全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(2)：111～115
Journal of Wuhan Botanical Research
基因枪介导小麦遗传转化的几个重要影响因素的研究
黄 萱，徐子勤 ，郝建国，李 晶
(西北大学生命科学学院生物技术省级重点实验室，西安 710069)
摘 要：用基因枪将携带 gus—bar双标记基因的质粒 pDB1及携带 RC24几丁质酶基因的质粒 pARN6、pBAB3、
pYAO24(pYAO24还带有 nptl选择标记基因)以 pARN6+pDB1、pBAB3+pDB1及 pYAO24三种组合方式转入
8个小麦品种的未成熟胚盾片组织，经选择培养获得转基因植株。对基因枪介导小麦遗传转化的主要影响因素，如
基因型、材料、金粒制备和轰击参数进行分析，发现西农88是理想的转基因受体基因型，开花两周后的小麦幼胚为
理想的轰击材料，制备子弹时合适的金粒含量为3o～50 g／次，充分混匀金粒悬浮液可以减少幼胚损伤和提高转
化频率。GUS染色发现以蔗糖为渗透剂所产生的蓝色斑点比以甘露醇为渗透剂所产生的蓝色斑点大。针对载体上
的npt，筛选标记基因，150 mg／L的硫酸卡那霉素为较理想的选择剂浓度f针对载体上的bar筛选标记基因，PPT
的浓度为 2 mg／L易出现假阳性植株，因此应将浓度增加到 3～5 mg／L。
关键词：基因枪方法 ；遗传转化；小麦；影响因素
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—470X(2004)02—011 1一O5
Factors Affecting Wheat(Triticum aestivum L．)Transformation
M ediated by Biolistic Bom bardm ent
HUANG Xuan，XU Zi—Qin。，HAO Jian—Guo，LI Jing
(Provincial Key Laboratory of Biotechnology，College of Life Sciences，Nomhwest University，Xi’an 710069，China)
Abstract：The plasmid pDB1 with gus—bar as
pBAB3、pYAO24 with RC24 gene encoding rice
double marker gene，and the plamsid pARN6、
basic chitinase were CO—transferred to immature
embryos of 8 wheat genotypes in combination of pDB1+pARN6，pDB1+ pBAB3 or pYAO24 via
particle bombardment．pYAO24 has npt J as selective gene．Transgenic plants were regenerated
after selective culture．Factors influencing wheat transformation via particle bombardment，such
as genotype，gold particle preparation，parameters of bombardment，were analyzed．It is found that
Xinong 88 is a very ideal genotype of genetic transformation，immature embryos two weeks post—
polination were suitable wheat materials of bombardment，3O一 5O g gold particle per bombard—
ment was appropriate，mixing the gold particle suspension thoroughly could reduce the injury to
immature embryos and enhance the transformation frequency．GUS histochemical staining re—
vealed that blue spots produced by sucrose as osmoticum were bigger than that of mannitol as OS—
moticum．150 mg／L kanamycin was adopted when npt 1 was used as selective gene．It can produce
false positive plants easily that the phosphinothricin(PPT)concentration was 2 mg／L when bar
was used as selective gene．We should enhance the concentration form 2 mg／L to 3——5 mg／L in
the future．
Key words：Biolistic bombardment；Transformation；Wheat；Influencing factors
收稿 日期：2003—05—22，修回日期；2003一I2-I7。
基金项目：陕西省自然科学基金重点项目(2001SM24)资助；陕西高校重点实验室项目(陕教研(2001)29号一2)资助．
作者简介：黄萱(1979一)，女，陕西西安人，汉族，西北大学在读博士研究生(E—mail：huang79xuan@sohu，corn)。
通讯作者。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，因此，将
现代生物技术尤其是植物转基因技术应用于小麦的
遗传改良研究有着十分重要的意义。随着 Ubil、
Actl、Emu等单子叶植物高效表达 启动子，bar、
hpt、npt 、gfp等选 择 标 记 基 因 和 EHA105、
MOG101、ABI、AGI等高毒性农杆菌菌株的运用，
以及对 CaMV35S组成型表达启动子的改造(上游
区插入了 1～2个增强子)，近几年来单子叶植物遗
传转化研究取得了可喜进展[1]。目前，小麦转基因最
常用的方法为基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通
道法。但是，由于小麦不是农杆菌的天然宿主及禾谷
类植物对农杆菌没有伤反应现象[2]，小麦农杆菌介
导的基因转移一直是世界上的一道难题。直到 1997
年 Cheng等[3 用农杆菌杆感染小麦幼胚及胚性愈
伤组织，首次通过农杆菌介导法获得了可正常发育
的小麦转基因植株。近几年，我国学者也作了大量工
作 。自Vasil等[7]在世界上首次报道利用基因枪
转化技术获得小麦转基因植株至今，由基因枪介导
的小麦遗传转化作为改良小麦性状、提高小麦抗性
的主要手段之一被广为应用，抗生素、抗除草剂基因
及不少功能基因被成功转入小麦[8-13~。但是，其与玉
米、水稻等其它禾谷类作物相比，小麦遗传转化研究
相对落后，对由基因枪介导小麦遗传转化的重要影
响因素缺乏较为系统的分析。故此，我们结合几年来
大量的实验，对小麦遗传转化的限制因素如基因型、
培养条件、材料、轰击参数、金粒制备等进行了详细
的研究，并在此基础上开展了由基因枪介导的小麦
遗传转化工作。
1 材料与方法
1．1 材料的准备
本实验选取 了 8个优 良的冬小麦(Triticum
aestivum L．)品种用于转基因实验，包括西农1376、
宝丰7228、黑小麦、西农88、盐2、801OlT、甘麦、西农
8727等。材料种植于西北大学生命科学学院植物园
内。在小麦开花受粉后 2个星期左右，选取约1．O～
1．5 mm大小、半透明状未成熟胚作为起始外植体。
幼嫩种子在超净工作台内用 7O 酒精表面灭菌
6O S，0．1 升汞+Tween一8O灭菌10 min，无菌水冲
洗3次以上；在无菌条件下剥离幼胚，盾片组织向上
置于MS (MS+2，4-D 2 mg／L，不含MS有机成分，
3 蔗糖)培养基上，20~C、黑暗条件预培养1～3 d。
1．2 质粒的准备
我 们 实验 所 用质粒 包 括 pARN6、pBAB3、
pDB1和 pYAO24四种 (见表 1)。其 中 pARN6、
pBAB3及 pYAO24都含有水稻碱性几丁质酶的编
码基因 RC24，pDB1上有 bar基因和gus基因。bar
基因编码草丁膦(phosphinothricin，PPT)乙酰转移
酶可使 Basta(有效成分 PPT)失活，可作为植物选
择标记基因。pYAO24还有 npt，基因编码新霉素
磷酸转移酶，可失活卡那霉素，是我们实验使用的另
一 个植物选择标记基因。4种质粒的宿主细胞均为
大肠杆菌，根据王关林等[1I]的方法，小量提取质粒
DNA
表 1 不同质粒所携带的基因情况
Table 1 Different genes with different plasmids
1．3 渗透处理和微弹轰击
预培养的未成熟胚在微弹轰击之前转至含
0．6 mol／L蔗糖的MS 培养基，于20"C黑暗条件下进
行5～12 h高渗处理。将2 mg金粒(直径1 m)、5
质粒DNA(1 g／ L)、2O L亚精胺(O．1 mol／L)和
5O L CaC1。(2．5 tool／L)混合，漩涡或超声波处理使
之均匀，4 200 r／rain离心5 s去上清，沉淀用250 L无
水乙醇清洗，并重新悬浮于240 L无水乙醇。将包被
有 DNA 的金粒 悬浮液 涂 于微弹 承载 片，每片
3．5 L，待干燥后用于基因枪轰击。每次涂液前将悬
浮液漩涡处理使之均匀。基因枪型号PDS1000／He
(Biorad)，气压采用 1 350 psi或1 100 psi。转化材料
与金粒承载片之间的距离为 6 cm，金粒承载片与爆
裂片之间的距离为 2．5 cm。真空度为 27英寸汞柱。
质粒采用 3个组合：pARN6+pDB1、pBAB3+
pDB1和 pYAO24。
1．4 培养、选择和再生体系
轰击后 16 h，将未成熟胚从高渗培养基转至
MS 培养基，2o℃ 暗培养 2周，随时将长大的胚芽
鞘切除。恢复培养 2周后 ，将愈伤组织转至 MS。
(MS1+PPT 2 mg／L或 Kan 150 mg／L ，不含 MS
有机成分，3 蔗糖)培养基进行选择培养。选择培养
2周后，将愈伤组织转至再生培养基 MS。(MS+
0．1 mg／L 2，4-D+PPT 2 mg／L或 kan 150 mg／L，
不含 MS有机成分，3 蔗糖)。1个月后挑取带有绿
芽的愈伤组织转至 MS无激素培养基(无有机成分，
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第 2期 黄 萱等：基因枪介导小麦遗传转化的几个重要影响因素的研究
3 蔗糖)生根，叶片长至 2 am 以上的小植株转至含
1／2 MS(MS+PPT 2 mg／L或 kan 150 mg／L，不含
有机成分，3 蔗糖)无激素培养基的塑料盒中继续
培养，再生植株长到 6～8 am高时移至土壤中，并用
透明塑料盖覆盖 1周加以保护。
1．5 gus基因瞬间表达
将轰击过 pARN6+pDB1和 pBAB3+pDB1质
粒的未成熟胚转至 MS 培养基 1～2 d后，放入 5一溴
一 4一氯一3．吲哚一f}_D一葡糖苷酸(x—gluc)溶液，37℃保温
过夜，在实体显微镜下观察蓝色斑点的分布与大小。
2 结果与分析
2．1 基因型对胚性愈伤组织再生植株分蘖、越冬的
影响
在进行基因枪轰击后，小麦幼胚能否长出胚性
愈伤组织是转基因小麦成苗的关键因素之一。为此，
我们对所选的8种不同基因型的冬小麦在轰击后进
行分析比较，结果发现 8种基因型的幼胚在基因枪
轰击后，愈伤组织诱导率几乎为 100 ，但它们的胚
性愈伤组织的数量和质量有显著差异。其中西农
1376、西农 88、黑小麦的愈伤组织生长最好，愈伤组
织体积大，色泽淡黄，上面布满珊瑚状突起，产生的
胚性愈伤组织数大约占愈伤组织总数的 10 。相比
之下甘麦的愈伤组织轰击后幼胚在培养过程中只能
长成直径为 0．5 am左右、结构致密、部分色泽暗淡
的愈伤组织，其胚性愈伤组织诱导频率也很低，经统
计 只有西 农 88的十 分之 一。宝丰 7228、盐 2、
80101T、西农 8727等的愈伤组织虽然也是体积大
约 1 am。左右，色泽淡黄，半透明，但产生的胚性愈
伤组织并不多，约占总愈伤组织数的 5 。
长出绿芽的愈伤组织培养成苗之后，可以明显
看出各个基因型分蘖情况的不同。按分蘖强弱排位：
西农 88>宝丰 7228>甘麦>盐 2>黑小麦>西农
8727>801O1T>西农 1376。其中西农 88的分蘖能
力最强，西农 1376几乎不分蘖。在实验中，我们发现
轰击过的绝大多数基因型的小麦再生苗可以安然越
冬，但黑小麦在经过基因枪轰击后越冬能力下降，在
所移栽的 8株黑小麦中，7株在冬季 2月份最冷的
时候死亡，仅存活 1株。综合结果表明，基因型是决
定小麦性状的重要影响因素，在幼胚经过基因枪轰
击后，西农 88是基因枪介导小麦遗传转化的优良受
体。
2．2 gus基因瞬间表达分析
在轰击后 1～2 d将未成熟胚放入 x—gluc溶液
中，隔天观察蓝色斑点的出现情况。发现蓝色斑点出
现的面积大小及多少与子弹的制备有直接的关系。
本实验室所用金粒 1 m，分别用新制备金粒与上
一 年制备金粒进行轰击，每组平行作 3次，发现用新
制备金粒时，即使在制备子弹时不进行超声波处理
而只充分涡旋振荡，轰击后幼胚盾片上出现的蓝色
斑点数目较多，范围较大，每个斑点的面积相对较
小。如果用隔年(上一年)分装好的金粒，即使在制备
子弹时再次进行超声波处理，在幼胚盾片上出现的
蓝色斑点数 目较少，范围较小，每个斑点的面积相对
较大(见表 2)；延长超声波处理时间后，蓝色斑点出
现的情况与新制备金粒的轰击效果相同。金粒携带
DNA轰击进入盾片，对小麦幼胚的伤害很大，如果
金粒沉淀结块，会在小麦幼胚盾片局部造成过大伤
害，导致幼胚死亡或不能诱导形成愈伤组织。所以，
在使用金粒制备子弹时应充分进行超声波处理，对
于隔年金粒的处理时间应该适当延长，保证金粒完
全散开，才能达到有效轰击。
表 2 不同时间制备的金粒对轰击效果的影响
Table 2 Influence of gold particles prepared in different
time on bombardment effect
2．3 幼胚的选择以及基因枪参数的分析
未成熟胚的发育阶段是体细胞胚发生和植株再
生最为关键的因素。根据徐子勤[15]的报道，在挑取
幼胚时只选用形态发育接近完成，盾片组织刚开始
积累淀粉的未成熟胚进行基因枪的轰击转化。这时
候幼胚的盾片发育适中，在基因枪轰击后不会由于
过于幼嫩所受伤害过大而死亡，也不会因盾片细胞
发育过老，在轰击时金粒难以进入细胞内部而造成
无效轰击。相应轰击材料不同，对基因枪的参数选择
也不同。本实验针对小麦幼胚所采用的爆裂压为
1300 psi和 1 1O0 psi，轰击后的小麦幼胚均能诱导
出愈伤组织，并且分化成苗。我们在实验中只对小麦
幼胚进行了一次轰击，在经 x—gluc染色后，瞬间表
达明显，平行随机选取 3组各 10个轰击过的幼胚，
有效轰击分别为 30 ，30 和 40 。实验证明对小
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ll4 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
麦幼胚进行 1次轰击既可达到效果。
2．4 质粒选择以及筛选剂浓度的分析
用pARN6+pDB1、pBAB3+pDB1和pYAO24
这3种组合的质粒对小麦幼胚轰击，结果发现再生植
株数目有 明显差异。用pARN6+pDB1及pBAB3+
pDB轰击后，在加入选择剂PPT 2 mg／L的情况下，
再生植株的数目很多，初步进行 PCR检测后发现，
大多数为假阳性，只有少数可扩增出相应条带，说明
2 mg／L PPT作为筛选剂浓度效果不佳。但是，用
pYAO24轰击后的小麦幼胚在经过kan 1 50 mg／L浓
度的连续选择下，所得的再生植株多为白化苗，只有
几株为正常绿苗，经PCR检测后，多为转基因植株，
只有极少数为假阳性。由此可以看出，150 mg／L的
卡那霉素浓度是有效的筛选浓度。有关转基因小麦
的试验和鉴定我们将另文报道。
3 讨论
小麦幼胚在经过基因枪轰击后，组织受到一定
损伤，再生能力会大大下降。随着基因型的不同，小
麦 自身的修复和抵御伤害的能力也有所不同。所以，
选择良好基因型的小麦幼胚作为轰击对象是进行基
因枪遗传转化的首要条件。只有具有优良基因型的
转基因小麦品种才具有广阔的研究价值和生产价
值。在我们实验所用的8种小麦基因型中，西农88的
表现最为突出。它的再生能力旺盛，分蘖能力强，越
冬能力优越，是一种十分优良的实验材料。我们的实
验证明，西农88是小麦遗传转化的理想受体基因型。
我们实验所采用的受体材料为开花受粉后 2周
的幼胚。目前，国内外大多数的文献报道证明幼胚是
一 种极好的体细胞胚发生材料。但是，也有学者采用
幼穗和幼胚愈伤组织等作为轰击材料[1 ，并获得
了转基因植株。
金粒制备质量的好坏直接关系到小麦幼呸在轰
击后的成活及转化率。我们在试验过程中发现，只对
子弹在使用前进行涡旋振荡的效果比既进行涡旋振
荡又进行超声波振荡的效果差很多；已分装好的隔
年金粒如不充分进行超声波处理，结果比新制子弹
差很多，经 GUS染色后，蓝色斑点数量少，斑点大
且只出现在局部，这样容易造成嵌合体的形成。与其
他研究者所做的 GUS染色相比，我们工作中 GUS
染色所得到的蓝色斑点面积整体偏大，这可能与渗
透剂为碳源(蔗糖)有关，如果用甘露醇来处理则会
产生小而清晰的蓝色斑点[1引。总体来说，渗透处理
可以增强瞬间表达效果和稳定转化频率。用蔗糖、甘
露醇、葡萄糖或麦芽糖处理后 ，GUS瞬间表达蓝色
斑点明显增加。Altpeter等[1g 和 Becker等[20 认为：
采用较低的金粒用量(30 g)获得抗性植株的频率
要明显高于高金粒用量(100 g)；较高的金粒用量
对细胞本身伤害也相应高一些，而较低的金粒用量
受轰击时的氦压、距离、真空度、金粒的凝聚程度、所
用培养系统、筛选方法、筛选剂及筛选剂浓度等多个
因子的影响。在这些因子确定的情况下，再确定金粒
用量。确切地说，轰击时的金粒用量应该在细胞所承
受损伤的范围之内，并且保证达到有效轰击。
在用选择剂进行筛选时，我们发现本实验所采
用的PPT浓度略低，为 2 mg／L，且从筛选到生根一
直为此浓度。由于选择压力过低，造成假阳性植株增
多，在筛选、鉴定上造成一定困难，耗费了人力物力。
目前大多数实验室在用 PPT、Bialaphos等除草剂的
有效成分进行筛选时，一般都是进行阶梯式选择。通
常是在小麦幼胚刚轰击过后用 1 mg／L这样较低的
筛选剂浓度进行筛选，以防止小麦幼胚在轰击过后
受损部分来不及恢复就在严酷的筛选环境下死亡；
生芽时将浓度提至 3 mg／L，这时绝大多数的愈伤组
织不能生芽；最后，在生根培养基中加入 5 mg／L的
筛选剂，有结果显示，此浓度的筛选剂对非转基因植
株的根生成有明显抑制作用。Bliffeld等[1。]用 PPT
作为筛选剂时，在筛选和生苗培养时的PPT含量为
1 mg／L，而在后来的生根培养时升至3 mg／L，加大
PPT的浓度，提高了阳性转基因小麦的比例。Zhang
等L2lj用 Bialaphos为筛选剂时，在轰击后于放置幼
胚 的培 养基 中 所加 的 Bialaphos浓 度 为 1．0～
3．0 mg／L或不加筛选剂直接进行培养，并在生芽生
根时将筛选剂的浓度提高到 5 mg／L。所以，在我们
今后的研究实验中，进行 PPT的筛选时，浓度应有
所增加，并设计合适的梯度 ，进行更为合理化的筛
选。我们实验所用的另一个质粒 pYAO24轰击时采
用的卡那霉素浓度比较理想。虽然 Nehra等[2 ]和
Bower等[2。]认为卡那霉素作为筛选剂并不适合小
麦转化控制。因为它会妨碍愈伤组织在早期阶段的
再生能力，并对叶绿素合成有抑制作用。但是，卡那
霉素 已被广泛应用于双子 叶植物转基 因植物研
究L2 ，说明卡那霉素的上述缺点是可以根据浓度、
受体基因型、培养条件所克服的。综合我们实验室的
To代轰击 pYAO24质粒的小麦表型与对照无异，
甚至在生长状况和结实率上优于对照组，所以，我们
认为 150 mg／L的硫酸卡那霉素浓度是较理想的筛
选剂浓度 。
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