全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(3)：187～192
Journal of Wuhan Botanical Research
水稻蛋白激酶基因Ptil的克隆与分析
时振英，祝莉莉，何光存
(武汉大学生命科学学院植物发育生物学教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：植物 Pti1基因编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是重要的抗病相关基因 在水稻抗褐飞虱基因 Q j所在的
染色体区段存在一个与番茄 Ptij基因高度同源的序列片段。从抗虫水稻 B5中分离了 Ptil基因的全长 cDNA克
隆，测定了基因组序列。分析发现，水稻中 Pti1基因长度有 5 644 bp，含有 7个内含子，编码 368个氨基酸的激酶蛋
白。其蛋白质的C末端在不同植物之间具有高度的保守性 ，而 N末端的变异则相对较大。对不同水稻材料 Ptij基
因的序列进行了比较 ，发现药用野生稻与栽培稻之间存在较大的差异，而栽培稻各品种之间的差异较小。讨论了
Pti1基因在抗虫防卫反应中可能的作用。
关键词：水稻；Ptij基因；克隆
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—470X(2004)03—0187—06
Cloning and Analysis of the Protein Kinase—enc0ding Gene Ptil in Rice
SHI Zhen—Ying，ZHU Li—Li， HE Guang—Cun。
(Key Laboratory of Ministry of Education for Plant Developmental Biology。Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：Pti 1 gene in plant is an important disease-resistance—related gene，encoding for a ser／
thr protein kinase．In the genomic region of rice where the brown planthopper resistant gene Qbp1
lies，there is a gene with high homology to the Pti 1 gene in tomato．W e isolated the full-length
cDNA of Pti 1 gene from insect—resistant rice B5 and the corresponding genomic fragment．The
Pti 1 gene in rice is 5 644 bp long，containing 7 introns and coding for a protein kinase of 368 aa．
The C end of its protein is highly conservative and N end is relatively variable．The genomic frag—
ments of this gene in several rice species including Oryza officinalis Wall ex Watt were sequenced
and compared，revealing great difference between wild rice and cultivated rice；but the difference
among cultivated rice species is faint．The possible role Pti 1 gene may play in rice resistance a—
gainst brown planthopper was discussed．
Key words：Rice；Pti 1 gene；Homology
植物抗病性及其机制研究是植物抗病育种中的
热点问题。Flor等在研究亚麻锈病时，提出了基因
对基因假说 (gene—for—gene)解释植物抗病机理L1]。
该假说认为植物受到病原物侵染后，植物体内抗病
R基因编码的产物可识别出病原物无毒 Avr基因
所编码的产物，进而激发一系列防卫反应，产生抗
性。在一系列的防卫反应中，蛋白激酶基因通常是重
要的组成部分，通过磷酸化和去磷酸化的反应在植
物和动物的防卫信号传导过程中发挥重要作用。Pto
基因是应用图位克隆的方法从番茄(Lycopersion —
culentum)中克隆到 的抗丁香假 单孢杆菌 (Pseu—
domonas syingae pv．tomato)的基 因，编码一个细胞
内的蛋白激酶[2]。病原物侵染时可能直接激活 Pto
蛋白的激酶活性，并将结合的 Ptil蛋白磷酸化，进
而引发其下游蛋白的一系列磷酸化级联反应，从而
产生抗病性[3,43。Ptil基因编码丝氨酸／苏氨酸蛋白
激酶，是最早被发现的与 Pto基因直接作用的下游
基因之一，可能在 R基因和植物防卫基因之间建立
了直接的联 系，是一个重要 的与抗病相关 的基
因Es,s]。Ptil的同源基因在不同植物中广泛存在，如
收稿 日期；2003—09—22，修回El期；2003一l1—13。
作者简介；时振英(1975一)，女，博士，现主要从事植物分子生物学及生物工程研究。
通讯作者(E—mail：gche@whu．edu．cn)。
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武 衩 植 物 学 研 究 第22卷
拟南芥、大豆等 ] 不同植物的 Pti J基因的比较研
究．对于进一步阐明植物的抗性机制以及开发抗性
资源具有重要的意义
褐飞虱(Nilaparoata lugens Sta1)是为害最严
重的水稻害虫之 。我们通过对药用野生稻(0．of-
ficinalis Wal ex Watt)转育而成的褐飞虱抗性材料
B5的遗传分析，发现了第三染色体RFLP分子标记
Rl 925～G131 8之间有一个抗竭飞虱主教基因H。]。
为了分离浚基因．我们构建了该医段的精细图谱和
物理图谱 ．发现存在一个 Pti1基因
为r研究水稻中Ptij基因的功能．我们从抗虫
水稻品利r B5巾克隆 r Pti1基因．井就 PtiI基因结
构抑Pt【1蛋白在不同水稻品种和不同植物之问进
行了比较_f1】分析
1 材料和方法
l-1 材料
供试材料有蓟用野生稻、栽培稻嘲恢 63、H1493
和 B5 H1493为粳稻，明恢 63和B5为籼稻 B5为
药用野生稻与栽培稻杂交后代的渗入系，对描飞虱、
自背飞虱、白叶枯病、细菌条纹病等多种病虫害具有
抗性 。 。
水稻材料 B5的全长cDNA的噬菌体文库为本
实验室资源
1．2 Ptil全长 eDNA克隆的分离
eDNA克隆的筛选：通过分析番茄巾 Pti1蛋白
质序列与水稻中的相应碱基序列，设计了一对引物。
P1为 ATGCTCGAGGTCTCGAATTCTCTCGT—
cGc和 P2为 ATGT(：TAGAG|rCTCGAATTCT
CTCGTCGC，从水稻基因组中扩增 出 230 bp的
—· ●
PCR产物 扩增条件为：94 C 4 rain+t94C 45 s，
58C 45 s，72C 45 s)30 cycles，72 C 10 rnin，测序
验证 PCR产物的正确性后，作为 B5 cDNA噬苗体
文库筛选的探针。噬菌体文库筛选的方法按照分子
克隆实验指南 ·
1．3 Ptil基因组序列的分析
利用国际水稻基固组计划巾Nipponbare的测
序结果，在 Pti1对应的基因组序列上设计相互衔接
的 5对引物覆盖整个 Ptij基 组序列，利用这 5对
引物分别在明恢 63、H1493、B5和药用野生稻的总
DNA巾扩增出PtiJ的整个基因组序列 一般扩增
条_f{=为：9{C 4 rain．(94‘C 4 5 s．58℃ 45 S，72 C
1 min)30 cycles．7Z℃ 10 min。PCR产物分别克隆
到 TA载体(Promega公司)后测序
1．4 DNA序列测序与分析
所有序列分析采用标准试剂盒在 ABI377上完
成。序列拼接等分析采用DNAStar软件
2 结果
2．I 抗虫水稻B5中Plil基因的eDNA克隆的获得
经研究分析，抗褐飞虱 Q 基因区域由 2个
Nipponbare BAC克隆和 5个 B5文库克隆覆盖一 ]
通过回交分离世代巾重组单株的分析．进而将0 J
基因定位到 40 kb的区域(时振英，未发表资料)，内
有一个与番茄Ptij基因高度同源的基因。根据Ptil
蛋白质在水稻中对应的碱基序列．没计了引物 P1
和P2．在水稻基因组中扩增出符合预计的 230 bp
的PCR产物，经测序验证后，纯化的 PCR产物直接
作为筛选的探针。利用该探针对水稻B5全长eDNA
的噬苗休文库进行筛选，筛选， 进行了3次(图1)，
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市 点 一救 J 前一 筛选
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图 】 水稻品种B5 eDNA噬菌体文库中Ptil基因的筛选(前头所指的为筛选所获得的
阳性克隆．第三攻筛选获得单个阳性噬菌斑)
Fig 1 Fih rafion of the B5 eDNA ib rary tO get the Pti1 gene cDNA clone．Positive
clones ol each time 3~,~2re indicated by arrowhead (Positive c]ones were indicated by
arrowhead．sing[e positive clones were obtained ia the third tinae selection)
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第 3期 时振英等 ：水稻蛋白激酶基因 Pti1的克隆与分析 189
1日ptttaactcgagcaggcaaccaggacgcggaggctgcgccaccgccgccgccgccgctgccgctgccggccacttcctccaccctcccctgagcctgtgcgc
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璺苎昌 曼主主 璺g墨里璺皇皇璺皇主主g曼璺g璺主主主竺皇皇主呈主呈主兰璺皇皇主曼璺璺g呈主呈呈皇墨皇主皇主gg呈璺g堡垒曼g呈呈主主呈皇主主呈璺皇呈主呈g主g主璺主三璺gg璺皇呈曼三主主gg皇主璺主曼璺
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ttttccacagcttcacttcagaggtgtcaaatactccagacatcgtttgaactttcaatagatgcaacatgttctgaatt咽
Ig J为最长的mRNA起始位点；IcI为加poly A的位点；下划线的字母是蛋白质编码序列；
小写字母是外显子序列；大写字母是内含子序列
Igl Indicates the start point of the longest mRNA； Indicates the polyA adding point；Underlined
parts show the protein—coding region and capitalized letters parts indicate the introns
图 2 水稻品种 B5中 PfiJ基因的结构
Fig．2 The structure of Pti j gene in rice B5
一
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19O 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
最终得到独立的单个噬菌斑。对该噬菌斑的分析发
现有 1．7 kb左右的插入，测序表明是 PtiI基因的
全长 eDNA。通过 5对引物的扩增，克隆了 B5中
PtiI基因的基因组序列。图 2显示了品种 B5中
Ptil基因组序列与 eDNA序列的分析结果，表明水
稻中Ptij基因是一个较长的基因，其基因组序列至
少有 5 644 bp，有 7个内含子，编码 368个氨基酸的
激酶蛋白。
2．2 不同水稻品种 Ptil基因序列的比较
同时从水稻品种明恢 63、H1493、B5和药用野
生稻中克隆了 Ptil基因的基因组序列，并与水稻基
因组测序计划所用品种 Nipponbare的序列进行了
比较。发现供试药用野生稻与各栽培稻之间的序列
差异较大，而供试栽培稻品种之间的差异较小。
参照 B5的eDNA序列，比较了 B5和药用野生
稻的基因组序列，发现在 B5中，外显子部位存在 33
个单碱基的突变；内含子部位有较大区段的插入和
缺失，4个碱基以上的缺失有 8段 ，其中最长的缺失
有 215个碱基，4个碱基以上的插入有 3段。这些差
异可能意味着药用野生稻 Ptil蛋白同 B5比较而
言，存在较大的功能改变。
栽培品种间该基因的差异相对较小，无论是在外
显子区还是在内含子区都仅有单个碱基或者少数几
个碱基的突变，分布没有明显的规律。其中，籼稻和粳
稻之间的差异则相对较大，因此在聚类分析时被划归
到不同的类别中。图 3显示了这种比较的结果。
B5和明恢 63为籼稻；H1493和 Nipponbare为粳稻；YAO为药用野生稻
B5 and MH63 are indica；H1493 and NP (Nipponbare)are japonica；YAO represents
wild rice Oryza officinalis Wall ex Watt
图 3 不同水稻材料 Ptil基因的谱系树
Fig．3 Phylogenetic tree of Pti 1 genes of rice
2．3 Ptil基因编码产物在不同种植物中的比较
目前已发现很多植物中存在有相应的 Ptij基
因。本研究对拟南芥、番茄、以及大豆中的Ptij基因
所编码的蛋白质与我们所推测的水稻 B5中的 Ptil
蛋白质序列进行了比较 ，发现该基因在不同植物中
存在较高的同源性(图 4)，而且其保守区位于蛋 白
质的 C末端，而 N末端的变异则相对较大。
3 讨论
目前为止，已经克隆的抗性基因(包括抗病基因
和植物抗逆境的基因)很多属于蛋白激酶基因，或者
含有蛋白激酶的同源结构域[6]。在番茄的丁香假单
孢杆菌抗性防卫体系中，基因 Pto和 Pti1都编码激
酶蛋白，Ptij作为 Pro的一个下游基因，介导信号
的级联放大反应，对病原菌的抗性发挥重要的作
用[5 ]。我们实验室在对第三染色体上抗褐飞虱基因
Q j进行分析时克隆了Pti1基因。结果表明，水稻
中 Ptil基因至少有 5 644 bp，有 7个内含子，编码
368个氨基酸的蛋白。
通过 SBASE数据库(http：∥hydra．iegeb．tri—
este．it／~kristian／SBASE)对水稻的 Ptil蛋白质功
YA0
能结构进行分析，表明该蛋白质主要包含 2个功能
结构域 ：N端的 10～87 aa为胞外功能域(extracel—
lular)，C端的 111～301 aa为腺苷酸鸟苷酸环化酶
催化 功 能域 即激 酶催 化 功 能域 (adenylate and
guanylate cyclase catalytic domain)。对在不同植物
中的Ptil蛋白质序列分析，发现 C端激酶催化功能
域在单子叶与双子叶中都具有高度的保守性 ，表明
激酶催化功能域在长期的进化中变异很小，这也说
明Ptil蛋白质在植物中可能存在重要功能。同时该
蛋白质的N端存在较大的变异性，因此有待于进一
步研究 Ptil蛋白质 C端的保守性和 N端的变异性
与功能的关系。对不同水稻品种 Pti1基因组序列的
比较，显示出药用野生稻和栽培稻之间的差异大于
栽培稻内籼稻和粳稻之间的差异，说明该基因有一
定的进化意义。
在番茄中，Ptij基因编码的蛋白激酶在病虫害
的防卫应答或信号的级联放大反应起重要作用 ，而
在水稻中其功能仍不明了。我们的研究证明了Ptil
基因存在于抗褐飞虱候选区域内，并且在抗虫与感
虫水稻之间，栽培稻与野生稻之间存在结构的差异。
暗示着该基因在不同品种间功能有所不同。我们下
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第3期 时振英等：水稻蛋白激酶基因Ptil的克隆与分析 191
Pti 1一Rice
Pti1一ArabidopsiS
Pti 1一Soybean
Pti 1-Tomato
Pti 1一Rice
Pti 1一ArabidopsiS
Pti 1一Soybean
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Pti 1一Rice (97)KKLDAS—ENEPNDEFLKQVSQASRLKHENLVEMLGYCVEGNYRILAYEFATMGSLHDVLHGRKGVQGAQP
Pti1一ArabidopsiS (141)KKLDNAAEPEsNVEFLTQVsRVsKLKHDNFVELFGYCVEGNFRILAYEFATMGSLHDILHGRKGVQGAQP
Pti 1一Soybean (99)KKLDVSSEPESNNEFLTQVSMVSRLKDDNFVEMHGYCVEGNLRVLAYEFATMGSLHDILHGRKGVQGAQP
Pti 1一Tomato (96)KKLDSS一一KQPDREFLAQVSMVSRLKDENVVELLGYCVDGGFRVLAYEYAPNGSLHDILHGRKGVKGAQP
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Pti 1-Rice
Pti1一Arabidopsis
Pti 1一Soybean
Pti 1-Tomato
Pti 1-Rice
Pti1一ArabidopsiS
Pti 1一Soybean
Pti 1-Tomato
Pti 1-Rice
Pti1一ArabidopsiS
Pti 1一Soybean
Pti 1-Tomato
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281) RVLGTFGYHAPEYAMTGQLTQKSDVYSFGVVLLELLTGRKPVDHTMPRGQQSLVTWATPRLSEDKVKQCV
239) RVLGTFGYHAPEYAMTGQLTQKSDVYSFGVVLLELLTGRKPVDHTMPRGQQSLVTWATPRLSEDKVKQCV
234) RVLGTFGYHAPEYAMTGQLSSKSDVYSFGVVLLELLTGRKPVDHTLPRGQQSLVTWATPRLSEDKVKQCV
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51
09
04
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木 木 木木木木 木木 木木木木木木木木木木 木木木木木木木木木木木木 宰木木
番茄、拟南芥、大豆中的 Ptii基因的蛋白序列号分别为：AAC61805、NP一567082、AA092595；
*表示该位点的氨基酸在 4种植物中是相同的
The accession numbers of Ptil protein in tomato，arabidopsis and soybean are AAC61805，
NP一567082，AA092595 respectively；* indicate the same amino acids in four plants
图 4 Ptil蛋白在拟南芥、水稻(以B5为例)、番茄、大豆中的同源性分析
Fig．4 Analysis of Ptil protein from several plants，including arabidopsis，rice，tomato and soybean
一 步将通过转基因手段展开对水稻 Ptil基因功能
特别是其与水稻抗虫性关系的深入研究。
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