全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 1) : 27～30
Journal of Wuhan Botanical Research
红莲优 6号杂交水稻与亲本三系不同发育时期
幼苗叶片基因表达差异分析
张义平, 陈学峰, 熊建华, 朱英国
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉 430072)
摘 要 : 运用 DDRT -PCR 对红莲型杂交稻组合红莲优 6号及其亲本、保持系(粤泰 A、粤泰 B、9311)的一叶期、三
叶期叶片基因表达状况进行分析。结果表明: 杂种与亲本之间在同一发育时期基因表达既有质量上又有数量上的
差异, 但差异表达基因所占比例较小;而对于同一材料 ,一叶期、三叶期的叶片 cDNA 扩增带型相似, 没有发现基因
质上的差异表达, 说明一叶期与三叶期幼苗叶片基因表达差异很小。实验也证明DDRT -PCR 技术结合银染方法是
一种简单快速分析差异表达基因的有效方法。
关键词: 红莲优 6 号; 杂种优势; 基因表达; 幼苗; mRNA 差异展示
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2003) 01-0027-04
Differential Display of Gene Expression in Hybrid Rice Honglianyou-6 and
Its Parental Three-line Seedling Leaves in Different Developmental Stages
ZHANG Yi-Ping, CHEN Xue-Feng , XIONG Jian-Hua, ZHU Ying-Guo
( K ey Laboratory of MOE f or P lant d ev elop mental Biology, W uhan Univ er si ty, Wuhan 430072, China)
Abstract: T he gene expression in leaves for hybrid rice, Hongl ianyou-6, and its parental lines
( YTA , YT B, 9311) at differ ent development stag es w as analyzed by using DDRT-PCR. Our re-
sults revealed that both quality and quant ity dif ference in gene expression w ere detected among
hybrid and parental lines at same developmental stag e. Although gene expr ession in hybrid is ob-
viously altered, the dif ferent ial expr essed gene st il l occupy a very small proport ion o f to tal ex-
pressed gene; In addit ion, no qualitat ive difference in gene expression w as observed betw een one-
leaf stage and tri-leaf stag e in the same material. T his indicate the gr eat sim ilar ity of gene expres-
sion in the tw o stag es. Also, our experiment further provide evidence that DDRT -PCR technique
w ith silver staining is a r apid, and convenient method for detect ing different ially expressed genes.
Key words : Hongl ianyou-6; Heterosis; Gene expression; Seedling; mRNA dif ferent ial display
杂种优势应用于水稻取得了举世注目的增产效
果[ 1] ,但目前杂交水稻的产量徘徊不前,迫切需要我
们对杂种优势的机理及预测进行深入研究, 许多生
物学家从生理生化代谢 [ 2] , 同工酶分析[ 3] ,分子标记
技术[ 4] , DNA 差异分析[ 5] , mRNA 差异分析[ 6]进行
了许多有益的研究工作,但目前杂种优势的分子机
理仍未阐明。
1992 年 Liang 与 Pardee 建立了差异展示技
术[ 7] ,以其灵敏度高,简易快速的优点受到了研究工
作者的青睐, 并不断被改进[ 8] , 在分析基因表达差
异,为进一步研究表达产物的生物学功能,为从分子
水平揭示机理可能提供了重要线索,因此,本研究从
收稿日期: 2002-06-06,修回日期: 2002-09-18。
基金项目:国家 973资助项目( 2001CB108806)。
作者简介:张义平( 1971- ) ,男,江西都昌人,讲师,九江学院医学院生物化学与分子生物学教研室工作。武汉大学生命科学学院在职硕士。
通讯作者。
分析基因表达入手, 以本实验室的红莲型杂交水稻
及其亲本为材料, 利用 mRNA 差异展示技术
( DDRT -PCR)寻找它们幼苗发育早期的叶片基因
表达的差异, 为进一步分离杂种优势相关基因, 探索
杂种优势形成过程奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
水稻杂种一代红莲优 6号( HLY-6)、不育系粤
泰 A ( YTA )、保持系粤泰 B ( YTB)、恢复系 9311
( 9311)均为本实验室提供, 浸种消毒, 光照恒温箱
28℃,光照12 h 培养,采集生长9 d的一叶期和 16 d
的三叶期叶片备用。
1. 2 差异展示 PCR引物
锚 定引 物购自 上海 博亚 公 司5 T 12 CG 3、
5
T 12GC
3、5T 12GA 3、5T 12AC3。随机引物购自上海
Sangon 10-mer 引物 S103、S104、S106、S109、S111、S113、
S244、S245、S361、S362、S385、S411。
1. 3 水稻幼苗总 RNA提取
采用 T RIZOL ( GIBCO 公司 ) 试剂提取总
RNA ,按试剂盒说明进行。
1. 4 转录及 PCR 扩增
反转录反应体系 25 L,反应条件遵照 M-Mulv
逆转录酶(上海 Promega 公司)说明操作, 42℃ 1 h,
72℃ 10 m in, 取 2 L 的反应体系进行 PCR 扩增。
PCR 扩增反应体系 20 L, cDN A 第一条链
2 L, T aqDNA 聚合酶( TaKaRa 公司)按说明书进
行, M gCl2 终浓度 1. 5 mmol / L。PCR 程序为 94℃
5 min; 然后 94℃ 1 min, 40℃ 90sec, 72℃ 1 min
40个循环,最后 72℃延伸 7 min。
1. 5 配聚胶电泳,银染及差异带回收
扩增产物于5. 6%尿素变性聚丙烯酰胺( 19 1)
胶, 450-500V 电压电泳。银染参照文献程序[ 9]。
差异带回收: 用干净手术刀切下差异显示带,放
入离心管中, 加双蒸水洗涤,然后 1×PCR缓冲液洗
涤, 40 L 1×PCR Buf fer 94℃保温1 h, - 20℃保存
留作PCR扩增。
2 结果与分析
2. 1 杂种一代与亲本一叶期、三叶期叶片同时期基
因表达差异比较
采用不同锚定引物和随机寡核苷酸引物组合,
进行 RT -PCR扩增, 聚丙烯酰胺凝胶电泳经银染显
示 cDNA 的差异, 主要以杂交水稻为参照, 将不育
系、恢复系、保持系分别与杂交水稻红莲优 6 号比
较, 观察到的差异类型可分为: 个体特有的差异
带,仅在杂种一代或亲本单独表达; 在杂种一代和
亲本两者都表达,在量上表现强弱差异性; 在杂种
一代和父本、母本、保持系三者或三者以上均表达,
在量上表现强弱差异性。图 1上 DNA 背景浓度相
似说明 4个材料的 cDNA 总浓度相近,可以作差异
比较的标准。部分结果如图 1。
M. DL2000DNA Marker ; A、B、H、R. 三叶期幼苗叶片
cDNA( A . 不育系; B.保持系; H. 杂种; R. 恢复系) ; 1. 特
异带, 2. 增强带, 3.减弱带(括号内为对应材料) ;锚定引
物为5T 12CG 3 ;随机引物为 S103
M: DL2000DNA M arker ; A , B, H, R . seedling leaves cD-
NA at t ri-lea f stag e ( A . Sterile line ; B. Mainta iner line ;
H. Hybrid; R. Restor e line) ; 1. Specific bands, 2. Enhanc-
ing expressed bands, 3. Weakening expressed bands
( Cor r esponding t o mat er ial in br acket ) ; Anchor primer :
5T 12CG 3; Random primer: S103
图 1 同一发育时期幼苗叶片 mRNA的差异展示
F ig . 1 Differ ential displa y of seedling leaves mRNA at
the same developmental stag e
2. 2 杂种一代与亲本一叶期、三叶期叶片基因 时
序表达差异比较
实验表明, 一叶期与三叶期两个时期的同种材
料基因表达差异比较,带型近乎相同,没有发现基因
质上的差异表达, 但发现有个别 DNA 条带量上强
弱的差异。说明一叶期与三叶期幼苗叶片基因表达
差异较小。部分结果如图 2。
2. 3 杂种一代与亲本不同组引物差异显示统计结
果
数据分析, 48对锚定引物和随机引物组合, 每
对引物组合能扩增出 40～60条 cDNA 带, 与杂种
红莲优 6号作对照,每对引物能扩增出的 cDNA 带
平均有1. 05%在杂种和亲本之间表现差异。通过相
28 武 汉 植 物 学 研 究 第 21 卷
同发育时期和不同发育时期的差异分析, 不同引物
组合扩增所检测到的差异带型数量变化不同,部分
未能发现差异, 将 48对引物在同一模板扩增出的带
型汇总,这些差异如上文归为 3种类型(见表 1)。
M. DL2000DNA Marker ; A1、B1、H1、R1. 三叶期幼苗叶片
cDNA( A1.不育系; B1.保持系; H1. 杂种; R1.恢复系) ; A2、B2、
H2、R2.一叶期幼苗叶片 cDNA( A2.不育系; B2. 保持系; H2. 杂
种; R2.恢复系) ; 1. 特异带, 2.增强带, 3.减弱带(括号内为对应
材料) ;锚定引物为5T 12CG3;随机引物为 S103
M. DL2000DNA Marker ; A1, B1, H1, R1. Seedling lea ves cDNA
at tri-leaf st age ( A1. Sterile line; B1. Mainta iner line; H1. Hy-
brid; R1. Restor e line) ; A2, B2, H2, R2. Seedling leaves cDNA at
one-leaf stag e ( A2. Sterile line; B2. Maintainer line ; H2. Hybrid;
R2. Restor e line ) ; 1. Specific bands, 2. Enhancing expressed
bands, 3. Weakening expressed bands( co rr esponding to mater ial
in bra cket ) ; Ancho r pr imer : 5T 12CG3; R andom pr imer : S103
图 2 不同发育时期幼苗叶片 mRNA差异显示分析
F ig . 2 Compared analy sis of defferential display of
seedling leaves mRNA of the same mat erial
in differ ent developmental stag es
表 1 红莲优 6 号及亲本 48对引物差异显示的结果统计
T able 1 Statistical data o f DDRT -PCR with 48 pr ime pairs for hybr id and parental lines
类型 Types 一叶期 One-leaf stag e
A B H R
三叶期 T r i-leaf stag e
A B H R
特异表达的 cDNA 总带数
Number of specifically expr essed cDNA bands
9 7 15 12 11 7 13 10
增强表达的 cDNA 总带数
Number of enhancing expressed cDNA bands
8 9 11 7 9 8 12 7
减弱表达的 cDNA 总带数
Number of w eakening expressed cDNA bands
5 1 3 4 5 0 3 3
每条泳道平均总带数
Average cDNA bands per lane
45. 3 42. 2 46. 1 43. 2 44. 1 41. 5 47. 0 42. 8
差异带比例( % )
Proportion of differ entially displayed bands in total bands
1. 01 0. 84 1. 31 1. 11 1. 18 0. 75 1. 24 0. 97
注: A , B, H, R. 幼苗叶片 cDNA( A . 不育系; B.保持系; H. 杂种; R .恢复系)
Note : A , B, H, R . Seedling lea ves cDNA ( A . Ster ile line ; B. Mainta iner line; H. Hybrid; R. Rest or e line )
3 讨论
大量的研究表明, 杂种优势形成涉及到基因之
间、各种生理代谢之间以及遗传基因与环境之间的
相互作用。报道表明: 线粒体,叶绿体和核基因组均
参与了作物杂种优势的形成过程 [ 10]。虽然杂种优势
是一个复杂的过程, 但比较杂种和亲本之间的基因
差异,为发现某些与杂种优势相关的特定功能基因,
在了解杂种优势的因素和预测、利用杂种优势还是
有重要的意义。
本实验选用杂交水稻红莲优 6号与亲本进行杂
种优势研究。杂种一代与亲本相比,很多性状上发生
了改变,这种变化可能与基因在杂合状态下的表达
改变有关。种子从萌发时动用种子内贮藏的物质到
幼苗叶片进行较旺盛的光合作用制造充分有机养
料,经历了从异养到自养的过程[ 11] ,由此, 我们选择
幼苗发育早期叶片为研究对象,试图研究幼苗早期
发育的基因表达差异并分离杂种优势相关基因。针
对这一系列材料,一共分析了 48对锚定引物和随机
引物组合, 每对引物能扩增出 40～60条 cDNA 带,
以杂种带型作为参照,差异带所占比例较小, 不同引
物检测的差异带型数量变化不同,每对引物所扩增
的 cDNA 带约有 1%在亲本和杂种之间表现差异。
说明基因表达总体上的差异程度在杂种和亲本之间
差异较小,且与扩增的随机引物有关。在幼苗两个不
同发育时期杂种与亲本基因表达差异的实验中, 对
同时期的基因及不同时期的基因时空差异进行了比
较。同时期双亲与 F 1间的基因表达确实发生了改
变, 表现质和量的改变, 与杂种对比主要有: 个体
特异表达的基因; 双亲表达基因呈现量的强弱差
29 第 1 期 张义平等: 红莲优 6 号杂交水稻与亲本三系不同发育时期幼苗叶片基因表达差异分析
别,杂种抑制或单亲及杂种表达呈现量的强弱差别;
杂种和亲本三系三者或三者以上均表达, 但存在
基因量的强弱差别。很显然这些基因的表达改变可
能影响杂种性状的表现或其它基因表达的改变,这
些基因表达改变的调控机制,对于特定的基因, 是特
异表达,还是增强表达或抑制表达与杂种优势相关,
有待进一步探讨,其结果的进一步证实和完善还有
待开展深入的研究。不同时期的比较分析没有发现
基因表达质的差异,与同材料的扩增带近乎相似,考
虑原因有: 引物所获得不是全部mRNA 的表达差
异,增加引物数目,将会获得更多的杂种及亲本基因
表达的差异类型; DDRT-PCR 技术分析主要是
靠 mRNA 3端的少部分 mRNA 片段; 银染虽然
较为灵敏,但低拷贝及稀有基因表达产物仍不能灵
敏检测,可以尽量优化条件,灵敏性还是比较好 [ 12]。
实验所采用的 mRNA 差异展示技术( DDRT -
PCR) ,能够较简单的比较多种材料间未知基因的表
达差异, RNA 用量较少,操作简单快捷[ 8]。结合银染
分析可准确、方便地回收差异片段: 每一泳道可获
得 40～60个 DNA 条带; DNA 条带直观可见;
灵敏度高。为进一步分析基因功能及探讨所涉及的
代谢过程奠定基础 [ 13]。DDRT -PCR本身也存在一
些明显不足, 如假阳率高, 可重复性差,倾向于分离
到高丰度 mRNA 对应的 cDNA 序列, 5端表现差异
的基因不易检测到等等[ 14]。如上文所述,相应采取
适当措施获得了较好结果。利用此技术,程宁辉、杨
金水等研究了玉米、水稻的杂种与亲本的基因表达
情况[ 6]。关和新等成功的分析了不育系和保持系花
药基因表达的差异[ 15]。因此,利用 mRNA 差异展示
银染技术简单、快速、灵敏、高效地分析杂交稻组合
尽可能多的差异表达基因,为分离与杂种优势有关
的基因提供了可能, 下一步结合 Reverse Nor -
thern
[ 16]筛选阳性克隆, 最终通过 Northen 分析、克
隆、测序,进一步研究基因的结构和功能并弄清它们
之间的关系和相互作用,为我们在分子水平上研究
和揭示杂种优势形成机理提供了有意义的途径。
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