全 文 :武汉植物学研究 2010, 28(6): 666~672
Journal of Wuhan Botanical Research
收稿日期: 2010-01-08, 修回日期: 2010-05-03。
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30571188); 国家 948项目(2006G18B); 国家科技支撑项目(2006BAD06B03)。
作者简介: 徐建堂(1978−), 男, 博士研究生, 福建莆田人, 主要从事麻类生化与分子生物学研究; 陈美霞(1983-), 女, 博士研究
生, 山西忻州人, 主要从事麻类生化与分子生物学研究。
∗并列第一作者。
∗∗通讯作者: 祁建民, 教授, 博导, 主要从事作物遗传育种与麻类种质资源研究(Author for correspondence. E-mail: qijm863@163.com)。
DOI: 10.3724/SP.J.1142.2010.60666
RAPD双引物在构建红麻连锁图谱中的应用研究
徐建堂∗, 陈美霞∗, 谢曾荣, 祁建民∗∗, 方平平, 陶爱芬, 林荔辉
(福建农林大学作物遗传育种与综合利用省部共建教育部重点实验室, 福州 350002)
摘 要: 以阿联红麻(Alian Kenaf)与福红 992(Fuhong992)杂交产生的 F2代作图群体为研究材料, 分别应用
RAPD 单引物和双引物进行多态性条带扩增, 并进行扩增效果的比较研究, 以期为作图群体构建红麻遗传连
锁图谱奠定基础。结果表明, RAPD双引物比单引物扩增出更多的多态性条带, 提高了引物的利用率和多态性
条带的扩增效率。
关键词: RAPD双引物; 红麻;遗传连锁图谱
中图分类号: Q75 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X(2010)06-0666-07
Applied Research on Construction of a Genetic Map of Kenaf
Using Two-primer RAPD Combinations
XU Jian-Tang∗, CHEN Mei-Xia∗, XIE Zeng-Rong, QI Jian-Min∗∗,
FANG Ping-Ping, TAO Ai-Fen, LIN Li-Hui
(Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops
(Fujian Agriculture and Forestry University), Fuzhou 350002, China)
Abstract: RAPD and two-primer RAPD combinations were used to screen and compare for
polymorphisms between Alain and Fuhong992, providing the foundation for constructing a
genetic map of kenaf. The results showed that RAPD was a potential tool for constructing a
genetic linkage map of kenaf. PCR reactions with two different primers tended to produce
different amplification products than the single primer, so using two different primers was a
convenient and economical way of improving polymorphism.
Key words: Two-primer RAPD combinations; Kenaf; Genetic linkage map
随机扩增多态性 DNA(random amplified
polymorphic DNA, RAPD)是 1990年由 Williams
和 Welsh分别领导的两个研究小组几乎同时发展
起来的一种检测基因组 DNA 多态性的遗传标记
技术 [1,2], 它通常用含 10 个碱基的随机引物, 对目
的基因组 DNA进行 PCR扩增, 能在多个位点上得
到扩增产物。造成 RAPD条带差异的原因可能是
核苷酸置换造成引物无法与结合位点匹配, 由于
结合位点的缺失和结合位点间大片段的插入造成
扩增中断, 插入或缺失突变使扩增产物大小发生
改变。与其他分子标记相比, RAPD标记有其自己
的优点: ①不依赖于生物种属特异性和基因组的
结构, 用于对任何未知基因组的研究,降低了分子
生物学研究的成本; ②它基于 PCR技术分析程序
简单 , 过程能自动化 , 且所需 DNA 量小 ,对模板
DNA 纯度要求低 ; ③具有高效性与灵敏性特点 ,
采用较低的退火温度, 既保证了短核苷酸引物与
模板结合的稳固性, 又允许一定程度的误配; ④研
究范围涉及研究对象的整个基因组。
目前该技术广泛应用于亲缘关系与种质资源
第 6期 徐建堂等: RAPD双引物在构建红麻连锁图谱中的应用研究 667
多样性分析[3−6]、DNA指纹和种子纯度的鉴定[7−11]、
分子标记连锁图谱的构建[12−14]、基因定位[15−17]、
分子标记辅助育种[18]等各个方面。但是在 RAPD
的运用过程中, 多态性引物筛选是成功的关键, 如
何提高 RAPD扩增结果的多态性是研究的重点。
引物多态性越高, 它在 DNA链上的“扫描”就越细。
双引物的运用,就是根据 RAPD的原理提出的, 相
对于单引物而言 , 双引物的运用增加了与模板
DNA 的结合位点, 这很可能改变了两结合位点间
的距离。这样新条带的产生或单引物扩增出的条
带的消失, 都源于位点的改变或距离的改变。
双引物 RAPD分析与单引物 RAPD分析相比
具备以下优点: ① 增加了多态性片段,可以提高分
子标记对植物基因组的标记, 更有利于重要性状
的标记、定位克隆以及分子标记辅助选择。② 增
加 RAPD 反应的次数, 有利于覆盖植物的整个基
因组。标准的 RAPD标记一般为 10个寡聚核苷酸,
引物由于受 G+C含量、回文结构、引物间自身退
火互补的影响, 因此 RAPD 反应的引物实际上是
有限的, 利用单引物 RAPD分析, 一个引物只能反
应一次 , 反应次数与引物数相等。利用双引物
RAPD分析, n个引物自由组合成 n(n−1)/2对引物,
增加了 n(n−1)/2倍反应次数, 提高了引物利用率,
降低了实验的成本。
我们就在红麻作物上应用 RAPD单引物和双
引物来扩增多态性条带的效果进行了探讨, 以期
为红麻遗传连锁图谱构建的应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以来自埃及的栽培种阿联红麻(Alian Kenaf)和
本实验室育成的红麻新品种福红992(Fuhong992)
为杂交亲本, F1套袋自交, 获得 162株 F2代构图群
体, 随机选取作图群体的 20个单株作为本研究实
验材料。
1.2 基因组 DNA的提取
采用经本研究室改进后的 CTAB法[19]提取高
质量 DNA, −20°C保存。
1.3 RAPD反应程序
所用 RAPD引物序列见表 1, 购自上海生物工
程有限公司。20 μL反应体系为:80 ng模板 DNA,
0.6 μmol引物, 200 μmol dNTPs, 1.5 μmol MgCl2,
1×PCR buffer和 0.7 U Taq DNA聚合酶(Takara)。
RAPD 双引物组合的体系只是每个引物量为
0.3 μmol, 2 个单引物等量混用, 其他的都与标准
10 bp的 RAPD-PCR反应体系一致。反应程序为:
94°C预变性 3 min, 43个循环包括94°C变性1 min,
36°C退火 1 min, 72°C延伸 2 min, 最后 72°C保
温 5 min以确保引物延伸彻底完成。扩增产物用
6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 电泳缓冲液为 1×
TBE。预电泳 0.5 h后上样, 电压 320 V, 时间 2.5 h,
电泳后银染, 参照吴冠芸等[20]的方法。
表 1 RAPD引物序列
Table 1 The sequence of RAPD primers
引物名称
Primer
code
引物序列(5′~3′)
Sequence of
primer (5′ To 3′)
引物名称
Primer
code
引物序列(5′~3′)
Sequence of
primer (5′ To 3′)
OPA6 GGTCCCTGAC OPA12 TCGGCGATAG
OPB2 TGATCCCTGG OPB7 GGTGACGCAG
OPB14 TCCGCTCTGG OPC7 GTCCCGACGA
OPE11 GAGTCTCAGG OPE15 ACGCACAACC
OPE20 AACGGTGACC
2 结果
2.1 带型分析
本实验所扩增的条带大致可以分为以下几个
类型。
第一类是单独使用时都出现, 在混合使用中,
一个引物的多态性条带仍有所保留而另外一个引
物的多态性条带消失(见图 1:A、B、C)。跟单引
物相比, 在双引物A6B2中, 引物B2的特异性条带
仍保留一条而且位置不变, 只是群体的特异性条
带稍有不同, 但引物 A6的特异性条带消失, 可能
是在加入双引物后, 新出现的结合位点比原来的
位点结合力更强或结合位点(拷贝数)更多, 从而
使原来单引物可以单独扩增的引发位点扩增量变
小所致。
第二类是引物单独使用时出现, 而在引物混
用中消失的条带(见图 1:A、图 2、图 3), 单独的
B2或者 E20扩增的多态性条带虽然只有一条, 却
清晰可见十分明显, 但是它们混合的双引物B2E20
则无法扩增出特异性条带。这种条带很可能是异
668 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷
1是 100 bp marker; 2和 3是亲本阿联红麻 A; 4和 5是亲本福红 992;
6~23是 F2后代的群体, 箭头所示为多态性条带
1-M, 100 bp ladder; 2 and 3-Alian Kenaf A; 4 and 5-Fuhong992;
Others were some F2 individuals, arrow show polymorphic bands
图 2 引物 E20的部分 F2群体扩增图
Fig. 2 The amplification result of E20 primer
in some F2 individuals
质带, 即分子量相同或相近, 但序列有可能不同。
双引物存在时, 在相互竞争的情况下, 反而扩增不
出来 ,而且双引物扩增的整体条带与单引物的带
型也有很大差异。
第三类是引物在单独使用时没有出现, 引物
混用时出现的条带(见图 4), 单引物 A12、B7没有
多态性条带, 它们等量混用形成双引物 A12B7时
出现了明显的特异性条带, 这类条带可能是新出现
的引物结合引发位点扩增片段的两端引物不同。
2.2 实验结果与理论推测
在 RAPD 反应时存在明显的竞争关系, 在竞
争的过程中有的条带受到抑制, 有的得到加强, 因
此没有出现单引物 4倍的扩增条带。显然可以推
1和 2是亲本阿联红麻 A; 3和 4是亲本福红 992; 5~22是 F2后代的
群体; 23是 100 bp marker
1 and 2-Alian Kenaf A; 3 and 4-Fuhong992; 5-22 were some F2
individuals; 23-M,100 bp ladder
图 3 引物 B2E20的部分 F2群体扩增图
Fig. 3 The amplification result of B2E20 primer in
some F2 individuals
1是 100 bp marker; 2和 3是亲本阿联红麻 A; 4和 5是亲本福
红 992; 6~23是 F2后代, 箭头所示为多态性条带
1-M,100 bp ladder; 2 and 3-Alian Kenaf A; 4 and
5-Fuhong992; Others were some F2 individuals, arrows show
polymorphic bands
图 1 引物 B2(A)、A6(B)、A6B2(C)
的部分 F2群体扩增图
Fig. 1 The amplification results of B2(A), A6(B),
A6B2(C)primer in some F2 individuals
第 6期 徐建堂等: RAPD双引物在构建红麻连锁图谱中的应用研究 669
1和 2是亲本阿联红麻 A; 3和 4是亲本福红 992; 5是 100 bp marker; 6~24是 F2后代的群体, 箭头所示为多态性条带
1 and 2-Alian Kenaf A; 3 and 4-Fuhong992; 5-M,100 bp ladder; Others were some F2 individuals,arrow show polymorphic bands
图 5 引物 E11A6(A)、E15B2(B)的部分 F2群体扩增图
Fig. 5 The amplification results of E11A6(A),E15B2(B) primer in some F2 individuals
测 RAPD 反应最初的扩增可能发生于多位点, 只
有其中的一部分位点扩增得到了明显可见的条带,
所以 RAPD扩增的条带在一定程度上取决于对模
板 DNA中引发位点的竞争。虽然没有出现 4倍的
扩增条带, 但本研究中双引物在 F2代群体中却能
扩增出很多明显清晰的特异性条带(图5 ~ 图7), 大
大提高了多态性特异条带扩增的效率。
3 讨论
传统的 RAPD 应用研究中, 大多利用单引物
进行扩增, 其引物需要数量大, 在构建高密度的遗
传连锁图谱时, 往往不能满足实验的需要。利用两
个引物自由组合成 RAPD双引物是有效的解决方
案。理论上讲, 如果每个引物平均可以扩增出 x条
带, 双引物就可扩增出 4x 条, 其中一半的片段两
1是 100 bp marker; 2和 3是亲本阿联红麻 A; 4和 5是亲本
福红 992; 6~23是 F2后代的群体, 箭头所示为多态性条带
1-M,100 bp ladder; 2 and 3-Alian Kenaf A; 4 and 5-Fuhong992;
Others were some F2 individuals,arrow show polymorphic band
图 4 引物 A12(A)、B7(B)、A12B7(C)
的部分 F2群体扩增图
Fig. 4 The amplification results of A12(A), B7(B),
A12B7(C) primer in some F2 individuals
670 武 汉 植 物 学 研 究 第 28卷
1是亲本阿联红麻 A; 2是亲本福红 992; 3是 100 bp marker; 4~24
是 F2后代的群体, 箭头所示为多态性条带
1-Alian Kenaf A; 2-Fuhong992; 3-M,100 bp ladder; Others were
some F2 individuals, arrows show polymorphic band
图 6 引物 E15C7的部分 F2群体扩增图
Fig. 6 The amplification result of E15C7 primer
in some F2 individuals
1和 2是亲本阿联红麻 A; 3和 4是亲本福红 992; 5是 100 bp marker;
6~24是 F2后代的群体,箭头所示为多态性条带
1 and 2-Alian Kenaf A; 3 and 4-Fuhong992; 5-M,100 bp ladder;
Others were some F2 individuals, arrows show polymorphic bands
图 7 引物 E15B14的部分 F2群体扩增图
Fig. 7 The amplification result of E15B14 primer in
some F2 individuals
端有相同的引物, 另一半片段两端的引物不同。
Welsh等[21]最先利用双引物进行了实验; Säull等[22]
研究认为 3个以上的引物混合没有意义, 2个引物
混合扩增的条带是单引物扩增条带数的 1.4倍;He
等 [23]也利用了双引物, 但对引物混合的结果没有
进行分析。国内外学者在马铃薯体细胞融合杂种[24]、
甘蓝型油菜 [25]、桑树 [26]、番茄 [27]、龙眼 [28]、小
麦[29]等的研究上均表明双引物反应能够比单引物
反应扩增出更多的多态性片段, 分子杂交结果也
表明, 双引物扩增出新的 DNA片段与单引物扩增
片段没有同源性, 双引物扩增出新的 DNA片段与
单引物扩增的片段是存在于基因组的不同位点。
因此, 双引物扩增出新的多态性片段可以作为独
立的分子标记。RAPD 双引物也已经应用到动物
的研究中, 如对家兔图谱 [30]的研究结果显示双引
物的运用较单引物能扩增出更多具有多态性的条
带。这与 Rothuizen[31]的报道相似, 双引物的运用
能有效地扩增出单引物不能扩增出的条带。
对一些重要性状基因进行定位, 通过构建高
密度的遗传连锁图谱, 有效快速地定位目的基因,
最后可以分离克隆该基因。高密度的图谱可为植
物生长、抗性、产量、品质等提供准确和可靠的
生物学信息, 育种学家已对幼苗期、成熟期及某些
表型和生理生化指标进行了大量研究, 取得了一
定的成果, 但是早期测定的难关并未攻破。利用分
子标记构建的遗传连锁图谱使选择直接基于DNA
分子水平, 大大提高了选择的可靠性, 加速了育种
进程 , 提高了分子标记辅助育种(MAS)的选择效
果。而笔者在构建红麻遗传连锁图谱的研究中, 不
仅 RAPD反应以及 SRAP、ISSR扩增的多态性条
带均很少, 一般没有或者仅为一条, 其主要原因是:
① 所采用的两个亲本的 DNA 遗传差异较小 ;
② 这些非特异性的显性分子标记技术的信息含
量较低, 因而利用两个 RAPD 单引物自由组合成
双引物是弥补引物不足和降低实验成本的可行方
法。本试验结果也表明, 双引物的扩增结果并不是
由两个单引物分别扩增带的叠加, 单引物能扩增
出的条带在双引物扩增中可以继续得到扩增, 也
可能得不到扩增而消失, 双引物也能有效地扩增
出单引物不能扩增出的条带, 这表明在双引物扩
增中存在单引物和双引物扩增互作的情况。双引
物扩增出的新的片段显然是由两种引物共同作用
的, 与单引物扩增的片段间不存在同源性, 条带清
晰, 多态性明显, 尤其是一些原来没有多态性的引
物两两组合时, 还能扩增更多的多态性条带。n个
单引物自由组合就可以组成 n(n-1)/2 个双引物,
这完全可以解决构建红麻遗传连锁图谱时所需多
态性引物的需要。在初步构建的红麻遗传连锁图
谱全长 4644.1 cM, 平均间距为 15.6 cM, 包括 298
个位点, 其中有 105个 SRAP位点,38个 ISSR位
点, 38个 RAPD位点和 215个 RAPD双引物位点,
位点之间分布均匀并未出现大量聚集的现象, 表
第 6期 徐建堂等: RAPD双引物在构建红麻连锁图谱中的应用研究 671
明 RAPD双引物可以成功地应用在构建红麻遗传
连锁图谱上, 而且本研究室在构建烟草遗传连锁
图谱[32]方面的研究也说明 RAPD双引物能够扩增
出更多的多态性位点。因此我们认为双引物的运
用将是 RAPD 的一个重要发展方向, 值得进一步
研究。
目前 RAPD标记在育种上的应用还有一定的
局限性, 主要包括以下几个方面: ① 开发的 RAPD
标记数量较少, 很难找到与目标基因紧密连锁的
RAPD 标记; ② RAPD 标记技术本身的局限性造
成检测结果的偏差; ③ 众多的农艺性状是受多基
因控制的, 而 RAPD 标记对数量基因的精确定位
还有较大差距; ④ RAPD 标记与表型之间的关系
有待于进一步研究。现在许多科学工作者将 RAPD
技术与其他分子标记相结合[33−36], 弥补了各种分子
标记技术的不足, 为 RAPD 标记在植物育种领域
的广泛应用开辟了一条新的途径 , 而且将 RAPD
标记转化成其他稳定性高重复性强具有共显性特
征的其他分子标记如 SCAR 标记 [37], 可以有效地
解决以上的问题。随着分子生物学理论与技术的
发展,我们相信 RAPD标记必将逐渐弥补其局限性,
在植物育种方面得到更加广泛的应用。双引物的
运用, 是提高多态性的非常经济有效的手段。
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(责任编辑:王豫鄂)