全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(3)：266—269
Journa／D， Wuhan Botanical Research
异硫氰酸胍法快速提取二球悬铃木组织总 RNA的研究
李志能，黄文俊，张佳琪，张俊卫，包满珠，刘国锋
(园艺植物生物学教育部重点实验室，华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070)
摘 要：针对二球悬铃木组织中多酚物质含量较高的特点 ，采用异硫氰酸胍法从二球悬铃木花序和叶片中提取到
质量高、完整性好的总 RNA，28S rRNA的亮度约为 18S rRNA的 2倍 ，通过 RT-PCR克隆到二球悬铃木中与拟南芥
Leafy基因同源的部分编码区。高质量的RNA为 Northern杂交和利用同源序列法克隆二球悬铃木的相关基 因提供
了前提条件。
关键词：二球悬铃木；多酚；异硫氰酸胍法；总 RNA提取
中图分类号：$792．37 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)03-0266．04
Guanidine Thiocyanate Method of Total RNA Isolation in Platanus acerOelia
LI Zhi—Neng，HUANG Wen-Jun，ZHANG Jia—Qi，ZHANG Jun—Wei，BAO Man—Zhu，LIU Guo—Feng’
(Key Laboratory ofHorticultural Plant曰蝴 ，Ministry ofEducation，Colege ofHorticulture and Forestry
scfe 。Huazhong Agric~ University，Wuhan 430070，China)
Abstract：Guanidine Thiocyanate method was used to isolate total RNA from the inflorescence tissue and
leaves of Platanus aceriflia successfuly with regard to high quantity of phenolic compounds in its tissue．
The high—qu ality total RNA was obtained by guan idine thiocyan ate that eliminated the interferences of
polyphenols an d acqu ired the 28S rRNA．which is approximately two times as light as the 1 8S rRNA．The
isolated RNA was of suficient quality for cloning partial cDNA of Leafy gene homologous to Leafy in Ara—
bidopsis thaliana according to RT—PCR．The method described here was the basis of Northern blotting an d
cloning genes from aceriflia according to homologous sequence．
Key words：Platanus aceriflia；Polyphenol；Guanidinium thiocyanate；Total RNA extraction
从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是
进行 Northern杂交、RT—PCR、cDNA文库构建和差别
显示分析等分子生物学研究的关键。现在虽然有一
些较为成熟的总 RNA的分离方法能成功地从不同
植物或不同组织中提取出 RNA，但是从不同的材料
或相同材料不同部位提取 RNA时难点不同，因此需
针对生物材料的具体特点选择适宜的 RNA提取方
法。悬铃木被誉为“行道树之王”⋯ ，是一种乔木类
木本园林植物，其中二球悬铃木是一球悬铃木和三
球悬铃木的杂交种，因其具有冠大荫浓、生长迅速、
耐修剪等优点，在我国长江流域地区成为首选行道
树种，但是其组织和器官中富含多酚和次生代谢物
质，而且 RNase的活性较高，这些因素导致 RNA提
取难度增大，一定程度上限制了育种工作的进行，目
前国内外尚未见有悬铃木 RNA提取成功的报道。
尽管用 Trizol Kit法提取组织 RNA已在很多物种中
有成功报道，但悬铃木 RNA用 Trizol Kit法提取并
不能达到理想的效果。针对悬铃木组织成分复杂的
特点，我们分别用了Trisol Kit法和异硫氰酸胍法提
取二球悬铃木组织 RNA，结果表明异硫氰酸胍法能
成功提取悬铃木花芽和叶片的总 RNA ，并从完整
性、产量、纯度及用于 RT—PCR研究等方面对该方法
进行了评价 ，为文库构建、Northern杂交和利用同源
序列法克隆花发育相关基因提供了前提条件。
1 材料与方法
1．1 材料
二球悬铃木 (Platanus aceriflia)花芽和叶片均
采自华中农业大学校内30～40年树龄的成熟二球
悬铃木，直接采集新鲜花序或叶片置于液氮中备用。
1．2 主要试剂
异硫氰酸胍 bufer：0．75 mol／L柠檬酸钠(pH
7．0)，10％十二烷基肌氨酸，4 moVL异硫氰酸胍，
2％ PVP
收稿13期：2006—11—03，修回日期：2007—01-26。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30500394)；教育部新世纪人才计划(NCET-04-0733)资助项目。
作者简介：李志能(1980一)，男。湖北孝感人。博士研究生，从事植物生物技术与遗传育种研究。
·通讯作者(E—mail：gniu@mail．hzau．edu．on)o
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第 3期 李志能：异硫氰酸胍法快速提取二球悬铃木组织总 RNA的研究
3 讨论
异硫氰酸胍是一种强 RNA酶抑止剂 ，本实
验在传统异硫氰酸胍法基础上，针对二球悬铃木多
酚物质含量很高、研磨之后的材料极易褐化的特点
进行了改进，在异硫氰酸胍缓冲液中加入2％ 可溶
性的 PVP，成功提取 了二球悬铃木花序及叶片的
RNA，RNA纯度及完整性较好，适合其它分子生物
学操作 引。
13．ME可以保护 RNA免受多酚类物质的干
扰[7．8】，但是异硫氰酸胍法在第四步抽提过程中，使
用了酚／氯仿／异戊醇混合液，苯酚直接与植物材料
接触，使植物组织被强氧化，发生褐化效应，13一ME
作为强还原剂能防止多酚氧化，还可以打断多酚氧
化酶的二硫键使之失活，为了防止褐化效应的发生，
我们采用 13一ME来防止酚类物质的氧化。
PVP作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结
合酚的能力，使之不能被氧化成醌类，有效地防止其
与 RNA的结合 J。缓 冲液中同时使用还原剂 13一
ME和螯合剂PVP40，有效地降低了酚类物质的影
响。
RNA沉淀出来后，沉淀用 l mL 70％乙醇洗两
次，有利于避免残留盐类物质及缓冲液影响RNA纯
度，而使得OD：一 偏低。
利用 RT—PCR克隆到的二球悬铃木 Leafy基因
片段与 Michael等在加州悬铃木中报道的 基
因第三个外显子的同源性高达 98％，说明本实验方
法提取的RNA质量较高，完全适合 RT—PCR等分子
生物学操作。
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