全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：509～513
Journa／of Wuhan Botanical Research
一 株具有特异 AFLP指纹图谱 的杜仲古树
邓建云 ，李建强 ，黄宏文h
(1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074；2．中国科学院研究生院，北京 100039)
摘 要：杜仲(Eucommi~ulmoides Oliver)是原产于我国的传统药用植物，虽然目前杜仲被广泛栽培，但野生杜仲已
非常稀少 ，几乎难以见到。作者在利用 AFLP分子标记技术研究杜仲的遗传多样性和居群遗传结构时 ，发现一株采
自神农架自然保护区的树龄200多年的雄性杜仲古树(编号为sNJ5)的 AFLP指纹图谱与其它 582株树龄为 10～
52年的栽培杜仲的指纹图谱有显著的不同。在总计为 191条多态带 中，有 44条为高频率显性等位基因带(higIl
frequency dominant alele bands，HFDAB，即583个个体中只有 1～3个个体缺乏的带)。SNJ5缺乏 23条 HFDAB，其
中有12条HFDAB是SNJ5单独缺乏的，与其他582个个体差异显著(P<0．05)；另外，SNJ5还具有一条特有带(E
+ACG／M+CTG引物组合的217 bp带)。据此推测这一杜仲古树是原始野生植株，是近年来众多学者认为野生杜
仲灭绝后发现的非常重要的种质资源 ，应加以大力保护。
关键词：AFLP；保护；杜仲；古树 ；种质资源
中图分类号：Q948 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2006)06-0509—05
Discovery of an Originally W ild Tree of Eucommia
ulmoides Oliver by AFLP Fingerprinting
DENG Jian．Yun ， ，LI Jian．Qiang ，HUANG Hong．Wen
(1．Wuhan肋tanical Garden，The Chinese Academy ofSdences，Wuhan 430074，China；
2 Graduate School ofthe Chinese Academy ofSc／ences，Beijing 100039，China)
Abstract：Eucommia ulmoides Oliver iS a traditional medicinal plant species endemic to China．At pre．
sent，although it is widely cultivated，wild E．ulmoides iS extremely rare and in brink of extinction．Dur．
ing our recently extensive toolecular investigation in genetic diversity and population structure of E． ul—
moides using AFLPs，a male plant over 2o0 years old(Sample code：SNJ5)in Shennon~ia National Na—
ture Reserve was found to have a unique AFLP fingerprint which was signifcantly diferent from that of
other 582 cultivated individuals of 10—52 years old．Of the total 191 polymorphic bands．44 ban ds were
high frequency dominant alele bands(HFDAB．the bands that were absent only in l一3 individuals of
the total 583 samples)．SNJ5 was lack of 23 HFDABs in which 12 HFDABs were absent in SN『J5 only．It
Wilt8 signifcantly diferent from that of other 582 cultivated individuals(P<0．05)．Furthermore，SNJ5
had a private band(217 bp band in E+ACG／M +CTG primer combination)．We suspect that this old
E．ulmoides tree iS likely tO be the originaly wild survivor．An immediate protection action iS needed to
secure this very important germ plasm resource．
Key words：AFLP；Conservation；Eucommia ulmoides；Old tree；Germ plasm resource
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是单科、单属、
单种植物。杜仲在第三纪曾广泛分布于欧洲和美
洲，直到第四纪冰期侵袭时才在这些地区开始消失；
我国现存的杜仲是地质、气候史上残留的孑遗植物，
也是现存杜仲的唯一孑遗产地 j。杜仲是我国的
传统药用植物，其药用历史非常悠久，2000多年前
的汉墓医药木简和传统药物学典籍《神农本草经》
就记载了杜仲的药理功效[2]。传统上是取杜仲皮
作为药用，这种利用方式对植株本身来说几乎是致
死性的。至近代，杜仲虽被广泛栽培，但野生资源已
很少。20世纪80年代末，由于杜仲资源的综合开
发利用，杜仲皮的价格曾一度很高，在经济利益的驱
动下，各地对杜仲采取掠夺式的采伐，尤其是深山密
林中的大树、古树遭到了毁灭性的采伐，整株树被伐
倒剥皮甚至挖根剥皮，致使杜仲野生资源遭到严重
破坏，几近枯竭。野生杜仲成为濒危物种而被列入
收稿日期：2006-04-05，修回日期：20064)6．16。
作者简介：邓建云(1965一)，女，副研究员，中国科学院武汉植物园在读博士研究生，主要从事药用植物的保育遗传学研究
(E·mail：dengiy@wbgcas．ca)。
+ 通讯作者(Author for correspondence．E—mail：hongwen@wbgcas．ca)。
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510 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
《中国植物红皮书》 】。目前，野生杜仲已极度稀
少，难以见到，甚至有学者认为野生杜仲已经灭绝；
且野生、栽培杜仲很难分辨。
我们在利用 AFLP分子标记技术研究杜仲的遗
传多样性和居群遗传结构时，发现一株采自神农架
国家自然保护区的杜仲古树的AFLP指纹图谱与其
它杜仲个体的指纹图谱有明显的差异，现报道如下。
1 材料和方法
1．1 植物材料
共采集7省市 1O个居群的583株杜仲的嫩叶，
用硅胶干燥保存，采样居群和样本大小见表 1。本
文报道的这株杜仲古树位于神农架国家自然保护区
内的下谷坪乡板桥河村七组一户村民房屋的侧面
表 1 杜仲 10个居群的地理位置及样本大小
Table 1 Location and sample size of10 Eucornm~ ~moides Oliv．populations
居群
S
样
am
本
pl
大
e s
小
izePopulation Lo
地
ca
点
tion kltltlde Lon tllde AItltld0
(北纬 31。24 17 ，东经 110。10 47 ，海拔 1143 m)，
树高约 20 m，胸径 64 cm，据当地村民记述和现场
树体特征判断其树龄为200多年。在本实验中将其
编号为SNJ5。
1．2 实验方法
总 DNA的提取用 Doyle等 的方法稍加改良。
AFLP技术基本上采用 Vos等 的方法，4 基因
组 DNA(200 ng)用 EcoR I和 Trul I(DNA识别位点
和酶切位点同Mse I)同时酶切并用 T4连接酶连接
到接头上，酶切连接产物稀释 1O倍后用带 1个选择
性碱基的引物预扩增，预扩增产物稀释25倍后用带
3个选择性碱基的引物进行选择性扩增。选择性扩
增片段在 6％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，按
Zhen等 ]的方法银染显带。先用 16个杜仲样本对
88对引物组合进行检测，从中筛选出6对多态性较
高且带纹清晰的引物组合(E+AGC／M+CTA；E+
ACC／M +CCA；E +ACG／M +CTG；E +AGC／M +
CCA；E+AGT／M+CTC；E+ACT／M+CCA)，用来
对所有样本进行 AFLP分析。
2 结果与分析
6对引物组合在583个个体中共扩增出228条
清晰的带，其中37条为共有的单态带(所有个体包
括 SNJ5都具有的带)，191条带为多态带(某些个体
具有而其他个体缺乏的带)。191条多态带中有44
条为高频率显性等位基因带(High frequency domi—
nant alele band，HFDAB，即583个个体中只有 1—
3个个体缺乏的带)，另有一条带 (E+ACG／M+
CTG引物组合中217 bp带)为SNJ5所特有(高频率
隐性等位基因带，HFRAB)，其余 146条多态带随机
地为一些个体所具有，而在另一些个体中缺乏。将
HFDAB和缺乏 HFDAB的个体及 SNJ5的特有带总
结于表 2。
杜仲古树SNJ5缺乏23条HFDAB，加上一条特
有带，共24条，分别占总多态带和总高频率等位基
因带(High frequency alele band，HFAB)的 12．57％
和53．3％，而其他个体中缺乏HFDAB最多的是 12
条(SNJ8)(见表2)，分别占总多态带和总 HFAB的
6．28％和 26．67％，统计学处理的结果表明两种百
分数的差异都是显著的(P<0．05) ；而且有 12条
HFDAB是 SNJ5单独缺乏的(图 1显示 SNJ5单独缺
失的E+AGC／M+CCA引物组合中的 246 bp带)，
分别占总多态带和总 HFDAB的6．28％和27．27％，
而其他个体中单独缺乏 HFDAB最多的是 4条
(SJ46)(见表 2)，占总 多态 带 和总 HFDAB的
2．o9％和9．09％，差异显著(P<0．05)。虽然原则
上 任 何 个 体 在 大 量 的 AFLP 标 记 的 基 础
上都能表现出独特的AFLP标记的组合图谱 J，但前
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·此带为SNJ5所特有；其他的带都是HFDAB；各居群代号的中文名见表1
This b d— present in SNJ5 only．other b~lds aJe I HFDAB：The Chin~ I— e of populations code日m in Table 1
箭头示SNJ5样奉单独缺必的 246 bp带 Sl；J1一lO为样本编号；M为 Marker(25 bp DNAladder)；。0’为无样本 L。左侧数字
为 Marker的片段大小(100 bp一300 bp，相邻 Marker片段间相差25 bp)(246 bp1；；外)
AⅡnwindieate~q 246 bp band whichw且8 86nlin SNJ5~mly．$NJI—10 are s枷 p1⋯cod ；Mmpm~ ts MⅡ er(25 hp DNAladder)；
‘0’is】ⅡJ wi【h0ut 8帅 ．TheⅢ]m} 0l the left目Ide i c咖 e 6a目忡 t Bi B of the Marker(raE1 Dm 100 bp【1)300 hp．there
25 Lp diference between nei botring b肌 )(except for246 by)
圉 1 神农架居群样本的E+AGC／M +CCA引物组合的AFLP指纹圉谱
Fig．1 AFLP fingerprints 0f samples of SNJ population using E+AGC／M +CCA D 巾er combination
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512 武 汉 植 物 学 研 究 第24卷
述的那些带纹特征却勾勒出了 SNJ5与众不同的非
常独特的AFLP指纹图谱，呈现出一种特异的基因
型，可能代表了一种较为古老的基因型。推测这株
杜仲古树是原生野生植株。
3 讨论
AFLP分子标记技术具有重复性好、涵盖全基
因组范围、高水平的多态检出率以及无需事先了解
被研究对象的基因组信息等优点，因此被广泛应用
于植物分子指纹图谱、遗传多样性、基因定位、遗传
图谱的构建以及分类学等方面的研究 。
通常假设每一条 AFLP带代表一个单个的显性
的核基因位点，这一位点具有两个可能的等位基因：
A(有带，即一个特定大小的扩增片段)和 a(无带)。
个体间的多态性最终来源于 DNA的插入、缺失或碱
基取代L9]。一条 AFLP带的“有”或“无”反映了这
一 位点上的 DNA序列的差异。SNJ5有 24条高频
率等位基因多态带与99．66％的个体(581个个体)
不同，其中的 13条带(12条缺乏，1条特有)与其他
所有个体都不同。虽然在其他 146条多态带上各个
体间的差异大小不易确定，但 SNJ5在 HFAB多态带
上明显地不同于其他个体(P<0．05)，表明 SNJ5在
这 24个位点上的 DNA序列不同于几乎所有其他栽
培个体，即SNJ5具有与目前栽培的杜仲非常不同的
基 因型 。
杜仲的栽培历史虽无确切的记录，但从杜仲的
利用历史(至少2000多年)和其利用方式(剥皮)来
看，完全可能在较早的时期就开始了养护性质的杜
仲山地栽培，以弥补因长期剥采而逐渐造成的野生
杜仲资源枯竭 J。1937年，陈嵘在《中国树木分类
学》中记载杜仲：“中国特产，但野生者，均用其皮供
药用，多滥行剥皮而尽生枯毙，故今除栽培外，未见
之也”L1]。虽不能就此说 2O世纪 3O年代野生杜仲
已不存在了，但清楚地表明在那时野生杜仲已非常
稀少，绝大部分为栽培杜仲，而且这种栽培大多是房
前屋后的小规模栽培。杜仲的繁殖方式主要是种子
繁殖，大多数随后世代的种质可能是从同一林地的
母树上采集的。这种栽培居群极有可能是建立在携
带亲本群体的一部分遗传变异的几个个体之上的。
植物的栽培可能包含了驯化的过程 ¨，驯化过
程伴随着基因组范围的遗传多样性的丧失-1¨。基
于谷类作物的数据，30％ 一40％的基因组范围内的
多样性降低是比较普遍的-1 ；而栽培向日葵只保留
了野生向日葵40％ 一50％的多样性-】副；木本植物橄
榄树栽培植物的遗传多样性也显著低于野生植物的
遗传多样性 ¨。这种遗传多样性的降低大多是由
于在建立栽培家系的过程 中产生的居群瓶颈引
起n ， 的。驯化也是一个进化过程，栽培居群可以
存在着不同的驯化阶段。植物在更高的驯化阶段
时，通常是遗传上相似的并且与它们的野生祖先存
在着很大的差异 ]。杜仲在长期的栽培历史中必
然经历了与其他栽培植物类群相似的奠基者效应和
遗传瓶颈，栽培杜仲的遗传多样性也会相应地降低。
遗憾的是野生杜仲居群已不复存在，我们难以知道
栽培杜仲的遗传多样性与野生杜仲相比究竟降低了
多少。但是本实验中 SNJ5具有的与其他被研究的
所有栽培杜仲显著不同的 AFLP指纹图谱所传达出
的特异的遗传变异样式，表明这株杜仲古树具有与
现代栽培杜仲显著不同的遗传变异特征，可能代表
了一种较为古老的基因型。
后蜀韩保升《蜀本草》(938—964年)记载，杜
仲生深山大谷，“今所在大山皆有”。后蜀为五代十
国之一，建都成都，辖有今四川和陕西南部、甘肃东
南部、湖北西部 J。说明其境内山地都有野生杜仲
分布，湖北西部神农架地区是野生杜仲分布区之一，
2O世纪5O年代前是自然原始森林 ，5O年代后才开
始人工采伐。本文报道的杜仲古树位于仍处于较为
原始状态的神农架国家自然保护区的深处，加上其
200多年的树龄，尤其是它非常独特的基因组 DNA
分子指纹图谱 ，使我们有理由认为这株杜仲古树是
野生的或至少是半野生的。一种可能是 200多年前
有人来此山坡上定居之前这株树就存在于此地；另
一 种可能是在此居住的村民将山中的野生杜仲移栽
到居所旁边，这种做法对一种重要的经济树种来说
虽然是比较常见的，但由于该处在 2O世纪 5O年代
前还是无人涉人的原始森林其可能性不大。
另一有趣的结果是另一株杜仲 SNJ8缺乏的 12
条 HFDAB中有7条也是 SNJ5缺乏的，SNJ8位于紧
邻 SNJ5的房屋的前面，树龄 2O多年，是由同村的一
株栽培杜仲母树上的种子繁育的。显性标记 AFLP
虽然也用于亲本分析-8， ’ J，可是由于没有采集到
SNJ8的母树样本 ，所以利用 AFLP指纹图谱对 SNJ5
和 SNJ8进行父系分析是不太可能的 ；但从 SNJ8
和 SNJ5两个个体更为相似的AFLP指纹图谱 ，推测
SNJ8可能是 SNJ5的后代。杜仲是风媒传粉的雌雄
异株植物，SNJ8有可能是 SNJ5的花粉授粉所得的
子代。风媒传粉的雌雄异株植物的花粉长距离传播
是一种常见的自然现象。现存的这株具有特异遗传
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变异的雄性杜仲古树 SNJ5完全有可能在一定程度
上通过长距离的基因流以渐渗的方式拓宽神农架居
群乃至整个种的栽培杜仲的遗传基础。
植物的种质资源的遗传完整性应该涵盖从最原
始的野生祖先到高级阶段的栽培品种的所有的等位
基因来源 ¨ 。由于人类过度利用野生植物资源以
及施加于栽培植物上的选择压力，实际上目前几乎
所 有物种 都遭受 了不 同程 度的遗传变 异的丧
失[1 ]。多数栽培植物有限的遗传多样性使得它
们更易遭受病虫害的侵袭，同时也危及长期的持续
遗传改良的潜力 。¨野生植物由于是严格的自然
产物，携带了有用的基因保护植物以应对各种压力，
如病虫害、旱涝等 ¨ 、以及一些可以提高栽培植物
品质的优质基因 。¨因此保护植物的遗传多样性
尤其是野生植物的遗传资源显得非常重要和迫切。
在野生杜仲资源几乎丧失殆尽的情况下，对这株具
有特异基因型的杜仲古树进行切实的保护和深入的
研究是有十分重要的意义的。
4 结语
本文报道的杜仲古树具有显著不同于现代栽培
杜仲的 AFLP指纹图谱 ，推测它可能是野生的或至
少为半野生，是重要的种质资源。虽然神农架国家
自然保护区管理局对这株杜仲古树采取了一些保护
措施，如不允许砍伐等，但这还远远不够。相关部门
应加大对这一重要遗传资源的保护力度，采取多种
措施进行保护，如保存其花粉和基因组 DNA等；并
对其进行深入研究，最终将其基因资源应用于杜仲
的遗传育种上。
致谢：神农架居群样本的采集工作得到了神农架国家
自然保护区科学研究所杨敬元所长和中国科学院武汉植物
园王庆研究员、杨波研究员的大力帮助；本研究室的姜正旺
副研究员帮助拍摄图片 ，在此表示衷心地感谢!
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