全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18( 6) : 455～460
Journal of Wuhan Botanical Research
湖北海棠实生树童区与成年区基因组
DNA的 RAPD研究

张才喜1 陈大明2 李载龙2
( 1 上海交通大学植物科学系　上海　201101)　( 2 浙江大学园艺系　杭州　310029)
提　要　本试验以具无融合生殖特性的 14 年生湖北海棠实生树为试材, 对其童区和成年区
的叶片基因组 DNA 进行 RAPD 分析。结果显示:从 150 个引物中由 P701 从童区叶片基因组
DNA 中扩增出 1 个约 2. 1 kb 的片段,成年区基因组 DNA 中未能扩增出该片段。文中对阶段
转变的机理及基因组 DNA 多态性的原因作了讨论。
关键词　湖北海棠, 阶段转变, 童区成年区, DNA , RAPD
中图分类号: S 661. 4; Q344+ . 4　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X( 2000) 06-0455-06
RAPD ANALYSIS ON GENOMIC DNA OF
ADULT ZONE AND JUVENILE ZONE OF
MALUS HUPENHENSIS SEEDLING
Zhang Caixi1　Chen Dam ing 2　Li Zailong 2
( 1 Dep artment of Plant S cience ,Shanghai J iaotong Univ er si ty　Sh ang hai　201101)
( 2 Dep artment of H ort icul tur e, Zhej iang Univ er si ty　Hangzhou　310029)
Abstract 　 Fourteen-year-old ( mature phase ) apomictic seedlings of cr abapple ( Malus
hup enhensis ) w ere selected as trial mater ials. T he r esults o f RAPD analysis show ed that there
w as a DNA fr agment of about 2. 1 kb amplified by pr imer 701 fr om genomic DNA of leaves in
juvenile zone. It cant be found in t he amplified pr oduct s o f g enomic DNA of leaves in adult
zone of seedling. The under lying mechansims o f phase change and the r easonable explanations
of g enomic DNA polymo rphism w ere discussed.
Key words　Malus hup enhensis, Phase change, Juvenile zone, Adult zone, DNA , RAPD
植物个体发育过程中从童年到成年所经历的质的转变过程通常被称为阶段转变〔1〕。
随着日新月异的研究手段在发育生物学中植物开花研究上的应用〔2, 3〕,有关阶段转变的研
究也逐步深入到分子水平。目前与童年阶段发育调控有关的基因 TP 1、T P2、TP 3已从玉米


收稿日: 1999-11-15,修回日: 2000-02-23。第一作者:男, 1972年 10月生,硕士,讲师,从事园艺专业教学、科研
工作( E-mail: acaizh@ onlin e. sh . cn)。
国家自然科学基金( No. 39770630)和浙江省自然科学基金( No. 396072)资助项目。
突变体中鉴定出来〔4〕。Stephen M oose对玉米幼年表皮分化的研究表明,幼年表皮表现型
( 1～7叶)由两个相似的发育程序共同作用, 它们具有明显的时/空性, Cg 1基因在 1～3叶
中出现, G 15基因则在 3～7叶中,在第3叶交叉〔5〕。英国长春藤童、成年组织生根能力的差
异则与富含脯氨酸的糖蛋白基因( HW103 )是否表达有关〔6〕。从转录水平的研究发现, 英国
长春藤某些基因序列在成年茎尖中转录成 RNA, 而在童年茎尖中则没有活性〔7〕; 成年组
织中与积累花色素苷能力相关的编码二氢黄酮醇还原酶( DFR)基因转录受阻遏, 无 DFR
mRNA 积累,而童年组织中则相反〔8〕。Huang L C 报道北美红杉凡幼苗及返童的嫩梢
mtDNA 经限制性内切酶( BamHI)酶切后分别具有 3. 6 kb、4. 0 kb 片段,而成年嫩梢则没
有,由mtDNA 合成的蛋白质成年与童年也有区别〔9〕。对翻译水平的研究也发现了同样的
差异〔10～12〕,利用 mRNA 体外翻译技术发现欧洲甜樱桃童、成年茎中的蛋白质组分差异,
mRNA 转录存在质和数量上的差异〔13〕。
分子生物学研究表明发育过程中染色体结构上基因的缺失,扩增放大,重排, 封闭,修
饰(如甲基化等)及可移动遗传因子(如插入顺序 IS,转座子,逆转座子, 酵母中的 T Y 1 ,果
蝇中的 Copia 因子等)的漂移、跳跃均可以导致 DNA 结构的变化, 从而引起基因的差异
表达〔14〕。有时植物基因组在生物和非生物因素的胁迫诱导下, 核DNA结构和组成上发生
变化,以适应环境的变化〔13〕。欧菱由于水中叶及浮水叶所处环境条件不同,而造成叶形态
结构的差异。Bitont i用 RAPD方法发现水中叶和浮水叶的基因组 DNA 存在多态性, 核
苷酸发生了重排〔15〕。这个研究结果打破了人们认为 DNA 在同一生物体中是一致的传统
观点,为发育生物学的研究开辟了新的道路。
众所周知,阶段转变的一个重要特征是童、成年期外部表现具有相对的稳定性。童、成
年植株在常规的无性繁殖方式下通常保持其童、成年特征,分别将童区和成年区的枝条进
行嫁接,排除外界环境影响,发现其形态性状、生理指标、同工酶谱等仍保持了各自童、成
年特征〔16〕。尤其是 Huang L C〔9〕和 Bitont i〔15〕的研究结果, 使我们认识到童、成年基因组
DNA 存在差异的可能性。本试验通过 RAPD技术来寻求基因组 DNA 结构上的差异,以
期为阶段转变提供分子水平上的证据。
1　材料与方法
1. 1　材料
以浙江省杭州市种猪实验场 14年生湖北海棠实生树为试材。1996年 3月 21日取湖
北海棠实生树基部(根颈处)及上部(成花部位以上)幼嫩叶片各 20片, 随即放入冰壶, 带
回实验室, 1996年 4月 4日,取同龄不同单株( 3株)作重复。
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA 提取、纯化及检测
取 2 g 左右新鲜嫩叶,洗净, 加入 5 mL 提取缓冲液( 0. 35 mol/ L 葡萄糖, 2. 3% N, N-
二乙基-二硫代氨基甲酸钠, 2%可溶性吡咯烷酮)研磨至细匀, 转移至 Eppendof f 管中,
10 000 r / min离心10 m in, 去上清液,重复2次, 沉淀加入10 mL裂解缓冲液( 100 mmol/ L
Tr is-Cl pH8. 0, 20 mmol/ L EDT A, 50 mmol/ L NaCl, 1. 5% SDS) , 颠倒混匀, 65℃水浴
中保温 30 m in 至 1 h,轻轻摇动混匀, 10 000 r / min离心 5 min, 取上清液,加入等体积氯
456 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
仿∶戊醇∶乙醇溶液,静置 10 m in, 10 000 r/ m in离心 10 min,取上清液移入新管,加入等
体积异丙醇,颠倒混匀, 静置 10 m in, 用玻璃钩捞出 DNA 沉淀,以 70%酒精浸洗, 吸干水
分,溶解在 1×TE Eppendof f 管中, 加入2 mL 酚∶氯仿溶液, 摇匀, 10 000 r/ m in 离心
5 min,取上清液, 加入 1/ 10体积 3 mo l pH 5. 2 NaAC, 2×体积冷的无水乙醇, - 20℃放
置过夜,沉淀用玻璃钩捞出,溶于 T E溶液中, - 20℃保存。DNA 采用 Sepharo se-2B柱层
析纯化。用紫外分光光度计( Shimadzu-Corporat ion UV-2201) 检测DNA 含量和纯度。
1. 2. 2　PCR反应
表 1　部分随机引物核苷酸序列
Table 1　Nucleo tide sequence o f a part o f r andom pr imer s
编号
No.
引物
Pr imer
编号
No.
引物
Primer
701 5 CCC ACA ACCC 3 625 5 CCG CT G GAGC 3
713 5 CCC T CC CTCT 3 630 5 CAC T CT CT GG 3
731 5 CCC ACA CCAC 3 631 5 GGC T T A ACCG 3
738 5 GGT GGG T GGT 3 637 5 CCC T AA AGCG 3
608 5 GAG CCC GAAA 3 639 5 AT C GAG CACC 3
10×PCR缓冲液( 25 mmol/ L ) ,
M gCl2 ( 100 mmol / L ) dNT Ps
( dATP, dGT P, dCT P, dTT P ) 和
Taq 聚合酶均购自 promega 公司,
10 聚 体 引 物 ( 见 表 1 ) 购 自
University of Br it ish Columbia
( U . B. C) , Canada。反应参数为:预
变性3 min,变性( 94℃) 45 s, 退火
( 36℃) 60 s, 72℃延伸 70 s,循环次数为 45轮,最后保温 10 min。本实验采用 25
L 反应
体系, 按以下体积和终浓度计算, 顺序加入各试剂: ddH2O 16. 5
L, 10×PCR 缓冲液
2. 5
L ( l50 mmol / L KCl, T ris-Cl pH8. 3) , M gCl2 2. 0
L ( 2 mmo l/ L ) , DNT Ps 2. 0
L
( 200
mol/ L ) , Taq DNA 多聚酶 1 Unit , DNA 模板 1. 0
L ( 50 ng /管) , 引物 1. 0
L
( 0. 2～0. 3
mol/ L )。所需总体积按每次做引物的数量×2×23. 5
L 倍计算, 将除样品
DNA 和引物之外的各组分依次加入, 涡旋混合,短暂离心即分装, 23
L/管,再依次加入
童区及成年区叶片 DNA 和引物, 最后滴加 1滴石蜡油,瞬时离心后在国产 1109( 2A)型
基因扩增上进行 PCR反应,所有操作均在冰浴上进行。PCR 反应结束后在 0. 5×T BE 电
泳缓冲液中含 5
L EB/ 100 mL 的 1. 2% Agaro se 凝胶上点样。先用 110 V 电泳 3～
5 min,待样品进入凝胶后,稳压至 80 V,电泳 2～4 h。当溴酚蓝指标剂离前沿 2 cm 左右
时停止电泳, 将凝胶置于紫外透射分析仪上观察结果,照相,随即冲洗分析。
2　结果与分析
2. 1　湖北海棠 DNA提取方法
采用水稻法提取的湖北海棠 DNA 颜色较深,不能进行 PCR反应,其主要原因是叶
片内富含酚类和多糖类物质, DNA 与酚类物质前体在活的细胞中被隔离,但在叶片研磨
过程中, 酚类物质、色素、多糖因细胞破裂而氧化, 不可避免地要与 DNA 和蛋白质相结
合,使得 DNA 溶液颜色变深, 酚∶氯仿多次抽提后仍不能消除, 色素等物质与 DNA 结合
紧密, PCR反应困难。笔者采用先去杂质后裂解的方法, 将细胞内杂质成分包括酚类物
质、多糖、色素等在细胞核裂解之前先分离掉, -巯基乙醇与溶液中的氧结合, 防止了单宁
和其他次生物质的氧化。提取的DNA 经酚∶氯仿抽提去掉蛋白质后,又经Sepharose-2B
去除多余的多糖、酚类和蛋白质及 RNA。提取的DNA OD260 / OD280= 1. 7～2. 0(见图 1) ,
0. 7% Agarose 凝胶检测, 分子量在 30 kb 左右, 说明该 DNA 未降解, 质量较好, 适于
457　第 6期　　　　　　　张才喜等:湖北海棠实生树童区与成年区基因组DNA 的 RAPD 研究
RAPD分析。
2. 2　童区与成年区叶片基因组 DNA的 RAPD分析结果
从近150个引物中筛选到608、625、701、713、731、738等引物所扩增的PCR产物在童区
图 1　湖北海棠叶片基因组 DNA浓度扫描图
(图中显示出在 260 nm处有一个吸收高峰)
Fig. 1　The scannin g diagram of genom ic DNA concent rat ion of
crabapp le leaf ( T her e is a absorpt ion high peak at 260 nm)
和成年区之间存在多
态性, 除此之外, 绝大
多数引物不能在童区
和成年区之间揭示出
多态性。但是,经不同
单株不同时间的10次
重复试验表明,仅引物
701所揭示的多态性得
以重复。引物701在童
区叶片基因组DNA上
扩 增 出 了 一 个 约
2. 1 kb的片段, 该片段
在成年区中未能出现(见图2) ,初步揭示了童区与成年区叶片基因组DNA呈现多态性。
3　讨论
3. 1　基因组 DNA多态性与阶段转变机理
目前,关于阶段转变的机理有激素、养分分配和成花素等多种假说及模型〔17〕, 但植物
Marker( M ) —— DNA/ Hind Ⅲ
1-P701; 2-P713; 3-P738; 4-P608
图 2　湖北海棠童区和成年区叶片基因组
DNA PCR产物电泳图谱
Fig. 2　RAPD-pat tern am plif ied by ar bit ry
primer f rom leaf g enomic DNA of juven ile
zone ( J) and adul t zone (A )
由营养生长向生殖生长的转变过程的本质仍
不清楚。Murry〔8〕、Sanchez〔6〕、Hutchison〔10〕、
Woo
〔11〕和 Besford〔12〕的研究表明了不同发育
阶段的 DNA 存在转录、翻译水平上的差异。
对蛋白质、核酸、同工酶的研究也表明了阶段
转 变的发生同 DNA 翻译水平密 切相
关〔10, 16〕。但至今还少有有关阶段转变过程中
产生这种差异表达真正原因的报道。经典遗
传学认为同一生物体的遗传物质( DNA )不
存在组织特异性,而 Huang L C〔9〕报道北美
红杉童、成年组织 mtDNA 的酶切片段存在
差异。随后, Bitonti〔15〕在排除质体 DNA 和
(或) mtDNA影响后发现欧菱水中叶和浮水
叶基因组 DNA 存在多态性。他认为基因组
DNA 发生的核苷酸重排是欧菱为适应不同
的环境而造成的结果。反过来,则导致了叶形
态结构的不同。通过 RAPD分析, 我们也扩
增到了童区特有的DNA 片段,说明童区和成年区叶片基因组 DNA 存在多态性。实际上,
458 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
从童年向成年阶段的转变不可能包含基因组 DNA 的永久变化, 由于在成年阶段将产生
种子,反过来形成实生苗,带有童年特征。那么, 是否有可能在童年—成年—种子(童年)的
形成过程中基因组 DNA 有一套可以循环的变化机制来适应童、成年的转变呢? Bassi〔18〕
和 Nagl〔19〕报道了染色质结构及组成具有可逆的变化。在这种可逆变化过程中,其机制如
何?有人曾提出过植物的阶段转变受到核基因组和线粒体基因组共同控制的假设。那么,
Huang L C〔9〕在 mtDNA 上的发现是否就是一个有力的佐证呢? 这些尚需进一步探索。
3. 2　基因组 DNA多态性的根源
有迹象表明, 基因组 DNA 水平的变化可能对阶段转变具调节作用〔19, 20〕。那么,植物
体是如何在 DNA 水平进行调节的呢? 对核酸含量的研究表明有可能发生了基因的扩增
放大〔15, 21〕,而一般情况下被放大的基因有以下几种存在状态: ( 1)完全脱离原来所在染色
体,或者变成细胞中一个自由存在的成分, 如肿瘤基因转座, 爪蟾卵母细胞中 rRNA 基
因,自己以滚筒方式复制,然后转录出 rRNA。( 2)整合入染色体, 在染色体上放大了的基
因成簇存在。( 3)形成部分的多线染色体。这几种染色体结构变化大多都发生了核苷酸序
列的改变。而有关DNA 甲基化的调节假设似乎越来越为人们所接受。它在调控基因的表
达,参与不活动染色质的形成、影响染色质结构、基因组印痕和导致 DNA 多态性上具有
重要的作用〔22〕。欧菱浮水芽分生组织中每个核 DNA 甲基化水平较水中芽要高, Bitonti
认为 DNA 可能发生了超复制或者特殊异染色质部分的超甲基化,如富含 G PC 序列的高
度甲基化〔15〕。Ono. T 〔23〕和 Poethig〔4〕认为 DNA 甲基化的改变调节DNA 的转录。基因的
脱甲基化程度越低,翻译水平越高,反之则越低。而另一方面, 重复序列的甲基化可以导致
不同发育程序(基因)的表达〔24〕。采用CRED-RA 方法〔22〕发现湖北海棠的童区和成年区叶
片 DNA 的甲基化和脱甲基化具有明显差异, 为本试验提供了可能的证据,是否甲基化导
致基因组结构改变仍需进一步研究〔25〕。
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