全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (2) : 175～ 178
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
建宁莲子糖蛋白的分离、纯化及清除自由基作用Ξ
高居易1, 陈 彦2
(1. 福建师范大学生物工程学院, 福州　350007; 2. 福建农林大学材料学院, 南平　353001)
摘　要: 从红花建莲 (N elum bo nucif era Gaertn. Fu jian) 的莲子中提取出具有生物活性的糖蛋白 (GL P) , 并进行清
除自由基作用的研究。用 60% (N H 4) 2SO 4 饱和溶液沉淀蛋白质, 经ConA 2Sepharo se 4B 亲和层析柱分离, Sephadex
G2150 凝胶层析柱纯化, 得到 2 个组分的糖蛋白, 分子量分别为 25kD 的 GL P2É 和 92. 5kD 的 GL P2Ê , 后者为其主
要成分。GL P 中蛋白质含量是 5818% , 总糖含量是 3614%。TL C 和 GC 分析结果: GL P2É 是由L 2鼠李糖,D 2木糖,
D 2甘露糖和D 2葡萄糖组成。其中性糖摩尔比: 1108÷ 0192÷ 2154÷ 4115。GL P2Ê 是由L 2鼠李糖D 2木糖, D 2甘露糖,
L 2阿拉伯糖,D 2半乳糖,D 2葡萄糖和D 2葡萄糖醛酸组成, 其中性糖摩尔比: 1125: 1103÷2185÷0194÷3116÷4165。药理
实验表明: 两种糖蛋白均有清除自由基的作用, 而 GL P2Ê 清除能力大于 GL P2É。
关键词: 莲; 糖蛋白; 分离; 纯化; 自由基
　　中图分类号: Q 946　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0220175204
Isola tion , Pur if ica tion of Glycoprote in s from Seed of N elum bo nucif era
Gaertn. Fuj ian and its Effect on Scaveng ing Free Rad ica ls
GAO Ju2Y i1, CH EN Yan2
(1. B ioeng ineering Colleg e, F uj ian T eachers U n iversity , Fuzhou　350007, Ch ina;
2. M ateria l Colleg e, F uj ian A g ricu ltu re and F orestry U n iversity , N anp ing　353001, Ch ina)
Abstract: A b ioact ive glycop ro tein ( GL P ) w as iso la ted and pu rif ied from seed of N elum bo
nucif era Gaertn. Fu jian and it p lays a ro le in scavenging free radica ls. T he glycop ro tein w as p re2
cip ita ted in 60% satu ran ted so lu t ion of (N H 4 ) 2SO 4 f irst, w as pu rif ied by ConA 2Sepharo se 4B
affin ity ch rom atography and by Sephadex G2150 gel f ilt ra t ion ch rom atsgraphy con secu t ively, and
last w as afta ined tw o parts of g lycop ro tein s: GL P2É of mo lecu lar w eigh t is 25 kD and GL P2Ê of
mo lecu lar w eigh t is 9215 kD. A GL P2Ê is p rim ary part in GL P. Con ten ts of p ro tein and to ta l
sugars of GL P are 5818% and 3614% respect ively. By TL C and GC analysis resu lted that, g lyco2
syls of GL P2É are L 2rham no se, D 2arab ino se, D 2m anno se and D 2gluco se, and its mo lar ra t io s of
neu tra l sugars are 1108÷0192÷2154÷4115 and glyco syls of GL P2Ê are L 2rham no se, D 2arab ino se,
D 2m anmo se, L 2xylo se, D 2galacto se, D 2gluco se and D 2glucu ron ic acid, and its mo lar ra t io of neu2
t ra l sugars are 1125÷ 1103÷ 2185÷ 0194÷ 3116: 4. 65. Pham arco logica l tests show ed that, GL P2É
and GL P2Ê bo th cou ld scaven igered free radica l and scavenging effect of GL P2Ê is h igher than of
GL P2É .
Key words: N elum bo nucif era Gaertn. ; Glycop ro tein; Iso la t ion; Pu rif ica t ion; F ree radica l
　　生物细胞的许多功能都与糖蛋白的代谢有关。
糖蛋白是一类糖和蛋白质以共价键连接而成的结合
蛋白。糖蛋白在自然界中分布十分广泛。植物方面
也有很多报道[1, 2 ]。目前, 已知大多数药用蛋白亦都Ξ 收稿日期: 2002208202, 修回日期: 2002212202。
　　　作者简介: 高居易 (1943- ) , 男, 主要从事蛋白质化学和酶工程方面研究。
是糖蛋白。
中国莲 (N elum bo nucif er Gaertn. ) 是我国一种
古老的植物, 莲子又是罕见的长寿命种子[3 ]。国外有
关莲子方面研究资料较少。国内莲子蛋白质方面研
究有: 莲子贮存蛋白的研究[4 ] , 莲子超氧化物歧化酶
的分析[5 ] , 以及莲子萌发时叶绿体蛋白质复合体的
研究[6 ]等, 而国内外尚未见到有关莲子糖蛋白的研
究。
在前人研究基础之上, 笔者从福建建宁莲子中
分离出糖蛋白, 分别测出其蛋白质和糖的含量。糖蛋
白经进一步分离和纯化之后, 测定它是由分子量分
别为 25 kD 和 9215 kD 的两种糖蛋白组成, 进一步
测定它们的单糖成分和摩尔的比值。药理实验还表
明, 这两种糖蛋白都具有清除自由基的作用。
1　材料和药品
从 红 花 建 莲 (N elum bo nucif era Gaertn.
Fu jian) 品种中, 挑选当年新鲜、饱满的莲子, 含水量
为 1615%。莲子由福建建宁县农业局赠送, 福建师
范大学生物工程学院植物教研室鉴定。
伴刀豆球蛋白 (ConA ) 为 Sigm a 公司产品;
Sepharo se 4B、Sephadex G2150 和牛血清白蛋白
(BSA ) 均为 Pharm acin 公司产品; TL C 硅胶板、标
准系列单糖和鲁米诺 (L um ino l) 均为M erck 公司产
品; 其余试剂均为国产分析纯。
2　方法
2. 1　糖蛋白的粗提
取红花建莲的莲子 100 g, 磨碎后用石油醚脱
脂。 取脱脂莲子粉 50 g, 加入内含 0115 mo löL
N aC l, pH 712 的 01001 mo löL PBS, 置外含有冰块的
搅 切机绞切 5 m in。在 4℃下, 10 000 × g 离心
20 m in。取上清液, 冰浴下加入 60% 硫酸铵饱和溶
液沉淀, 10℃下搅拌 1 h 后, 在 4℃, 1 000 ×g 离心
20 m in , 收集沉淀物经检测为糖蛋白粗品。
2. 2　糖蛋白分离和纯化
取糖蛋白粗品 10 g, 溶于 pH 712, 110 mmo löL
的 PBS 中, 蒸馏水透析 12 h , 4℃离心去除少量不
溶物。将内透析液上已活化的ConA 2Sepharo se 4B
亲和层析柱上 ( 215 cm × 15 cm )。用 pH 715,
0105 mo löL T ris2HC l 缓冲液平衡。然后再用含
215 mmo löL 的 Α2甲基2D 2甘露糖和 0125 mo löL 的Α2D 2葡萄糖的 T ris2HC l 缓冲液分步洗脱, 收集洗脱
液。再取收集液 015 mL 上 Sephadex G2150 凝胶层
析柱 (210 cm ×100 cm ) , 苯酚2硫酸反应检测, 出现
2 个有活性的洗脱峰 (É 和Ê ) , 分别将峰É 和峰Ê
的收集液, 用无离子水透析 18 h 后, 冷冻干燥, 得到
两部分纯化了的莲子糖蛋白: GL P2É 和 GL P2Ê。
2. 3　GL P 的蛋白质和多糖含量测定
蛋白质含量用L ow ry 法测定, 以BSA 为标准
蛋白[7 ]。总糖含量用改良苯酚2硫酸法测定, 以葡萄
糖为参比物。
2. 4　GL P 纯度鉴定及分子量测定
纯度测定采用高效液相层析法 [8 ]。仪器为
H P1100 型高效液相层析仪。色谱柱: Carbohydro te
A nalysis 柱 (312 mm ×6. 5 mm )。流动相: 乙腈÷
H 2O (80÷20)。流速: 2. 0 mL öm in。柱温: 20℃, 检测:
H P1047A 示差折射率检测器。
分子量测定采用粘度法。用鸟氏粘度计分别测
出流出时间, 作图。由公式 [ Γ] = KM ΓΑ, 分别求出
GL P2É 和 GL P2Ê 分子量。
2. 5　GL P 的糖蛋白组分分析和摩尔比测定
2. 5. 1　GL P 完全酸水解　各取 GL P2É 和 GL P2Ê
样品 10 m g, 加入 210 mo löL 硫酸 1 mL 于安瓿中,
封管, 煮沸 4 h 后, 碳酸钡中和, 离心, 上清液浓缩,
供层析用。
2. 5. 2　GL P 薄层层析　采用硅胶板上行层析。丙
酮2水 (96÷4)为展开剂, 邻苯二甲酸苯胺显色。将完
全酸水解后, 各个 GL P 样品与标准单糖进行对照。
2. 5. 3　GL P 气相层析　将各个 GL P 水解物干燥
后, 按文献[ 9 ]的方法制成相应的糖腈乙酸酯的衍生
物, 进行气相层析。仪器为 GCH F1813 型气相色谱
仪, 氢火焰离子化检测器。分离柱: 内径 3 mm , 长
2 m 的玻璃柱, 固定液: 3% ECN SS2M。担体: Ch ro2
mo so rb W AW DM CS (80～ 100 目)。载气: N 2, 流
速: 20 mL öm in。柱温: 205℃检测器温度: 250℃。
2. 5. 4　GL P 气相层析中单糖摩尔比测定　以肌醇
六乙酸酯为内标, 测定各单糖的定量校正因子。再对
比测定 GL P 各个酸水解物中单糖的摩尔比。
2. 6　GL P 红外光谱分析
仪器为N iCo let2550 型红外光谱仪。KB r 压片。
2. 7　GL P 清除自由基作用的测定
按文献 [ 10 ]的方法, 采用 Pyrogallo l2L um ino l
发光体系。在弱碱性条件下, 邻苯三酚自氧化体系产
生O 2
Η
自由基。用各个 GL P 测定清除O 2
Η
的能力。
按文献 [ 11 ] 的方法, 采用 Feu ton 反应。在
V itC2Cu2+ 2yeast 悬 浮 液2H 2O 2 发 光 体 系 中 产
生·OH自由基。用各个GL P 测定清除·OH 的能力。
671 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
按文献[ 12 ]的方法, 略加改进。采用·OH 2L u2
m ino l2H 2O 2 发光体系产生 H 2O 2, 用各个 GL P 测定
清除H 2O 2 的能力。
测定仪器为 SH G21 型生物化学发光测量仪 (上
海标准局实验工厂产品 )。空白对照: pH 712,
50 mmo löL PBS, 采用下式计算自由基清除率。
清除率 (% ) = 空白发光强度- 样品发光强度空白发光强度 ×100%
3　结果与分析
3. 1　GL P 葡聚糖凝胶过滤层析结果
凝胶层析柱经洗脱后, 出现两个糖蛋白活性峰:
峰É 和峰Ê (图 1)。图 1 中表明, 具有活性的莲子糖
蛋白 (GL P)是由 GL P2É 和 GL P2Ê 两部分组成。其
　
　
　
　
层析柱 (co lum n) : 2. 0 cm ×100 cm
洗脱剂 (elu ten t) : pH 7. 2, 50 mmo löL PBS
流速 (flow rate) : 30 mL öm in
图 1　莲子糖蛋白的 Sephadex G-150 凝胶层析曲线
F ig11　Ch rom atography graph of Sephadex G2150 gel
filt ra t ion of GL P from seed of N elum bo nucif era Gaertn.
中 GL P2Ê 为其主要成分。
3. 2　GL P 的蛋白质和糖含量测定结果
测定结果表明, GL P 中蛋白质含量占 5818% ,
总糖含量占 3614% , 蛋白质量大于糖含量。
3. 3　高效液相层析和分子量测定结果
高效液相层析结果表明, GL P2É 和 GL P2Ê 均
出现对称的单一峰。粘度法测定分子量结果,
GL P2É 的分子量为 25 kD; GL P2Ê 的分子量为
9215 kD。这个与 SD S2PA GE 结果相一致。
3. 4　GL P 薄层层析和气相层析结果
GL P 酸水解物的薄层层析和气相层析结果表
明, GL P2É 是由L 2鼠李糖、D 2木糖、D 2甘露糖和
D 2葡萄糖组成, 其中性糖摩尔比为1108÷ 0192÷ 2154÷ 4115。GL P2Ê 是由L 2鼠李糖、D 2木糖、D 2甘露糖、
L 2阿拉伯糖、D 2半乳糖、D 2葡萄糖和D 2葡萄糖醛酸
组成, 其中性糖摩尔比为1125 ÷ 1103÷ 2185÷ 0191÷
3116÷4165。
3. 5　GL P 红外光谱分析结果
各个 GL P 的红外光谱分析结果见图 2。
图 2 表明, GL P2É 和 GL P2Ê 都是典型的多糖
红外吸收光谱。其中, GL P2É 在 3 410 cm - 1 (Χ2OH )、
3 000 cm - 1 (ΧC2H )、600 cm - 1 (Χ2COOH ) 和 1 250 cm - 1
(∆C2H )有特征吸收峰。L GP2Ê 在 3 450 cm - 1 (Χ2OH )、
3 400 cm - 1 ( Χ2OH )、2 983 cm - 1 (ΧC2H )、1 720 cm - 1
( Χ2COOH )、1 424 cm - 1 ( ΧC2O )、1 250 cm - 1 ( ∆C2H ) 和
875 cm - 1处有特征吸收峰。特别是在 875 cm - 1有吸
收。这说明在 GL P2Ê 中有 Β2糖苷键存在形式。
　
　
图 2　莲子糖蛋白的红外光谱
F ig12　 IR spectra of GL P from seed of N elum bo nucif era Gaertn.
　
　
　
　
771　第 2 期　　　　　　　　　　　　高居易等: 建宁莲子糖蛋白的分离、纯化及清除自由基作用
3. 6　GL P 清除自由基作用结果
GL P 清除自由基作用的测定结果见表 1。
表 1 说明, GL P2É 和 GL P2Ê 均有清除自由基
的作用。GL P2Ê 清除能力要大于 GL P2É。因此,
GL P2Ê 是莲子糖蛋白中最具有活力的部分。
表 1　莲子糖蛋白清除自由基的作用 (均值±S. D , n= 9)
T ab le 1　Scavenging effects of free radicals by GL P from
seed of N elum bo nucif era Gaertn. (M eans±S. D , n= 9)
糖蛋白
Glycop ro tein
(GL P)
自由基清除率 (% )
Scavenging rate of free radical
O 2
Η
体系
O 2
Η
System
　·OH体系　
·OH system
H 2O 2 体系
H 2O 2 system
GL P2É 45. 9±0. 43 14. 03±0. 56 9. 8 ±0. 7
GL P2Ê 87. 81±0. 75 56. 77±0. 32 56. 75±0. 45
　　N o te: P < 0. 01.
4　讨论
(1) 糖蛋白是生物细胞的重要组成部分。它在
植物代谢中起着一种独特的作用。糖蛋白在植物的
原生质中可以自由移动, 并可以穿越细胞膜。因此,
人们推测糖蛋白与细胞膜的功能有密切相关。再者,
植物体代谢中一些重要的酶类, 受体以及受体中间
体本身就是糖蛋白。糖蛋白也是细胞膜的重要组成
部分。所以, 植物体糖蛋白的研究越来越被人们所重
视。
(2) 植物体是与人们生活密切相关的。它不仅
提供人体所需要的丰富营养物质。而且在治病、防癌
和抗衰老上有着不可估量的作用。天然植物体内存
在有多种抗氧化的物质。这些物质正被人们所研究
和开发。现已确认: 植物体内的抗氧化蛋白和抗氧化
酶在抗衰老上起着很大的作用, 同时也发现植物一
些多糖具有抗氧化的功能, 但在糖蛋白方面研究甚
少。笔者对莲子糖蛋白及其功能进行了研究和探讨,
证实了它们具有清除自由基的作用。
(3) 莲子糖蛋白是分子量较大, 糖基较多的一
类复杂的糖蛋白。要更深一步地研究这些糖蛋白的
结构和功能, 诸如研究糖基的空间结构, 糖与糖之间
连接方式以及糖与蛋白质的连接方式, 氨基酸排列
的顺序和蛋白质的高级结构等, 还需要借助于核磁
共振, 气2质联谱和氨基酸分析仪等现代技术进行全
面探讨。国内唐佩华等人也曾对莲子贮存蛋白进行
了全面研究。莲子蛋白质和糖蛋白研究工作还有待
于进一步深入。
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