深远的意义。其遗传多样性的丧失不仅仅
使我们可能丧失对生物进化历史进程进行深人探讨
的机会，更重要的是，使生物对未来环境适应性降低
并因此而导致灭绝，从而使人类进一步发展所依托
的生物资源不复存在 。
裸芸香(Psi~peganum sinensis)是我国特有单种
属植物，隶属于芸香科(Rutaceae)裸芸香属，为多年
生短命草本植物 】，主要分布于湖北的巴东、兴山、
宜昌、宜都，重庆的武隆、巫溪、巫山、武陵、新乡(武
陵和新乡为本次调查中新发现的居群)以及贵州等
地。裸芸香是一种重要的药用植物 J，主治感冒发
烧、支气管炎、跌打损伤，其叶果可作为香料原料提
取芳香油。
裸芸香分布范围狭窄，主要分布在三峡库区及
周边地区，自然资源数量有限，被列为湖北省第二批
国家珍稀濒危保护植物。目前三峡库区已蓄水到
150 m，秭归香溪居群和巫山居群已被淹没，因而对
其制定有效保育措施刻不容缓。居群遗传结构及其
影响因子是制定物种有效保育策略和措施的依
据【6 J，物种的成功保育，在于保育物种的基因库，
最大限度保存其遗传多样性，以提供物种应对环境
变迁和持续进化的潜力 J。由此可见，要对裸芸香
实施有效保护，首先要明确其遗传基础。而以往的
研究多集中于化学成分分析 。¨’ ¨ ，对其遗传多样性
的研究很少 ¨。为了制定科学有效的保育策略，了
解物种自然居群的遗传多样性是至关重要的【1 ．1引。
本研究采用 ArI~(amplifed fragment length polymor．
phism)¨ ‘ 这种高效、可靠、稳定的分子标记 ’ 对
分布于三峡库区及其周边地区的8个裸芸香自然居
群的遗传多样性进行了检测，旨在进一步了解裸芸
香自然居群的遗传变异及遗传结构特征，探讨影响
裸芸香遗传结构的因素，推测其致濒原因，为制定有
效的保育策略提供科学依据。
1 材料和方法
1．1 材料
裸芸香的 8个 自然居群分两次采集，2001年 9
月中旬至下旬对湖北兴山湘萍、秭归香溪以及重庆
巫山和巫溪居群进行采样，2004年 3月 一5月对湖
北兴山高阳、巴东沿渡河、巴东信陵、长阳高家堰进
行采样(图 1)。在采样同时我们对各居群生境进行
了调查(表 1)。居群内随机选取 l5～3O个个体，摘
取新鲜嫩叶，放人硅胶中快速干燥后置于 4℃冰箱
中保存待用。
1．2 方法
1．2．1 DNA提取
根据改良的 CTAB法 副¨进行基因组总 DNA提
取。用 RnaseA消化除去 RNA【19]。DNA的质量和
浓度以紫外分光核酸测定仪(GENEQUANT，Eppen．
dof，Germany)测定，并采用0．8％的琼脂糖凝胶检
测其质量。
1．2．2 引物筛选
在 4个居群中任意选取 16个个体的 DNA样品
用于引物筛选。从上海博雅公司的30对引物中选
出5对带型清晰，多态性相对较高的引物(表2)作
为正式扩增的引物。
1．2．3 AFLP分析
AFLP分析按照 Vos等 刚¨报道的方法稍做修改
进行，其基本步骤如下：①取 200 ng模板 DNA于
2O L酶切消化反应体系 [含 0．3 EcoR I(1O u／
)，0．3 IxL(10 U／p．L) I和 4 L 5×反应缓冲
液]中，先 37~t2酶切消化 3 h，再 65 消化 3 h，以
1．5％ 的琼脂糖凝胶 电泳检测酶切效果，呈弥散
状；②DNA片段接头的连接反应体系总体积为
25 ，包 括 12．5 的接 头 连 接反 应 液 (1
EcoR I Adapter，1 IxL TurI Adapter，0．4 L T4DNA
Ligase)和 l2．5 L的酶切 DNA，混匀后，于 2l℃下
进行连接反应至少 2 h，最好过夜。用 0．1×TE缓
冲液将连接混合液稀释lO倍；③预扩增在总体积为
2O 的反应体系中进行[5 连接后稀释的模板
DNA，0．8 L(50 rig／ L)EcoR I+A弓I物，0．8 ixL
维普资讯 http://www.cqvip.com
武 汉植 物 学 研 究 第25卷
(50 ng／ L)MseI+C 弓I物，0．1 p,L (5 u／ )
Taq DNA聚 合 酶 ，2 p,L 10×PCR bufer，1．2 p,L
MgCI2]。PCR程序为：94~C 2 min，94℃ 30 s，56~C
1 min。72℃ 1 min，共 29个循环，72℃ 5 min后终
止反应，于4℃保存。用 0．1 x TE 25倍
后作 为选择性扩增 的模板 ；④选择性扩增采用
1．巫溪城厢镇；2．巫山双龙镇；3．巴东信陵镇；4．巴东沿渡河镇；5．兴山湘萍；6．兴山高阳；7．秭归香溪；8．长I；日高家堰
1．Chengxiang，Wuxi County；2．Shuanglong，Wushan County；3．Xinling，Badong County；4·Yanduhe，Badong County；
5．Xiangping。Xingshan County；6。Gaoyang，Xin~shan County；7．Xi~gxl，Zigui County；8．Gaojiayan，Changyang County
图 1 裸芸香 8个自然居群的分布
Fig．1 The distribution of the eight natural population ofPsilopeganum s ， e
表 1 裸芸香采样地点及生境
Table 1 The hab itats and localities of the sample8 of Psilopeganum s ， ， e
表2 各对引物序列组合、扩增总带数、扩增片段大小、多态带数、多态带百分率
Table 2 Sequence of pairs of primer，total number of loci，length of segments，number of polymorphie
loci，propo rtion of polymorphie loci
维普资讯 http://www.cqvip.com
第3期 杨 佳等：华中特有珍稀植物裸芸香的AFLP遗传多样性分析 229
10 反应体系[2．5 IxL经预扩增后稀释的模板
DNA，2 tzL(10 ng／tzL)的EcoR I+A选择性引物，
2 IxL的 MseI+C选择性扩增引物，0．125 L Taq
DNA聚合酶]。PCR程序为：94~C 4 rain，94~C 30 s，
65~C 30 s，72~C 60 s，1次循环 ；然后每循环 1次其
退火温度降低 0．7℃，执行 l2个循环；在 94~C 30 s，
72~C 60 s下执行22个循环后，终止反应，于4℃保
存；⑤加入3／4体积(7．5 IxL)的变性剂(98％甲酰
胺，0．03溴酚蓝和二甲苯氰)于95℃ 变性 5 rain，采
用 6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE缓冲液。
65W恒定功率电泳约 2 h。AFLP带型以银染法 】
获得。
1．2．4 数据统计与分析
将每对引物在所有样品扩增出的每一条 DNA
谱带作为一个位点，参照标准 Ladder，按引物对号一
DNA片段长度记录位点，样品有带则记为 1，无带则
记为 0，构建居群二态数据矩阵。采用 AFLP—Surv
1．0软件 及 POPGENE 1．31软件 对其进行处
理 ，得到 以下遗传多样性参数：① 多态 带数 AP
(number of polymorphic loci)和多态带百分率P(pro—
portion of polymorphic loci)；②Nei基因多样性指数
日(gene diversity)；(~)Shannon信息指数，(Shannon’S
information index)；④ 应用Nei 基因多度法计算
遗传分化度 Gst(the coeficient of gene diferentiation
among populations within species)，其关系式为 Gst=
Dst／Hr，其中Hr= +Dst，Hr为总遗传多样性，
为群体内的遗传多样性，Dst为群体问遗传多样性；
⑤根据公式Nm=0．5(1一Fst)／Fst间接推算居群
问基因流，在此，Fst值等同于 Gst；⑥Nei的遗传距
离 D(gene distances)。采用 NTSYS软件 进行居
群聚类分析。
采用 AMOVA(analysis of molecular variance)软
件进行分子方差分析，计算反映群体遗传结构及变
化的平方和、均方、方差分量，求得遗传多样性在地
区间，地区内以及居群内的分布。另外，我们把长江
南岸的2个居群(信陵、高家堰)和北岸的6个居群
(沿渡河、高阳、湘坪、巫山、巫溪、香溪)分为 2个类
群，进行 AMOVA分析，以明确遗传多样性在长江两
岸的分化情况。
2 结果与分析
2．1 AFLP遗传多样性
从 30对引物中筛选出 5对引物(表 2)对裸芸
香 8个自然居群的 164个样品进行 了 AFLP检测。
结果共得到 180条清晰谱带，介于 70～400 bp之
间，其中76个多态位点，多态位点百分率为42．2％。
不同引物扩增出的位点数不同。其中引物 P4扩增出
的位点数最多(53个)，引物Pl扩增出的位点数最
少(20个)。另外 ，多态位点在不同居群中的分布也
有差异，8个自然居群扩增出的多态位点百分率为
3．3％一16．7％，其中高阳居群最高(16．7％)，信陵
居群次之(12．8％)，湘萍居群最低(3．3％)(表 3)。
表 3 裸芸香自然居群的遗传变异
Table 3 Genetic variation of eight natural populations of P．sinense
Notes：PPL=P／oldon ofpolymorphlc loci：H ：Nei’s gen~divemity；，=Shannon’s Information Index．
维普资讯 http://www.cqvip.com
武 汉植 物 学 研 究 第25卷
值得注意的是：居群特有位点较多，为 15个，占总多
态位点的 19．6％，多分布于沿渡河、高阳、长阳居群
中，而在巫山和巫溪居群中则没有分布。其中居群
内特有单态位点为4个，占总多态位点的5．3％，这
可能暗示着裸芸香居群分化存在着特殊规律。
裸芸香的遗传多棒眭比较低(表3，表4)。表现在：
居群平均多态位点百分率为9．4％，其中高阳居群最
高(16．7％)，湘坪居群最低(3．3％)；Nei’s基因多样
性(I／)为0．01987～0．06987，平均为0．03420；Shan—
non’S多态性信息指数(，)为 0．0197～0．0816，平均
为0．0510。其中高阳居群均为最高(H=0．06987，
，=0．0816)，湘 坪居 群均最低 (H =0．01987，，=
0．0197)；物种 水平 上 Nei’s基 因多样 性指 数 为
0．081 1，Shannon’S多态性信息指数为 0．1323。
2．2 居群遗传结构
裸芸香遗传结构分析表明，各居群遗传分化较
大。8个自然居群总的遗传多样性 Ht=0．0971，其
中居群内保有的遗传多样性(胁)为 0．0478，居群间
遗传多样性( ￡)为 0．0492，基因分化系数 Gst为
0．5069，表明总遗传多样性的 50．69％来源于居群
间遗传变异，49．31％来源于居群内遗传变异，也就
是说居群间的遗传分化较居群内大。AMOVA软件
分析结果表明，有 13．17％ (P=0．0695)的多样性
来 自地区间，有 50．45％ (P<0．001)的多样性来
自居群内，有 36．38％ (P<0．001)的多样性来 自
居群内。在对长江两岸的居群遗传分化分析中，总
遗传多样性的0．73％(P=0．3786)来 自群体间，
62．5％ (P<0．001)来 自群体内居群间，37．12％
(P<0．001)来自居群内。
裸芸香各居群间基因流根据公式 Nm=0．25
(1一Fst)／Fst=0．2432 (<1)，说 明居群间基因
流有限，不足以维持各居群间基因交流及现有的居
群遗传结构。
2．3 居群遗传距离与 UPGMA聚类分析
裸芸香 自然居 群 间遗 传距 离在 0．0189～
0．1091之间，平均遗传距离为 0．0528，其中沿渡河
居群与巫山居群遗传距离最大(0．1091)，高阳居群
与香溪居群遗传距离最小(0．0189)，而沿渡河居群
与其他居群的遗传距离相对较大(表 5)。
聚类结果显示，高家堰、香溪、高阳、信陵 4个
居群优先聚类，并且成为一个主聚类组，反映出它
们较近的遗传关系，而巫山、巫溪和湘萍、沿渡河居
群与主聚类组明显分离，显示出相对较大的遗传分
化。另外，位于长江南岸的高家堰和信陵居群并没
有优先聚类(图2)。
2．4 居群遗传距离与地理距离的Mantel检测
用 NTSYS软件对居群遗传距离与地理距离进
行 Mantel检验，以明确遗传距离与地理距离之间的
关系。结果表明：裸芸香居群遗传距离与地理距离
不存在相关性(r=一0．19415，P=0．1959)。
表 4 裸芸香8个自然居群基因多样性分析
Table 4 Genetic diversity analysis of eight natural populations of P．$il~l$e
N岫 ：胁 =total gene diversity；Hs gene diversitywithin populations；Dst gene diversity among populations；Gst=the coeficient of gene diferenti．
ation；Ⅳm=geneflow，Nm=O．25(1一Gst)／Gst．
表 5 裸芸香 8个自然居群间的遗传距离
Table 5 Nd’8 genetic distance of eight natural populations of P．$i／~／l$e
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 3期 杨 佳等 ：华中特有珍稀植物裸芸香的 AFLP遗传多样性分析
0 02 0 03 0 04- 0 05 0 06
Genetic distance
图 2 裸芸香 8个自然居群的 Nei’s遗传
距离 UPGM_A聚类图
Fig．2 Dendrogram of UPGMA based on Nei’s genetic
distance of the eight natural pOl：lulations 0f P-sinense
(Population cedes aIe given in Table 1)
3 讨论
3．1 低遗传多样性
本研究结果表明，裸芸香具有较低的遗传多样
性(P=42．2％，lit=0．0971)，低于世界广布种平均
水平，略高于特有种平均水平 1，并且种群内遗
传多样性的平均水平(P：9．4％，H：0．3420)要大
大低于物种水平。与其他稀有物种和地方特有物种
的AFLP结果相比，在物种水平上裸芸香的遗传多
样性处 于中等水平，而从居群水平来看则较
低 ’ J。物种遗传多样性的高低与很多因素有关，
而在遗传多样性形成的过程中，有可能其中一种因
素起到了主导作用。无论是在种群数量和大小、生
物地理，还是在物种形成上的任何波动都会对现有
物种的遗传组成起到至关重要的作用 】。Ham—
rick和Godt 对449种植物的653例等位酶遗传
变异进行了研究，他们综合分析了植物遗传多样性
与系统位置、分布范围、分布地区、生活型、繁育系
统、种子传播方式、生殖类型和演替阶段 8个特征的
相互关系，发现影响种群遗传变异大小的主要因素
依次为：繁育系统、分布范围和生活型，并指出地方
特有种或狭域分布的种具有较低的遗传多样性。
KalTOn[271总结了11群同属种的对比研究，结果也
表明，不管是从多态位点比例还是从平均每个位点
等位基因数 目上看，特有或稀有种的遗传变异水平
都要比其近缘(同属)广布种为低。裸芸香是我国
特有单种属植物，仅分布于湖北(巴东、兴山、宜昌、
秭归)，重庆(巫山、巫溪、丰都、南川、武隆)等地，作
为一种狭域分布的特有单种属多年生草本植物，裸
芸香较低的遗传多样性符合以上规律。
造成裸芸香较低遗传多样性的因素是多方面
的。首先，裸芸香分布区域相对狭窄，生境相对单
一
，多种环境对它的选择作用对其遗传多样性的积
累作用微弱；其次，由于自然或人为的因素使得裸芸
香受到瓶颈效应(botleneck efect)的作用。裸芸香
在系统进化上的孤立性即单种属的华中特有种，自
花受精以及低的遗传多样性水平表明该种正在经历
瓶颈效应的过程中。在裸芸香的带型中出现了相当
比例的居群特有位点(19．6％)以及居群内特有单
态位点(5．3％)，也进一步证实了瓶颈效应对裸芸
香遗传基础的影响 】。高阳居群的遗传多样性最
高(P=16．7％，H=0．06987)可能是由于受到瓶颈
效应影响较小，而且当地微生境复杂(其气候垂直
差异大，小气候特征明显)的原因。湘萍居群的遗
传多样性最低(P=3．3％，H=0．01987)则可能是
经历了严重的瓶颈效应，而另一方面也可能与采样
量有关 ；再次，自交或近交衰退引起裸芸香居群
内遗传多样性降低。裸芸香物种水平的多样性显著
高于居群水平的多样性正说明了由于居群较小，传
粉媒介传粉能力有限(小型昆虫)而使得种群内个
体趋于近交或 自交(套袋实验证明，裸芸香可 自交
结实)。虽然我们对裸芸香的繁育系统并不很 了
解，但以上条件必然导致近交或自交的频繁发生，从
而导致近交或自交衰退。而一般认为近交或 自交衰
退会降低个体适应性(individual fitness)，降低居群
的遗传多样性和增长速度 -3]，从而使其居群内呈
现很低的遗传多样性。
另外，我们得出的结果与 RAPD的结果(P=
67．06％，H=0．2082)有所差异 ，这有两方面的
原因，第一，由于分子标记的不同造成这种差异。一
般来讲，AFLP比RAPD能够检测出更多的位点，覆
盖了基因组中更多的片段 J，在这样的条件下多态
带比例减少属于正常情况；第二，采样地 的差异。
AFLP的样品采自湖北，重庆的 8个 自然居群。包括
了RAPD标记所做的5个居群，并且增加了高阳居
群以及长江以南的长阳、信陵居群，从空间上看，样
本所覆盖的面积对遗传参数估算有相当重要的影
响，样本覆盖面积占整个群体面积的比例越大，对遗
传参数引起的偏差可能越小[2 ，因此，采样地的覆
盖范围以及样本量的增大使得实验结果更加接近裸
芸香的真实遗传多样性水平。
3．2 居群分化与基因流
以往的研究 已经表明了影响植物种群遗传
结构的主要因素依次为i繁育系统、分布范围和生活
型。另外，种子扩散机制也显示了类群间居群分化
敞 眦 螂
维普资讯 http://www.cqvip.com
232 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
系数上的很大差异，靠风力散布的植物具有低水平
的居群分化(Gst=0．143)，而靠重力散布的植物具
有相当强的居群分化水平(Gst=0．277)，一般认为，
自交、短命草本植物具有相对较大的居群分
化 】。裸 芸香 的居 群分 化 系 数很 大 (Gst=
0．5096)，其遗传多样性 50．96％分布在居群间，
49．o4％ 分布在居群内。AMOVA软件分析结果也
表明遗传多样性主要分布于地区间(13．17％)和居
群间(50．45％)。这一结果与 RAPD的结果(Gst=
0．5391)基本相同。
我们推断造成裸芸香居群间遗传分化大的原因
主要有三个：① 自交或者近交在裸芸香的交配系统
中占有相当比例。裸芸香的居群分化系数 (Gst=
0．5096)与 自交种的居群分化系数(Gst=0．51)相
近 】。交配系统一直被视为影响植物种群遗传结
构的一个重要因素 】。它控制着基因由配子体在
两个世代间的传递与延续，对植物种群遗传结构有
着重要的作用。由于裸芸香为小型昆虫传粉，传粉
能力受到很大限制，而种子多通过重力或水流传播，
传播距离也极为有限，这样就迫使裸芸香进行 自交
或近交，从而使得居群内遗传多样性降低并趋同，进
而居群间遗传分化增大；②种子的传播方式。裸芸
香的果实为蒴果，顶部呈 口状凹陷，果实成熟时开
裂，种子长约 1．5 mln，厚约 1 mil，表面无翅、无刺，
仅具有疣状突起 】，具有重力传播 的特征。此外，
野外调查发现裸芸香的分布地点大多为水流沿岸的
斜坡地带，也就是说裸芸香的分布与水流有一定的
相关性，因此，我们推测裸芸香的种子还有可能靠水
流传播。而这两种传播途径都具有很大的局限性，
使得裸芸香居群间基因交流受到很大的限制，从而
增大居群间遗传分化；③生境片断化的结果。由于
“随机取样”效应的作用，生境片断化将会增大居群
间的遗传分化 】，而交配系统，种子传播的受限则
使得生境片断化在形成遗传结构的过程中继续起作
用。另外 ，Mantel检验的结果也很好地解释了“随机
取样”(random sampling)作用，使裸芸香并没有按照
地理距离的远近分布。
裸芸香居群间基因流为0．2432(<=1)，这就
意味着居群间基因流不足以防止居群间的遗传分
化。Wright(1951)p¨ 指出：如果 Nm小于 1，则由
于遗传漂变可导致小居群间明显分化，而遗传漂变
作用加剧，遗传变异减少，会导致居群适合度下降。
由此可见，裸芸香居群间基因流过小是小居群分化
的主要原因 。
为了更加清楚的认识裸芸香的遗传基础，对于
裸芸香的进化历史、繁育系统、演替阶段等方面还需
要更深入的了解。
3．3 居群聚类分析与 Mental检验
从居群聚类图分析，巴东居群与其他居群遗传
距离较远，自成一支，其余居群中香溪、高阳、信陵、
高家堰4个居群最先聚类 ，巫山、巫溪聚类后与这 4
个居群聚类，最后与湘坪居群聚类。位于长江南岸
的2个居群并没有与长江北岸的居群产生明显分
化，在 AMOVA分析中也得到了同样的结果(南北两
岸分化仅占总遗传多样性的0．73％)。这说明一方
面生境片断化的时间不长，随机取样作用在居群结
构的形成上仍然起作用；另一方面也可能说明长江
并没有成为裸芸香扩散的障碍，这与我们的种子扩
散机制比较吻合，也就是说，水流可以作为裸芸香种
子扩散的一种媒介。在实地调查中，我们发现 ，一般
裸芸香有分布的地方(多为水流旁边)在水流两岸
均有分布，而且从其种子形态大小来看也可适应水
流传播。
居群遗传距离与地理距离的 Mental检验表明，
两者不相关(r=一0．19415，P=0．1959)，这主要是
由于生境片断化的“随机取样”效应所致。另外，由
于裸芸香多分布于低海拔地区，人为因素(如开荒
种田和水利工程)对其影响较大，生境片断化是造
成这种不相关性的重要原因。这个结果同时也说明
了居群间基因交流十分有限 】，使得居群间遗传差
异很难通过有效基因流来弥补。而此结果与 RAPD
的结果 (显著相关，r=0．93094，P=0．9861)有差
异，但是从聚类图来看，AFLP聚类 图中所包括的
RAPD的5个居群聚类情况基本一致(巴东居群与
其他居群遗传距离较远，巫 山和巫溪聚在一起)。
也就是说，包含更多的居群更能说明遗传距离与地
理距离的真实关系。
另外，值得注意的是，居群间的遗传分化较大而
居群间的遗传距离则相对较小，这也许是从另一个
侧面反映了较低的遗传基础。居群间遗传分化反映
了多态位点的分化程度，居群间遗传距离则反映了
在所有位点基础上的各居群的遗传关系。也就是说
居群间较小的遗传距离反映了整个物种较低的遗传
基础，而较大的遗传分化则反映了居群问有限的基
因交流。
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 3期 杨 佳等 ：华中特有珍稀植物裸芸香的 AFLP遗传多样性分析 233
3．4 濒危原因及保育策略
3．4．1 濒危原因探讨
关于物种濒危的机制一直是遗传学家和生态学
家争论的焦点，遗传学家偏重遗传基础，而生态学家
则强调生态环境的作用 】。而一个物种的濒危往
往是两方面因素共同作用的结果。裸芸香的濒危就
是内外因共同作用的结果。一方面，自交衰退、瓶颈
效应和缺乏自然选择作用导致裸芸香的低遗传多样
性是造成其濒危的内在因素。根据 自然选择的基本
原理，居群的进化速率与其遗传多样性成正比，换句
话说，一个群体中遗传多样性的下降意味着其适应
环境变化能力的下降 ．3 。裸芸香的低遗传多样
性决定了其很难适应变化的环境，又由于人类活动
的影响，裸芸香的生境正在遭受严重的破坏，这就使
得裸芸香遗传基础薄弱的特点更加凸显出来。结果
造成其资源的不断减少以致濒危。
另一方面，人为因素造成的适宜生境的不断缩
小是裸芸香濒危的外在因素。裸芸香的生存环境在
低海拔的河岸边、溪沟边。容易受到人类生产活动和
水利工程的影响。裸芸香大多分布于三峡库区及其
周边地区，三峡工程的实施必然对其生境造成极大
的毁坏，使其生境进一步片断化。另外，由于裸芸香
是一种重要的药用植物，人为采集对其资源形成了
很大的威胁，人为的开荒种田等活动也使其生境进
一 步缩小，对裸芸香资源造成很大的威胁，丰都居
群的灭绝主要就是由于人类活动(如开荒种田等)
造成的。丰都居群以及香溪、巫山居群的灭绝为我
们敲响了警钟，必须尽快实施有效措施保护裸芸香
资源。
3．4．2 保育策略
裸芸香种质资源的有效保育对该物种的保存、
群落和生态系统的维持有着重要意义 J，裸芸香
作为我国特有的单种属珍稀植物，其资源正在遭受
着不断减少的威胁，制定和实施有效的保育措施迫
在眉睫。通过对裸芸香遗传基础的了解，我们提出
如下保育策略：裸芸香居群间分化较大，遗传多样性
主要分布在居群间，任何一个居群的丧失都会造成
其遗传多样性的损失，并降低其适应潜力，因而我们
应该保护尽可能多的种群，高阳居群遗传多样性最
高，沿渡河居群、高阳居群、长阳居群具有居群特有
位点，应该对其进行重点保护 ]。种群内遗传多
样性很低是裸芸香遗传结构的又一特点，为了丰富
种群内的遗传多样性，我们应该人为加强其种群间
基因交流，可以在种群间进行个体迁移。由于裸芸
香有相当一部分资源位于三峡库区，三峡工程的实
施将对其造成严重影响，对于受到三峡大坝影响的
地区只能进行迁地保护，在迁地保护过程中应进行
混合繁殖。中科院武汉植物园早在 1995年就开展
了裸芸香的迁地保护工作，但是由于其对异地生境
的适应能力较差，并不算成功 引¨。2004年 3—5月
间又分别对长阳高家堰、巴东沿渡河、兴山高阳居群
共约 150株个体进行了迁地保护，迁移过程中我们
发现裸芸香对积水反应敏感，裸芸香根系发达，多生
于坡地，我们推测其虽然多分布于沿河岸地带，但一
般为坡地，说明其可能喜干旱环境，另外在夏季有易
倒伏的特点。基于以上各点，我们认为裸芸香的迁
地保护地宜选择与其原始生境相似的坡地灌丛中。
我们在黄陂寿山寺的 3棵迁地保护植株长势 良好。
能够很好的完成其生活史，而所选择的生境就是与
裸芸香原始生境很相近的坡地灌丛中，这也证明了
我们提出的生境地是合理的。
对于未受到三峡工程影响的地区，就地保护是
最佳选择。而在就地保护过程中应该对不同种群间
进行个体迁移，以提高种群的遗传多样性进而提高
其适应潜力。另外，对于这些地区防止其生境的进
一 步破坏以及人类的采集活动是极为重要的。这就
需要向当地居民宣传保护这一珍贵资源的重要性，
提高当地居民的保护意识。
参考文献：
[1] Haig S M．Molecular contributions to conservation[J]．Ecology，
1998，79(2)：413—425．
[2] Rosseto M H，Hariss F c L，Mclauchlan A．1nterspecifc ampli．
fication oftea tree(Melalenca alternifolia-Myrtaceae)micresate1．
1ite loci-potential implication for conservation studies[J]．Aust J
Bio，2000，48：367—373．
[3] 王峥峰，彭少麟．植物保护遗传学 [J]．生态学报，2003，23
(1)：158—172．
[4] 郑重．湖北的珍贵稀有植物 [J]．武汉植物学研究，1986，4
(3)：279—296．
[5] 黄成就．中国植物志(第 43卷)[M]．北京：科学出版社。
1997．89—91．
[6] Lande R．Genetics and demography in biological conservation
[J]．&／ence，1988，241：1455—1460．
[7] Leberg P L Genetic consideration in the design of introduction
programs[J]．Transactions ofthe North American删 f and
Natural Resource Conferenge。1990，551609—619．
[8] Hamrick J L，Godt H J W，Murawski D A。et a／．Corelation be-
tween species traits and allozyme diversity：Implications for conser-
vation biology[A]．In：Falk D A，Hlosinger K E eds．Genetics
and Conservation of Rare plants[c]．New York USA：Oxford
University Press，1991．76—86．
[9] 王洪新，胡志昂．植物的繁育系统、遗传结构和遗传多样性
维普资讯 http://www.cqvip.com
234 武 汉 植 物 学 研 究 第25卷
保护[J]．生物多样性，1996，4(2)：92—96．
[1O] 袁萍，张银华，王国亮，南蓬 ，龚复俊．中国珍稀植物裸芸香
化学成分研究 [J]．武汉植物学研究，1999，17(2)：184—
186．
[11] 叶其剐，徐惠珠，王诗云．裸芸香 的组织培养与植株再生
[J]．植物生理学通讯，1995，1：43—44．
[12] 宋卫华，李晓东，李新伟，黄宏文，李建强．三峡库区稀有植物
裸芸香的遗传多样性和保育策略[J]．生物多样性，2004，
12(2)：227—236．
[13] TaylorBL，DizonAE．The needto estimatepowertolink genet—
ies and demo~Faphy for cortservation[J]．Conserv Biol，1996，
10：661—664．
[14】 Talmon DA．DraheimHM。MilsL S。AlendofFW．Insishts
into recently fiagmented vole po pulations from combined genetic
and domographic data[J]．MolecularEcology，2002，11：699—
709．
[15] O’Brien S J．A roleformolecular geneticsin biological con8erva—
fion[J]．ProcNagAcad USA，1994，91：5784—5755．
[16] Voa P，Hogem R，Bleeker M，Reijans M，Van De，Lee T，
Homes M．AFLP：A new technique for DNA fingerprinting[J]．
Nuclo／c Add胝 ，1995，23：4407—4_414．
[17] Powel W，Morgante M，Mndre C．The comparison 0f R兀．P。
RAPD，AFLP and SSR(microsatellite)nld【ers for germplasm
anal3,sis[J]．Mol Breed，1996，2：225—238．
[18] Doyle J J，Doyle J L．A rapid DNA isolation procedure for smal
quantities 0ffresh tissues[J]．Phytochemlcal Buletin，1987，9
(1)：ll一15．
[19] Ausubel FM，BrentR，KingstonRE，MooreDD，Scidman JG，
Smith J A，Slum K．Current Protocols in Molecular Biology[M]，
New York：Wiley，1987．
[20] Chaloub B A，Thibault S，Laucou B．Sliver stalning and recov．
ery of Ar~e(TM)amplifcation products on large denaturing poly—
anrylamide gels[J]．Biotechn／ques，1997，22：216—218．
[21] Vekemans x，Beauwens T，Lemaire M，Roldan．Ruiz I_Data
from amplified fragment length polymorphism (AFLP)markers
show indication 0f size homoplasy and of a relationship between
degree 0f homoplasy and fragment size[J]．Molecular Ecology，
2002。11：139—151．
[22] Yeh F C。Boyle T J B．Population genetic analysis 0f co-domi．
nantand dominant nl~ ersandquantitativetraits[J]．Belgian J
Bat，1997，129：157．
[23] Nei M．Analysis 0f gene divemity in subdivided populations[J]．
尸rwNatlAcad USA，1973(12)：3321—3323．
[24] R0h】f F J．NTSYS．PC．Version 2．10．New York：Applied Bio-
statistics Inc，1994．
[25] Hamrick J L，Godt M J W．Alozyme diversity in plant species
[A]．In．-Brown A D H，Clegg M T。Kahler A L eds．Plant
Population Genetics，Breeding and Genetic Resources [c]．
Sinauer：Sundeflan d．1989．43—63．
[26]
[27]
[28]
[29]
[3O]
[31]
[32]
[33]
[34]
[35]
[36]
[37]
[38]
[39]
[4o]
[41]
Hamrick J L．GodtM JW ．Efects oflife historytraits on genetic
dive~ity in plant spoeies[J]．Philosophical Transactions ofLon-
donBIOlog／~ ．sa匆 ，1996，351：1291—1298．
Karin Tremetsberger，StuesyTod F．GuoY P，BaezaCarlosM ，
Han na Weis ，Samuel Rosabele M．Amplifed fragment length
polymorphism(AFLP)variation within and among populations of
Hypochaeds acatd／s(Astemccae)ofAndeansouthern[J]．South
Amer／ca，2003，5：237—245．
李昂，葛颂．不同采样策略对细距堇菜遗传多样性估算的影
响[J]．植物学报，2000，42(10)：1069—1074．
Urs LandergoR，Rolf Holderegger，Gregor Kozlowski，Schnefier
Jakob J．Historical botlenecks decrease genetic divemity in nat—
ural populations 0f Dryopteris crlstata[J]．Hered~y，2001，87：
344—355．
李昂，葛颂．植物保护遗传学研究进展[J]．生物多样性，
2OO2，10(1)：61—71．
Dobson A P，Mace G M，Poole J，Bret R A．Conservation biolo-
gy：The ecology and genetics 0f endangered species[A]．In：
Genes in Ecology[c]．Oxford：Blackwel，1992：405—430．
Oostermeijer J G B．Population viability analysis ofthe rare
tinna pneumonauthe：the importance of genetics，demography an d
reproductive biology[A]．In：Young A G，Clarke G M eds．Ge-
netics，Demo~Faphy and Viability ofFragmented Populations[C]．
U K：Cambridge。2000：313—334．
Brook B W ，Tonkyn D W ，O’Grady J J，Frankham R．Contribu—
tion of inbreeding to extinction risk in threatened species[J]．
Conservation Ecology ，2002，6：16．
邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学 中的分子标记
[M]．北京：科学出版社，2001．
Loveless M D，Hamrick J L．Ecological determinants of genetic
structure in plant population[J]．Ann Rev Ecology Systemat／cs。
1984，15：65．
Bartish I V，Jeppssen N．Nybow H．Population genetic structure
in the dioecious pioner plant species Hippophae rhamnoides in—
vestigated by random amplifed polymorphic DNA (RAPD)
markers[J]．Molecular ecology，1999，8：791—802．
Wright S．The genetical structure ofpopulation[J]．Ann Eugen，
1951，15：323—354．
邱英雄 ，黄爱军，傅承新．明党参的遗传多样性研究[J]．植
物分类学报 ，2000，38(2)：111—120．
Lande R，Shannon S．Th e role of genetic variation in adaptation
and population persistence in a changing environment[J]．Evo-
lution，1996，50：434—437．
Huang H W，Han X G，Kang L，Raven P，Jackson P。Jackson
P W，Chen Y Y．Conservation native plants in China[J]．&／ence，
2002，297：935—936．
Hogbin P M ．Peak8ll R．Evaluation of the contribution of genetic
research to the management of the endangered plant Z／er／a pros．
trate[J]．Consen~ion Biology，1999，13：514—522．
维普资讯 http://www.cqvip.com