全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (6) : 483～ 488
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
Cr6+ 污染对水鳖的超微结构及菱、
莼菜、黑藻细胞膜的影响Ξ
杨顶田1　施国新2　陈伟民1
(1. 中国科学院南京地理与湖泊研究所, 南京　210008; 2. 南京师范大学生命科学学院, 南京　210097)
摘　要: C r6+ 污染对水鳖超微结构的影响主要表现在: 胞间连丝呈现不同程度的断裂; 细胞
核出现各种各样的变形; 叶绿体膨胀, 其基粒解体。细胞损伤程度与 C r6+ 培养浓度呈正相关。
C r6+ 对水鳖、菱、莼菜和黑藻这几种水生高等植物的细胞膜影响主要表现在: 质壁发生分离,
质壁之间有黑色颗粒存在。在做生理验证时发现处理组的膜脂过氧化产物丙二醛 (M DA ) 和
超氧阴离子 (O
Η
2 )均高于对照。
关键词: C r6+ 污染; 细胞膜; 黑色颗粒; 胞间连丝; 核变形
中图分类号: Q 949. 762. 4; X503. 23 文献标识码: A 文章编号: 10002470X (2001) 0620483206
The Effects of Cr6+ ’s Pollution on the Ultrastructure of
Hyd rocha r is dubia and Cell M em brane of
H. ver ticilla ta , B rasen ia sch reber i, T rap a bisp inosa
YAN G D ing2T ian1, SH I Guo2X in2, CH EN W ei2M in1
(1. Institu te of N anj ing Geology and L um inology , T he Ch inese A cad emy of S ciences, N an jing　210008, Ch ina;
2. B iolog ica l D ep artm en t, N anj ing N orm a l U n iversity , N an jing　210097, Ch ina)
Abstract: T he effects of C r6+ ’s po llu t ion on the u lt rast ructu re of H y d rocha ris
d ubia m ain ly show ed: p lasmodesm ata fractu red, nuclei defo rm ed in differen t
w ays, ch lo rop last en larged, granum diso rgan ized. R ela t ion sh ip betw een the le2
vel of in ju red cell and cu ltu ra l concen tra t ion w as po sit ive. O n the H y d rocha ris
d ubia , H . verticilla ta , B rasen ia sch reberi, T rap a bisp inosa w as p lasmo lysis and
b lack gra in s em erged betw een cell w all and cell m em b rane; physio logica l test
show ed: con ten ts of M DA and O
Η
2 w ere h igher than that of con tro l class.
Key words: C r6+ ’s po llu t ion; Cell m em b rane; B lack gra in; P lasmodesm ata;
N uclei defo rm ed
C r6+ 是环境中常见的污染物, 对植物具有毒害作用, 植物受其污染时间越长, 伤害越
重, 最后可导致植物枯萎。近年来国内外有关重金属污染对植物毒害的研究主要集中在生Ξ 收稿日期: 2001204211, 修回日期: 2001208214。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39770046) , 江苏省自然科学基金资助项目 (BK97107)。
　作者简介: 杨项田 (1969- ) , 男, 博士生, 从事水体污染及其物理生态净化研究。
理生化的伤害反应[1 4 ] , 国内对受害水生植物细胞的超微结构变化报道较少[5 8 ]。目前环
境检测中尚无用较为直观的超微结构作为对C r6+ 污染评价的指标。笔者用水鳖作为研究
对象, 试图通过不同梯度浓度的C r6+ 污染水对水鳖进行培养, 查明C r6+ 对水鳖超微结构
伤害的规律性, 实践中为筛选对C r6+ 灵敏的指示植物提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
水鳖 (H y d rocha ris d ubia B l. Backer) 采集于南京江东门外池塘, 1998年10月7日采集
后用纯水培养2 d, 分别加入4 m göL、8 m göL、16 m göL、32 m göL 的K2C r2O 7 (按纯C r6+ 计)
和1组对照 (室温在25℃左右) , 第3 d开始取茎尖和根尖观察并测定M DA 和O
Η
2 的含量。
黑藻 (H . verticilla ta (L. F )L. C. R ich) , 1995 年采集于江苏省苏州市吴县东山镇太湖
水域, 移植于南京师范大学水生植物培育池中生长繁殖, 1998 年 9 月下旬选取生长旺盛
的植株先在无底泥的玻璃缸中培养 2 d, 然后加入 5 m göL 的 K 2C r2O 7 (按纯C r6+ 计) 和 1
个对照 (室温在 20～ 24℃左右) , 第 3 d 开始取幼叶观察并测定M DA 和O
Η
2 的含量。
莼菜 (B rasen ia sch reberi Gm el) , 1998 年 11 月 18 日采集于江苏省苏州市吴县东山镇
太湖水域, 采集后用无离子水培养 2 d, 然后加入 40 m göL 的 K 2C r2O 7 (按纯C r6+ 计) 和 1
个对照 (室温在 5～ 15℃左右) , 第 3 d 开始取冬芽观察并测定M DA 和O
Η
2 的含量。
菱 (T rap a bisp inosa Roxb) , 1999 年 5 月 11 日采集于南京师范大学花房, 采集后用无
离子水培养 2 d, 然后加入 32 m göL 的 K 2C r2O 7 (按纯 C r6+ 计) 和 1 个对照 (室温在 16～
25℃左右) , 第 3 d 开始取幼叶观察并测定M DA 和O
Η
2 的含量。
1. 2　方法
1. 2. 1　亚显微观察方法　组织块按以 215% 戊二醛固定, PBS 清洗 3 次并以 2% 的锇酸再
次固定, 丙酮系列脱水, EPON 812 包埋, L KB 超薄切片机切片, 切片经醋酸双氧铀2柠檬
酸铅双重染色后于H itach i6002A 22 型透射电子显微镜下观察。
1. 2. 2　膜脂过氧化产物MDA 的测定　采用H eath 等的硫代巴比妥酸 (TBA ) 比色法[9 ]。
取1 g 鲜重材料, 用 5 mL 65 mmo löL 磷酸缓冲液 (pH 718) 研磨, 用纱布过滤后在
15 000 röm in离心 10 m in。取上清液 011 mL , 后序步骤循M DA 试剂盒指示的顺序进行
(M DA 试剂盒购自南京建成生物工程公司)。每组取样 3 次, 抽提后的每组滤液进行 3 次
测定。数据以去掉最大和最小各 1 次后的平均数据为准。
1. 2. 3　O
Η
2 产生的测定　按照王爱国的方法 [10 ] 并略作改进, 1 g鲜重材料, 用6 mL
65 mmo löL 磷酸缓冲液 (pH 718) 研磨, 经4层纱布过滤, 滤液在15 000 röm in离心10 m in。
取上清液1 mL (约015 m g蛋白) 加入磷酸缓冲液 019 mL 和10 mmo löL 羟胺氧化物
011 mL , 在25℃混合并培养20 m in。取015 mL 培养液依次加入17 mmo löL 对氨基苯磺酸
015mL 和7 mmo löL Α2萘胺015 mL , 在25℃反应20 m in, 反应后的显色液用同体积正丁醇
充分摇匀, 静置分层, 取正丁醇相测A 530, 用磷酸缓冲液代替样品作空白。测定次数同上。
2　观察和测量结果
2. 1　质膜的变化
水鳖茎尖细胞的质膜紧贴细胞壁, 壁层中普遍存在胞间连丝, 胞间连丝在正常细胞之
484 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　
间起到物质运输、信息联络的作用。在 4 m göL C r6+ 溶液中处理的水鳖茎尖细胞中, 可观
察到质膜轻微地脱离细胞壁, 质壁之间胞间连丝断裂的细胞数较少, 不到 1% ; 8 m göL
C r6+ 溶液中处理的已有较为明显的质壁分离, 细胞膜多处与细胞壁分离, 但胞间连丝被拉
断的细胞数目依然较低, 大约在 215% 左右。在 16 m göL 的C r6+ 溶液中处理的细胞的细
胞膜与细胞壁的分离幅度较大, 胞间连丝被拉断的细胞数大约在 20% 左右。在 32 m göL
C r6+ 溶液中处理的水鳖茎尖细胞中, 胞间连丝拉断的细胞数 (图版É: 2) 大约在 30% 左右
(在质壁分离处可见的胞间连丝被拉断的受损细胞数与培养浓度的关系如图 1) , 有的质
膜出现破裂, 并在质壁之间有黑色颗粒 (图版É: 1; 图 2)。
C r6+ 培养浓度 (m göL )
C r6+ concen tration
图 1　胞间连丝拉断的茎尖细胞百分比
与Cr6+ 培养浓度的关系
F ig. 1　Relationsh ip betw een percen tage of
top stem cells w ith fractu red p lasmodesm ata
and concen tration of C r6+
C r6+ 培养浓度 (m göL )
C r6+ concen tration
图 2　质壁之间含黑色颗粒的细胞百分比
与Cr6+ 培养浓度的关系
F ig. 2　Relationsh ip betw een percen tage of
cells w ith b lack grains and
concen tration of C r6+
2. 2　叶绿体的变化
叶绿体是茎尖和根尖细胞中最明显的细胞器, 一般在根细胞的切面上有 3～ 5 个叶绿
体, 在茎尖细胞的切面上有 5～ 8 个叶绿体。根中含有叶绿体是水生植物特有的现象, 水鳖
根中叶绿体为长椭圆形, 基粒类囊体垛叠整齐而致密, 基质类囊体片层排列整齐。经
4 m göL 的C r6+ 溶液处理的根细胞中, 有些叶绿体的类囊体出现一定程度的膨胀松散, 大
约为总数的 2%～ 3% ; 在 32 m göL C r6+ 溶液中处理的根细胞中, 叶绿体 (图版É: 5) 膨胀
成近圆形, 基粒和基质类囊体片层拧成麻花状, 损伤叶绿体数超过 90% 以上。在4 m göL
C r6+ 溶液中处理的水鳖茎尖细胞叶绿体出现程度较轻的损伤, 用 8、16 m göL C r6+ 溶液处
理过的水鳖茎尖细胞叶绿体已出现基粒类囊体膨胀, 基粒间类囊体扭曲。经 32 m göL
C r6+ 溶液处理后的茎尖细胞中的叶绿体 (图版É: 6) 中可见基粒解体, 类囊体数目减少, 类
囊体片层呈不规则排列, 并有淀粉粒存在, 片层出现明显膨胀, 也可见基质类囊体片层断
裂, 基粒类囊体松散膨胀的现象。根、叶叶绿体破坏百分比与培养浓度的关系如图 3。
2. 3　细胞核的变化
在 4 m göL C r6+ 溶液中处理的水鳖茎尖细胞的细胞核 (图版É: 3)的核仁边缘模糊, 在
核膜内侧边缘上附着有多个小块的核仁碎片, 这是核仁受毒害在逐渐消解的过程中核的
形状已发生改变。在 8、16 m göL C r6+ 溶液中处理的水鳖茎尖细胞核形已经出现较大变
形。在 32 m göL C r6+ 溶液中处理的核形变化较大 (图版É: 4) , 呈钳形、H 形、不规则长椭圆
584　第 6 期　　　　　 　 　杨顶田等: C r6+ 污染对水鳖的超微结构及菱、莼菜、黑藻细胞膜的影响
图 3　根、叶叶绿体受损百分比与Cr6+ 培养浓度的关系
F ig. 3　Relationsh ip betw een percen tage of
in ju red ch lo rop last of roo töleaves
and concen tration of C r6+
图 4　细胞核受损百分比和Cr6+ 培养
浓度的关系
F ig. 4　Relationsh ip betw een percen tage of
cells w ith in ju red nuclei and
concen tration of C r6+
形, 以及各种各样的不规则形状。细胞核的变形百分比与C r6+ 培养浓度的关系如图 4。
2. 4　水鳖的茎尖、黑藻的幼叶、莼菜的冬芽和菱的幼叶的细胞膜观察
通过对水鳖的茎尖、黑藻的幼叶、莼菜的冬芽和菱的幼叶的超微结构观察, 发现细胞
质壁之间出现分离, 质壁之间出现黑色颗粒 (图版É: 1, 图版Ê: 8～ 10)。从图片可以看出,
莼菜冬芽质壁之间的黑色颗粒密度最大, 几乎是连成一片; 水鳖茎尖的细胞质壁之间的黑
色颗粒密度较大, 颗粒的直径也较大, 颗粒与颗粒之间明显; 黑藻幼叶的细胞质壁之间的
黑色颗粒密度也较大; 菱幼叶细胞质壁之间的颗粒较小。
2. 5　MDA 测定结果
M DA 的含量 (OD 530öm g FW )如图5。在水鳖对照组中M DA 的含量是01036, 处理组中
是01041; 黑藻对照组中M DA 的含量是01038, 处理组中是01043; 莼菜冬芽对照中M DA
的含量是01044, 而处理组为01048; 菱对照组中M DA 的含量是01036, 处理组中是01045。
2. 6　O
Η
2 产生量的测定结果
O
Η
2 的含量 (OD 530öm g FW )如图 6。在水鳖对照组中O Η2 的含量是 01693, 处理组中是
图 5　Cr6+ 处理前后水鳖、黑藻、莼菜冬芽、
菱体中的MDA 含量
F ig. 5　M DA conten t in H y d rocharis d ubia,
H . verticilla ta , B rasen ia sch reberi, T rap a
bisp inosa befo re and after treated w ith C r6+
图 6　Cr6+ 处理前后水鳖、黑藻、莼菜冬芽、
菱体中的O
Η
2 含量
F ig. 6　O
Η
2 con ten t in H y d rocharis d ubia,
H . verticilla ta , B rasen ia sch reberi, T rap a bisp inosa
befo re and after treated w ith C r6+
684 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　
01776; 黑藻对照组中O Η2 的含量是 01708, 处理组中是 01786; 莼菜冬芽对照中O Η2 的含量
是 01712, 而处理组为 01801; 菱对照组中O Η2 的含量是 01684, 处理组中是 01781。
3　讨论
受 C r6+ 毒害后, 水鳖茎尖细胞的质壁之间出现黑色颗粒 (图版É: 1) , 在研究C r6+ 对
菱、黑藻和莼菜冬芽的毒害时, 发现细胞质壁之间也出现了黑色颗粒 (图版Ê: 8～ 10) , 而
在H g2+ 、Cd2+ 对水生植物的毒害实验中均未发现这种现象[6, 7 ]。质壁之间出现黑色颗粒是
目前发现细胞在受到C r6+ 毒害时的较为特别的现象, 受C r6+ 毒害后植物体内C r6+ 浓度增
加[11 ]。C r6+ 的氧化还原电势是 1133 V , 如此强的氧化还原电势足以将细胞膜的不饱和脂
肪酸氧化, 在氧化的同时产生O
Η
2 , 通过超氧阴离子的链式作用, 破坏膜结构。由于膜的破
坏, 细胞基质从裂缝中流出, 经C r6+ 的氧化形成颗粒。细胞受毒害时质壁分离现象的出
现, 说明污染后的细胞失水。
已知O
Η
2 能攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化, 形成脂质过氧化物。氧
自由基不但通过多不饱和脂肪酸过氧化引起细胞伤害, 而且还能通过脂质氢过氧化物的
分解产物引起细胞损伤。O
Η
2 含量大幅度增加, 造成代谢紊乱。
O
Η
2 的含量增加导致膜脂过氧化,M DA 含量增加。通过M DA 的含量可以间接知道
细胞的受害程度。作为强氧化剂的C r6+ , 使膜结构上的不饱和脂肪酸氧化而破坏膜结构,
增加膜的通透性[13 ]。C r6+ 渗入细胞可以直接与细胞核内的核酸等大分子物质结合, 抑制
包括A T Pase 在内的多种酶的活性, 还可以直接和核酸结合而改变细胞核的立体结构, 使
细胞核异固缩而改变细胞的正常有丝分裂,DNA 发生凝聚, 染色体发生断裂和畸变[13 ]。
水鳖在受C r6+ 毒害时, 细胞核发生各种各样的变形。有的核仁分解, 分解的核仁碎片
分布在近核膜处。这与前人观察的形成微核或有丝分裂明显不同[12 ]。这种核仁的分解和
核的变形严重地影响到细胞的生理活动。核的异固缩直接影响到细胞分裂, 蛋白质合成停
止。从而造成细胞器结构和功能的缺陷, 细胞核的损伤还导致了代谢途径的改变, 终末溶
酶体增加, 以及由于合成或修复能力不足所出现的主要成分缺失, 直接影响到细胞活动基
础。
受C r6+ 毒害的叶绿体中, 基粒膨胀或消失, 这与施国新[6 ]、彭鸣[14 ]和丁小余[7 ]分别在
研究Cd2+ 对黑藻、玉米和莼菜的毒害时发现的现象相似。受C r6+ 污染的水鳖也为微生物
的侵入创造了条件 (图版Ê: 7) , 从而加深了水鳖的损伤。
这些结构的变化验证了生理方面的变化: 水鳖在受C r6+ 毒害时, 生理方面表现叶绿
素含量下降[4 ] , 在结构方面出现了叶绿体结构的破坏。由于细胞核的损伤导致了细胞中很
多的生理活动不能进行, 受伤的叶绿体无法得到必需的组成物质, 这更加速了叶绿体的解
体, 叶绿素的含量下降与叶绿体的结构破坏是密不可分的。
参考文献:
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图 版 说 明
CW. 细胞壁; N. 细胞核; N u. 核仁; S. 淀粉粒; BG. 黑色颗粒; P. 胞间连丝; T h. 类囊体; G. 基粒; V. 液泡
图 版 É
1. 水鳖茎尖细胞的超微结构, 示受C r6+ 毒害时细胞质壁之间的黑色颗粒 (40×1 000) ; 2. 水鳖茎尖细胞的超微结构, 示
受 C r6+ 毒害时拉断的胞间连丝 (60×1 000) ; 3. 水鳖茎尖细胞的超微结构, 示受C r6+ 毒害时核仁溶解的细胞核 (8×
1 000) ; 4. 水鳖茎尖细胞的超微结构, 示受C r6+ 毒害时变形的细胞核 (10×1 000) ; 5. 水鳖根尖细胞的超微结构, 示受
C r6+ 毒害时的叶绿体 (30×1 000) ; 6. 水鳖茎尖细胞的超微结构, 示受C r6+ 毒害时的叶绿体 (15×1 000)
图 版 Ê
7. 水鳖茎尖细胞的超微结构, 示感染微生物的细胞核; 8. 黑藻幼叶细胞的超微结构, 示受C r6+ 毒害时细胞质壁之间的
黑色颗粒; 9. 莼菜冬芽细胞的超微结构, 示受C r6+ 毒害时细胞质壁之间的黑色颗粒; 10. 菱幼叶细胞的超微结构, 示受
C r6+ 毒害时细胞质壁之间的黑色颗粒
Explanation of pla tes
CW. Cell w all; N. N uclei; N u. N ucleo lus; S. Starch; BG. B lack grain; T h. T hylako id; P. P lasmodesm ata; G.
Granum; V. V acuo le
P late É
1. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing b lack grains betw een cell w all and cell m em brane
w hen po isoned by C r6+ (40×1 000) ; 2. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing fractu red
p lasmodesm ata (60×1 000) ; 3. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing diso rgan izing nucleo2
lu s w hen po isoned by C r6+ (8×1 000) ; 4. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing nuclei de2
fo rm ed w hen po isoned by C r6+ (10×1 000) ; 5. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing po i2
soned p lisade tissue by C r6+ (30×1 000) ; 6. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing po isoned
p lisade tissue by C r6+ (15×1 000)
P late Ê
7. T he u ltrastructu re of H y d rocharis d ubia’s top stem cell, show ing nuclei infected by m icrobe (10×1 000) ; 8. T he u l2
trastructu re of H . erticilla ta young leaves cells, show ing b lack grains betw een cell w all and cell m em brane w hen po i2
soned by C r6+ (40×1 000) ; 9. T he u ltrastructu re of B rasen ia sch reberi w in ter2bud cell, show ing b lack grains betw een
cell w all and cell m em brane w hen po isoned by C r6+ (35×1 000) ; 10. T he u ltrastructu re of T rap a bisp inosa young
leaves cell, show ing b lack grains betw een cell w all and cell m em brane w hen po isoned by C r6+ (40×1 000)
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