全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(4)：289～293
Journal of Wuhan Botanical Research
甘草亲缘关系的 RAPD鉴定
王鸣刚r，葛运生 ，陈 亮 ，杨必键 ，王小如。
(1．厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，厦门 361005f
2．厦门大学现代分析科学教育部重点实验室，厦门 361005)
摘 要：以不同地区的3种15组甘草(Glycyrrhiza uralensis、G．infleta、G．glebra)种子为材料，探讨RAPD分子标
记在研究、鉴定甘草亲缘关系中的可行性。从 5O个随机引物中筛选 出 9个有效引物，9个引物共扩增 出 961条
DNA带，其中多态性条带 811条，占总扩增条带的84．4％。对扩增出来的961条DNA带进行分析，结果表明：15
组甘草植物的平均遗传距离为0．41，其中采自甘肃民勤野生甘草与采自新疆布尔津乌拉尔野生甘草遗传距离最
小，为0．26；而采自内蒙古杭锦旗上海升袖的野生甘草与采自青海贵德的乌拉尔野生甘草遗传距离最大，为0．63。
由RAPD聚类分析结果得出15组甘草植物之间的亲缘关系与形态学分类结果存在差异。
关键词：甘草；RAPD；遗传多样性
中图分类号：Q943；R282．5 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)04—0289—05
Relationship Analysis of Glycyrrhiza by RAPD
WANG Ming—Gang 。，GE Yun—Sheng ，CHEN Liang ，YANG Bi—Jian ，WANG Xiao—Ru。
(1．The Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Bidogy and Tumor Cell Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，
Chinal 2．The Key La boratory of Ministry of Education for Analytical Science，Xiamen University。Xiamen 361005．China)
Abstract：The phylogenetic relationships of three species of Glycyrrhiza(G．uralensis，G．infleta，
G．glebra)were analyzed by RAPD．Nine random primers of high stable quality were screened
from 50 primers．The cluster analysis results of 961 amplified DNA fragments were indicated as
follows：the average genetic distance among the fiftee n groups of Glycyrrhiza was 0．41，of which
the max genetic distance was 0．63 while the min 0．26．The results show that there is some differ—
ence between RAPD cluster analysis and the original species．
Key words：Glycyrrhiza；RAPD；Genetic diversity
甘草属于豆科(Leguminosae)甘草属 (GZy—
cyrrhiza L．)多年生草本植物。甘草的干燥根及根茎
性味甘平，为补气类药，具有补益中气、清热解毒、润
肺止咳、缓急止痛、缓和药性之功。临床应用有生、炙
不同，或为主药或为使药，量可大也可小，作用大，应
用广，其药用历史悠久，是最常用的中草药品种之
一
，曾有“十方九草”之称。甘草的研究和应用引起了
国内外学者的广泛重视[1 ]。
甘草的主要产地在中亚、北美及东欧，尤以中亚
及地中海沿岸为分布中心。我国有甘草属植物 17～
18种、3变种。集中分布于三北地区(东北、华北和西
北各省区)，而以新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为中心产
区，因其正处于分化之中，各类群内部的形态变异较
大，给分类学带来了相当大的困难[4 ]。
随 机 扩 增 DNA 多 态 性 (random amplified
polymorphic DNA，RAPD)技 术 是 Wiliams和
收稿 日期：2003—10—24，修回日期 ：2004—05—04。
基金项目：厦门大学现代分析科学教育部重点实验室开放基金(zoo31o7)；厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室开放
基金(2004103)。
作者简介；王鸣刚(1962一)，男，博士，研究方向为植物细胞分子生物学。
通讯作者。
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290 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
Welsh等[s．7 于 1990年在 PCR基础上同时发展起
来的一种新型遗传标记技术。其技术简便易行，可用
于不同物种基因组的分析。在研究生物多样性、物种
进化关系、遗传图谱作图、目的基因定位等方面发挥
了巨大的作用。
RAPD分子标记技术由于其检测涉及整个基
因组，位点多，不受材料和环境条件的影响而被广泛
应用于作物遗传育种的各个方面。大豆[8]、甘蓝[9]、
水稻 川、大麦 u 等作物的研究表明品种间普遍存在
RAPD差异，可以用来鉴别品种，据此得到的遗传
距离可以较好地对品种进行聚类分析。
本实验采用 RAPD分子标记技术对来 自不同
地区的 15组甘草植物的基因组 DNA进行研究，分
析 15组甘草的亲缘关系，为甘草分类提供 DNA分
子水平的参考，为进一步开展甘草分子生物学研究
奠定基础。
l 材料与方法
1．1 材料
以采集于不同地区的15组甘草为实验材料(表
1)。
表 1 采集于不同地区的 l5组甘草
Table 1 1 5 groups of Glycyrrhiza from different area
1．2 方法
1．2．1 植物基因组 DNA的提取 取上述 15组甘
草种子进行播种，当小苗长出 3～4片叶时，剪取
10~20 mg嫩叶，用改进的 CTAB方法提取植物总
DNAc 引
。
1．2．2 PCR反应程序及扩增产物的琼脂糖凝胶电
泳 94℃预变性 4 min，然后 94℃变性 1 min，45℃
复性 1 min，72℃延伸 2 min，共 40个循环，最后
72℃延伸 10 min。吸取产物 10 L加入预先制好的
1 浓度的琼脂糖凝胶点样孔中，进行电泳。
1．2．3 PCR扩增产物电泳检测 电泳结束后，在
紫外检测仪上观察、统计 PCR扩增产物的电泳带 ，
在凝胶成像系统中照相，保存图像。
1．2．4 扩增片断遗传距离指数及数据分析 对扩
增产物进行统计 ，将电泳结果按条带的有或无量化
成 1和 0，有带赋值为 1，无带赋值为 0。根据 Nei等
的公式[1副：F一2NXY／(NX+Ny)获得各样品间的
遗传相似度，其 中 NXY为 2个样品共 同享有的
RAPD标记数，NX，NY分别为 X和 y样品各 自拥
有的 RAPD标记数，再经 D一1一F公式计算相应
的遗传距离，得到的数据输入计算机，用 STATIS—
TICA软件进行聚类分析，构建甘草聚类关系图。
2 结果与分析
2．1 多态性引物扩增结果
以3种 15组甘草植物基因组DNA为材料，从
50个 10碱基的随机引物中筛选出 9个具有丰富多
态性的引物。对 9个引物的扩增结果进行统计，结果
见表 2。
表 2 9个有效引物对 15组甘草的 PCR扩增结果
Table 2 Amplification results of 9 effect primers
on 1 5 group of Glycyrrhiza
电泳结果(图 1，部分引物 RAPD结果)表明，9
个引物共扩增出 961条带，其中 81l条带表现出多
态性，多态性带占总扩增条带的 84．4 。平均每个
引物在 15组甘草植物中扩增出 107条多态性 DNA
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第 4期 王鸡刚等：甘草亲缘关系的 RAPD鉴定
M A B C D E F G H I j K L M N O M A B C D E F G H 【 J K L M N L
PriFilCr S
M A B C D E F G H l
Prim S8
I K L M N O M A B C D E F G H l J K L M N O
Primer$22
图 1 4种随虮引物的 RAPD扩增图谱
Fig l Fingerprints of RAPD products lrom 4 primers(M -Marker 2 000 bp—I 500 bp·l 000 bp-750 bp·500 bp，0900 bp)
带+说日甘不同甘草组间具有较高的遗传变异。扩增条
带数最多的是 $30．为 136条；扩增条带晟少的为
$81，为 63条。可见引物不同扩增产物则有明显的差
异
2．2 遗传距离的计算结果
15个样品之间的遗传距离结果见表3。从9个引
物扩增得到的结果．根据Nei等的公式计算出l5组甘
草间的遗传距离．其中A与c的遗传距离最大，为
0．63；H与I间的遗传距离最小，为0．26；15组甘草的
平均遗传距离为0．41，说明1 5组甘草在分子水平上
是属于同 个属
2．3 15组甘草的RAPD标记聚类分析结果
用 sTATIsTIcA软件对 15组甘草的亲缘关
系进行了聚类分析，结果见围2
根据各试验材料之间的遗传距离，以 j．8(Eu—
clidean distances)为临界值，可将 1 5组甘草大概划
分成以下几类 ：
A(乌拉尔野生甘草，内蒙古杭锦旗上海升袖)、
E(乌拉尔野生甘草，吉林大安)、H(乌拉尔野生甘
草，甘市民勒)、I(乌拉尔野生甘草．新疆布尔津)、N
(乌拉尔野生甘草，额济纳旗)、M(乌拉尔野生甘草
种子．宁夏盐艘)、K(胀果野生甘草．新疆相田)、
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292 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
表 3 15组甘草植物的遗传距离
Table 3 The genetic distance of 1 5 groups of Glycyrrhiza
O．39
O．63 O．51
O．45 O．46 O．5O
O．46 O．44 0．46 O．37
O．32 0．33 O．57 O．3O O．43
O．51 O．48 O．51 O．33 O．44 O．37
O．47 O．44 O．42 O．32 O．33 O．29 O．38
O．45 0．35 O．44 O．34 O．36 O．34 O．38 O．26
O．44 O．37 O．48 0．42 O．44 O．38 O．43 O．43 O．37
O．38 O．46 O．57 O．47 O．48 O．44 O．53 O．48 0．44 O．42
O．44 O．44 0．53 O．35 O．45 O．43 O．47 O．35 O．37 O．39 O．42
O．42 O．42 0．46 O．29 0．46 O．34 O．43 O．28 O．33 O．32 O．42 O．27
O．45 O．45 O．49 O．34 O．43 0．46 0．48 O．42 O．36 0．40 O．5O O．33 O．32
O．54 O．35 0．46 O．35 O．38 O．36 O．44 O．33 O．37 O．37 0．48 O．37 O．39 O．47
Tree diagram for 1 5 groups of Glycyrrhiza single linkage Euclidean distances
卜●]
： ： ： l
I
： 卜一 -_J
： ： 卜—一
图 2 15组甘草植物的分子聚类图
Fig．2 DNA molecular dendrogram of 1 5 groups of Glycyrrhiza
F(胀果野生甘草，新疆巴楚)、G(胀果野生甘草，新
疆阿克苏)、L(胀果野生甘草，新疆哈密)，由于遗传
距离较近，可划分为一组。其中原形态标记分类分为
两个不同种的 A与 K却有着较近的遗传距离，为
5．5；而与原定为同种的B、c之间的遗传距离较远，
为 6．5；L与 N之间的遗传距离最近，为 5．3。
剩下的 D(乌拉尔野生甘草，敖汉旗赤峰)、J(光
果野生甘草，新疆巩留)、O(胀果野生甘草，甘肃金
塔)、B(乌拉尔野生甘草，内蒙古杭锦旗巴音乌素)、
C(-q拉尔野生甘草，青海贵德)，由于它们之间及与
前一组之间的遗传距离都较远(6．o～6．5之间)，可
各自划分为一组，因此，可认为是由于遗传变异而分
化出来的类型。
在原形态标记分类中，认为A、B、c、D、E、H、I、
M、N同属于乌拉尔甘草，F、G、K、L、O同属于胀果
甘草，J则单独归类为光果甘草。但在 l5组甘草的
A K F G L N ● H M E D J O B C
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第 4期 王鸣刚等：甘草亲缘关系的 RAPD鉴定
RAPD聚类分析中，A与原归为同一种的B、C等之
间却有较远的遗传距离，而原归为两个不同种的N、
L之 间的遗传距离却 比较近。这表明，本实验用
RAPD标记的分类结果与形态标记分类结果之间
存在一定的差异。
3 讨论
3．1 分子标记法与传统分类方法本身存在一定的
差异
通过对形态标记和 RAPD分子标记所构建的
聚类图进行分析比较，可以发现两者有许多共同之
处。但也发现，有些形态标记将其聚为同一类群的样
品组，而RAPD标记却显示它们之间的遗传距离较
远；同样，也有形态差异大、不同地理来源类型的样
品在 RAPD标记中却聚为一类。这与以往对这些样
品的印象有一定的差距，这说明样品间遗传差异与
形态、地理来源差异没有必然的联系[1 。
3．2 来自不同产地的同种甘草也存在差异及取样
差异
研究表明品种间亲缘关系的远近与地理分布有
一 定的相关性，但也有一些与地理分布不相符的情
况。另外，由于样品数量的关系，本实验中某些样品
的DNA是来 自于单株的，这与它所代表的群体可
能存在一定的偏差[1引。
3．3 实验中筛得的 9个 RAPD引物的扩增片断可
能未覆盖样品基因组全长
为得出更为可信的实验结果，可进行进一步的
实验，筛得更多可靠的引物，也可结合其他方法进行
进一步的验证。
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