全 文 ：17 卷 4 期
2001 年 7月
生　物　工　程　学　报
Chinese Journal of Biotechnology
Vol.17 No.4
July　2001
　
收稿日期:2000-10-17 ,修回日期:2001-04-09。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(29976032)。
＊通讯作者。 Tel:86-22-27401149;Fax:86-22-27403888;E-mail:yjyuan@public.tpt.tj.cn
真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响
张长平1 　李春1 　元英进1＊　孙安慈2 　胡昌序2
1(天津大学化工学院生化工程系　天津　300072)　　2(中国科学院植物研究所　北京　100093)
摘　要　在南方红豆杉细胞悬浮培养过程中 ,研究了在指数生长期的末期加入真菌诱导子(尖孢镰刀菌的胞壁组
分粗提物)对细胞态势及紫杉醇合成的影响。结果表明 , 真菌诱导子能在短期内激发细胞的防御性应答反应而产
生氧迸发 , 细胞的氧化还原态势发生了明显的变化 , 培养基发生碱化现象 , 表征酶含量的蛋白质含量明显提高 ,
SOD、POD、CAT 的活力出现波动性变化 ,并具有一定的时序性。同时 ,南方红豆杉悬浮培养体系中产次生代谢途径
中重要的酶 PAL的活力得到提高 ,紫杉醇的合成被加强 ,产量得到了显著提高 , 达到了对照组的 5倍左右。
关键词　真菌诱导子 , 紫杉醇 , 悬浮培养 , 氧迸发 , SOD , POD , CAT
中图分类号　Q813　文献标识码　A　　文章编号 1000-3061(2001)04-0436-05
　　紫杉醇是一种新型的抗癌药 ,它是一种从红豆
杉科红豆杉属植物的树皮及针叶等组织中提取出来
的次生代谢产物 ,然而其天然资源极其有限 。有关
紫杉醇生产的研究 ,已有不少文献报道[ 1 , 2] ,在众多
的生产方法中 ,细胞培养生产紫杉醇是解决这个供
需矛盾的最佳途径 ,是最具有前途的一种生产方
式[ 3] 。近年来 ,利用植物细胞生产次生代谢产物已
成为普遍关注的新方法 ,而在培养体系中加入诱导
子来提高特定产物的产量 ,又成为研究热点[ 4] 。
真菌诱导子在与植物的相互作用中 ,能快速 、高
度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达[ 5] ,从
而提高特定产物的积累。本文采用的诱导子为尖孢
镰刀菌(Fusarium oxysporum ,简记为 Fo ,)胞壁成分的
粗提物(在本文图表中以MF 代表)。Fo是作者在众
多真菌中筛选出来的诱导效果较好的一种。本文主
要研究了真菌诱导子 Fo 对悬浮培养南方红豆杉细
胞生理状态的改变及对紫杉醇合成的影响。为提高
植物细胞生产紫杉醇的产量提供了一种新奇而有效
的方法。
1　材料与方法
1.1　细胞株系及其培养
南方红豆杉(Taxus chinesis var.mairei)悬浮培养
Y-901细胞系 ,25℃,110r min ,黑暗振荡培养 ,采用改
良的 B5 [ 2] 液体培养基 ,继代培养 5代以上 ,作为细
胞种子 , 分别接于装有 50mL 新鲜 B5 培养基的
250mL 三角瓶中 。
1.2　真菌的培养
尖孢镰刀菌采用液体马铃薯-葡萄糖培养基 ,
25℃,100 ～ 110r min 普通摇床振荡培养 ,待菌丝体
生长 8d后收获 。
1.3　诱导子的制备及其含量的标定
收获的菌丝体经甲醇:氯仿(1∶1V V)溶液 、磷
酸盐缓冲液洗涤 ,再经匀浆 、抽滤 、高温灭菌后即为
诱导子粗提物 ,其浓度标定采用糖及蛋白质两种成
分共同度量 , 采用蒽酮比色法测定糖含量 , 为
973.64μg mL;采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的
含量 ,为 781.4μg mL。
1.4　实验设计
诱导组中 ,诱导了的添加量以糖来计量 ,经优化
实验确定剂量标准为 60μg mL ,在培养的指数生长
末期的第 18天加入 ,取样时刻为加入诱导子后的第
0.5 、1 、2 、4 、8 、12 、24 、36h 。每组实验设 3个平行组。
对照组中 ,加入与诱导组中添加的诱导子溶液等体
积的灭菌蒸馏水。
1.5　细胞生理态势检测指标及其表征
取胞外培养液的离心上清液(4℃)为胞外待测
液;取 1g 冷冻的细胞 , 加入 0.01gPVP , 2mL 由
DOI :10.13345/j.c jb.2001.04.019
0.1mol L磷酸盐缓冲液配制而成的含有 0.2mol L
EDTA ,DTT0.4mmol L的细胞提取液 ,低温(4℃)离心
后取上清液为胞内待测液 。
1.5.1　培养液 pH 的测定:采用 PHS-2 型精密酸度
计(上海雷磁仪表厂)测定 。
1.5.2　细胞内总活性氧相对含量的测定:细胞经冷
冻干燥后 ,取一定量细胞干粉用 ESR-SPECTROME-
TER检测其顺磁共振图谱 , 以 MnO2 为标准校准磁
场。测定条件为:微波功率 , 1mW;扫场时间 8min
360mm;调制幅度 2G;响应时间 0.01s;调制频率
100KHz。以每毫克干细胞引起的 ERP 信号强度的
绝对值表示细胞内总活性氧的相对含量 。
1.5.3　蛋白质含量的测定:采用考马斯亮蓝染色
法 ,取 1mL 待测液加入 3mL 考马斯亮蓝染色液 ,以
蒸馏水为对照 , 600nm下测量其吸光度。
1.5.4　胞外过氧化物酶(POD)酶活分析:在 50mL ,
100mmol L的磷酸盐缓冲液中加入 28μL 愈创木酚 ,
溶解冷却后加入 19μL 30%的 H2O2 做为 POD 反应
液。取 0.5mL 待测液与 2mL POD 反应液和 1mL ,
0.2mol L的磷酸二氢钾反应 ,于 470nm 处每隔 1min
测其吸光度 ,以 ΔA470 Δt表示酶活大小[ 6] 。
1.5.5　胞内过氧化氢酶(CAT)酶活分析:50μL 待测
液中加入 3mL ,0.6%的过氧化氢后 ,于 240nm 处测
15s 、30s时的吸光度 ,以 ΔA240 Δt表示酶活大小[ 7] 。
1.5.6　超氧化物岐化酶(SOD)酶活分析:取 0.25mL
胞内待测液 ,加入 1mL , 0.05mol L ,pH=7.8的磷酸
盐缓冲液 、1mL 2.45mmol L NBT 后 ,于 400Lux 荧光
灯下照射 20min ,在 560nm 处测量其吸光度 ,以 ΔA
Δt=0.1 20min为一个酶活单位。
1.6　苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的测定
取 1mL 胞内待测液 , 加入 2mL 0.01mol L 的
H2BO4 缓冲液 ,1mL 0.02mol L 的苯丙氨酸和 1mL蒸
馏水 , 混匀后于 30℃恒温水浴中反应 60min , 在
290nm处测量吸光度 ,以 0.01mL 蒸馏水为对照 。以
ΔA Δt=0.1 60min为一个酶活单位。
1.7　胞内 、外紫杉醇的提取及测定[ 8]
将培养液在 6000r min 条件下离心 20min ,细胞
作为提取胞内紫杉醇的材料 ,离心后的上清液用于
胞外紫杉醇的提取 。即取 8mL 上清液 , 加入 10mL
二氯甲烷 ,然后静置 8h ,收集二氯甲烷相 ,上相再重
复提取共 3次 ,之后合并二氯甲烷相 ,于室温下风
干。用于高效液相色谱法(HPLC)分析。
将离心后所得的细胞 ,用液氮迅速冷冻 ,再进行
冷冻干燥 ,所得的细胞干粉用于胞内紫杉醇的提取。
称取 100mg干细胞 ,在研钵中研成粉末状 ,加入 5mL
环己烷 ,研磨后加入 20mL环己烷 ,将混合液倒入离
心管中静置 0.5h , 弃去环己烷相 , 向沉淀中加入
10mL甲醇和 10mL 二氯甲烷 ,超声振荡萃取 30min ,
然后加入 20mL蒸馏水充分混匀并静置 10h ,收集二
氯甲烷相 ,对上相再重复提取 2次 ,合并二氯甲烷
相 ,于室温下风干 。用于 HPLC分析 。
紫杉醇的测定采用 HPLC ,将所得的样品用 1mL
色谱甲醇溶解 ,在 C-18反相硅胶柱(Kromalil C185μm
250×4.6nm)上进行恒速洗脱。流速控制在 1mL
min ,流动相为色谱甲醇:水(65∶35)的溶液 。检测波
长为 227nm ,总洗脱时间为 40min。
2　结果与讨论
2.1　真菌诱导子对胞内 、外蛋白质的影响
真菌诱导子能引起细胞的代谢变化 ,它不仅使
细胞积极合成了植物防卫的次生代谢物质 ,如植保
素 、木质素等 ,同时也启动或加强了特定的次生代谢
途径 ,而这些过程的发生主要是通过酶类的调控来
实现的。蛋白质的含量变化正反应了这些酶类的量
变过程。本文在加入诱导子 Fo 后 ,蛋白质的量发生
了明显的变化 。如图 1所示 ,诱导组胞内蛋白的含
量出现了先高于后低于对照组的现象 ,这很可能是
细胞膜通透性改变及蛋白质合成速率发生变化共同
作用的结果。而胞外蛋白 ,如图 2所示 ,其含量诱导
组始终高于对照组 ,诱导初期 ,细胞生长速率相对还
仍然较大 ,因此胞外蛋白质含量呈下降趋势。而诱
导子的加入一般都会导致细胞生长的停止甚至死
亡 ,因此在加入诱导子后 8h左右胞外蛋白含量达到
低峰 ,当细胞逐渐进入平稳期时 ,与各种次生代谢相
关酶相继合成 ,使胞外蛋白含量平稳上升。诱导末
期 ,由于诱导作用使细胞的死亡率增大造成胞内蛋
白的外泄 ,使这种趋势加剧。
图 1　胞内蛋白质含量的变化
Fig.1　Changes of intracellular protein content induced by Fo
4374 期 张长平等:真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响
图 2　胞外蛋白含量的变化
Fig.2　Changes of extracellular protein content induced by Fo
2.2　真菌诱导子对红豆杉悬浮培养体系 pH的影响
真菌诱导子的加入 ,使细胞培养体系发生了碱
化 ,如图 3所示。一般 ,植物细胞对 pH 具有较强的
自我调控能力 ,而诱导作用引起了质子的内流 ,因此
推测 pH 的改变很可能是诱导子对植物细胞独特的
诱导机制所致。真菌诱导子对细胞进行诱导时 ,作
为一种信号分子 ,它本身不能进入细胞内部 ,只能依
靠信号转导途径来调节细胞的生长 、代谢和在环境
中的生存能力。如 Ca2+的跨膜运输就是细胞信号
转导的重要途径之一 ,而其所需的能量正是由质子
的流动及电化学梯度所提供的 。
图 3　Fo 对体系酸碱度的影响
Fig.3　Effects of Fo on the pH
2.3　真菌诱导子诱导的氧迸发
氧迸发是植物细胞受到真菌诱导子刺激后所发
生的很重要的一个防御反应。所谓氧迸发是指细胞
中反应性氧的快速 、短时间大量释放的现象 。这些
活性氧组分主要包括:H2O 2 ,O-°2 ,OH-° ,它们是在植
物细胞受侵染时 ,侵染信号可能经 G 蛋白介导 ,活
化质膜氧化还原反应 ,从而在细胞表面迅速产生的 。
当Fo被加入到红豆杉细胞培养体系后 ,总活性氧在
4h时达到高峰 ,如图 4。但过多的活性氧对细胞是
有害的 ,自由基具有很强的氧化能力 ,很不稳定 ,能
持续进行连锁反应 ,对许多功能分子有破坏作用 。
如自由基能引发蛋白质(或酶 、核酸)功能分子的二
聚作用和歧化反应而影响蛋白质的结构和功能 ,而
且二聚作用还能导致DNA的损伤 。因此 ,诱导子加
入到细胞培养体系后 ,大量自由基的产生诱发了自
由基防御体系中酶保护系统的显著变化以实现对细
胞自身的保护 。
图 4　Fo对氧迸发的影响
Fig.4　Effects of Fo on the oxygen burst
2.4　真菌诱导子对自由基清除系统保护酶的影响
受到真菌诱导子的刺激后 ,细胞通过启动或加
强抗氧化酶类的表达 ,以及时清除有害的自由基。
真菌诱导子Fo 对南方红豆杉细胞的超氧化物歧化
酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活
性的影响如图 5 、图 6 、图 7所示。活性氧对细胞既
有有利的一面 ,同时对细胞也有毒害作用。加入诱
导子后 ,3种酶活先后均有提高 ,但有明显的时间顺
序。首先 ,SOD活性得到提高 ,在诱导 4h 左右就达
到了高峰 。在生物体内 ,它是一种重要的自由基清
除剂 ,对生物体有保护作用 ,SOD使O-°2 得到快速清
除 ,转化为H2O2 和O2°催化反应式为:2H++O-°2 ※
O2+H2O2(SOD催化)。由图 5可知 ,在诱导的前期 ,
SOD高于对照组 ,这主要是由于诱导子的介入 ,引发
了大量自由基产生所致 ,细胞为了维持胞内生存环
境的相对稳定性 ,通过提高 SOD活性来消除 O-°2 对
细胞造成的危害。
图 5　胞内 SOD活力变化
Fig.5　Effects of Fo on the activity of SOD
438 生　　物　　工　　程　　学　　报 17卷
图 6　胞内 CAT 活力变化
Fig.6　Effects of Fo on the activity of CAT
图 7　胞内 POD活力变化
Fig.7　Effects of Fo on the activity of POD
　　CAT 能够消除过量的 H2O2 对细胞造成的伤害 ,
它能催化如下的反应 ,H2O2+H2O2※2H2O+O2(CAT
催化)。如图 6所示 ,CAT 的活性在前期受到抑制 ,
低于对照组 ,这使得 H2O 2 能在一段时间内维持一
定的浓度 。H2O2 是与细胞的信号转导有关的 ,它能
作为胞内第二信使。但是 ,过量的 H2O2 也会对细
胞产生毒害作用 。在诱导后期 , CAT 的活力高于对
照组 ,出现了峰值 ,来消除多余的 H2O2 对细胞的毒
害作用。
POD ,在健康的细胞中也有 POD , 而诱导之后
POD的活力增加且 8h左右达到峰值 ,并一直维持在
较高的活力 ,高于对照水平。一般认为这是由于
POD的同工酶的合成被启动而引起了总 POD活力
的升高 。POD主要有两方面作用 ,其一 , POD与膜
外表面紧密结合 , 能氧化外环境中的 NADH 产生
H2O2 和O-°2 ,O-°2 又可以自发或在超氧歧化酶的作
用下生成 H2O2 ,在细胞信号转导中发挥重要作用 。
因此在诱导的前期 ,POD活力升高。它能促进 H2O2
的形成 ,并使其维持在一定的浓度 。其二 ,POD对细
胞具有抵御过氧化物破坏的保护功能。在后期 ,
POD仍然保持较高的活性 ,它的主要作用是用来消
除过量的过氧化物对细胞的损害作用。LOOH(过氧
　　　
化物)※LOH+H2O(POD催化)。
由此可见 ,活性氧组分的产生及清除引起了自
由基清除系统中氧化还原酶活力的波动性变化 ,从
而改变了细胞的氧化还原态势 ,进而刺激了细胞的
生物功能及代谢结构的变化 。
2.5　真菌诱导子对紫杉醇合成的影响
一般认为 ,调节连接初生代谢和次生代谢 、次生
代谢分支途径的关键酶的活性和酶量与特定的代谢
途径的活化及相关产物的积累呈正相关性 。由图 8
可知 ,诱导子处理后 , 4h时苯丙烷类代谢途径中重
要的酶 PAL 的活性就达到了峰值。PAL 是桂皮酸
途径的定速酶 ,苯丙氨酸经 PAL脱羧作用产生紫杉
醇的侧链物质苯甲酸 ,从而加强了紫杉醇的生物合
成。
图 8　PAL的活力变化
Fig.8　Changes of Activity of PAL
相应的 ,紫杉醇的产量在 36h 内也有了明显的
提高 ,如图9所示。由此可见 ,细胞态势改变的同时
伴随着代谢路径的活化和紫杉醇合成能力的提高 ,
而包括紫杉醇在内的次生代谢产物的形成正是细胞
对外界刺激积极防御的表现和细胞态势改变的表
征。诱导子对次生代谢产物形成的诱导存在时间
性。据报道 , 使 mRNA 达到足够的量大约需要
30min
[ 9] ,因此推测 ,紫杉醇真正形成的最高峰很可
能需要更长的时间 ,本文延长了对紫杉醇的监测时
间 ,发现此峰值出现在诱导后第 4 天 , Taxol 产量提
高了 5倍左右 ,达到 67mg L。由实验结果可知 ,在
南方红豆杉悬浮培养体系中 ,细胞的氧化还原态势
的改变与紫杉醇的合成具有一定的时序性 , SOD 、
POD 、CAT 、PAL 的活性的峰值分别出现在诱导后的
第 4 、8 、20 、4h ,而紫杉醇含量的峰值出现在第 96h。
细胞态势对诱导子的响应时间相对较短 ,正是这短
暂的动态变化改变了细胞的生理状态及其代谢结
构 ,使紫杉醇的产量得到了提高 。诱导与产物的合
成具有时间过程 ,并且诱导使细胞的生理态势逐步
向有利于次生代谢产物形成方向转变 。
4394 期 张长平等:真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响
图 9　Fo10对紫杉醇合成的影响
Fig.9　Effects of Fo on the production of taxol
3　结　论
真菌诱导子引起了悬浮培养南方红豆杉细胞的
快速应答反应 ,发生了氧迸发现象 ,细胞的氧化还原
态势发生了改变 ,在自由基的释放和清除过程中一
些特定的信号转导途径被激活 ,一些特定的次生代
谢途径 ,苯丙烷类代谢途径和紫杉烷类代谢途径被
开启或加强 ,路径中酶的表达从转录和翻译水平上
相继被加强 ,紫杉醇产量得到了明显的提高 ,达到了
对照组的 5倍左右 。因此 ,细胞态势的改变导致了
细胞代谢结构的改变 ,使流向紫杉醇合成的代谢物
流增加。可见 ,真菌诱导是提高紫杉醇产量的一种
新奇有效的方法 。
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Effects of Fungal Elicitor on Cell Status and Taxol Production in Cells
Suspension Cultures of Taxus chinesis var.mairei
ZHANG Chang-Ping1　LI Chun1　YUAN Ying-Jin1＊　SUN An-Ci2　HU Chang-Xu2
1(Department of Biochemical Engineering , School of chemical Engineering and Technology , Tianjin University Tianjin　300072, China)
2(Institute of Bopany , Chinese Academy of Sciences , Beijing　100093 , China)
Abstract　Effects of fungal elicitor on cell redox status and taxol production were studied in suspension cultures of Taxus chinesis
var.mairei in the late exponential stage.The results show that fungal elicitor induced oxygen burst , changes of the cell redox sta-
tus , alkalinization of medium and the fluctuation of the activity of redox enzymes with a sequence.The content of protein repre-
senting the quantity of enzymes increased.The activity of SOD increased quickly after treatment by fungal elicitor and that of POD
could be kept at a higher level in contrast to the control.The activity of CAT was inhibited at first and followed by an obvious in-
crease ,while the activity of PAL was promoted.The taxol yeild was 5 folds of the control , reaching to 67mg L.
Key words　fungal elicitor , taxol , suspension culture , oxygen burst , SOD , POD , CAT
Received:Octorber 17 ,2000
This work was supported by grant from National Natural Sciences Foundation of China(29976032).
＊Corresponding author.Tel:86-22-27401149;Fax:86-22-27403888;E-mail:yjyuan@public.tpt.t j.cn
440 生　　物　　工　　程　　学　　报 17卷