全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 3) : 254～258
Journal of Wuhan Botanical Research
柑桔种间体细胞杂种的花粉特性及贮藏研究
刘艳玲1, 2, 夏仁学1
, 李国怀1, 马梦亭1 , 伊华林1
( 1.华中农业大学园艺林学学院, 武汉　430070; 2.中国科学院武汉植物研究所/武汉植物园, 武汉　430074)
摘　要: 对粗柠檬与“哈姆林”甜橙种间体细胞杂种的花粉特性 (形态、花粉量、生活力等)进行了观察、检测, 并于
- 20℃的低温条件下开展了贮藏试验。结果表明: 花粉离体萌发的适宜培养基为 0. 8%琼脂+ 16%蔗糖+ 10 m g/ kg
硼酸,萌发率为 15. 31% ,其生活力介于两亲本之间,可作为杂交亲本进一步被利用。贮藏试验结果显示: 以真空、干
燥( CaCl2或硅胶作干燥剂)贮藏花粉的效果较好。授粉试验证明, 贮藏花粉与新鲜花粉的座果率差异不显著 ,说明
低温、真空和干燥是贮藏粗柠檬与“哈姆林”甜橙种间体细胞杂种花粉的较适条件。
关键词: 柑桔; 种间体细胞杂种; 花粉特性; 花粉贮藏
　　中图分类号: Q945; S666　　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号: 1000-470X ( 2003) 03-0254-05
Study on the Pollen Characteristics and Storage of Citrus
Interspecif ic Somatic Hybrid
LIU Yan-Ling
1, 2
, XIA Ren-Xue
1
, L I Guo-Huai1 , M A M eng-Ting1 , YI Hua-Lin1
( 1. Col leg e of H or ticu ltu re and Forestry, H uaz hong Ag ri cultural Univ er si ty, Wuh an　430070, Chin a;
2. W uhan B otanical G arden/ Wuhan Insti tut e of B otany , T he Chinese Acad emy of S ci ences, Wuhan　430074, Ch ina)
Abstract: The pollen characteristics of Cit rus interspecif ic somatic hybrid “Hamlin sw eet orange
( Citrus sinensis) + Rough lemon ( Citr us jambhiri)”was observed. T he results show ed that the
medium containing 16% sucrose, 10 mg / kg H3BO 4 and 0. 8% agar in vitr o cul ture w as suitable
fo r pollen germinat ion, and the po llen germ inabil ity of “Hamlin sw eet o range+ Rough lemon”
was 15. 31%, w hich indicated that the viability of interspecific somat ic hybrid w as intermediate to
its parents and could be used as par ent in future crossing . Pollen grains of “Hamlin sw eet orange
+ Rough lemon”were stored at - 20℃. T he results showed that vocauum and dry condit ion ( cal-
cium chloride or silica gel as desiccants ) w ere benefit for the pollen sto rage. And the results of
art if icial pollinat ion also show ed that the fruit set with fresh pollen and stored pollen was no t sig-
nif icant ly different . T hus low temper ature, vocauum and dr y condit ion w er e benefit fo r the po llen
stor ag e of Citr us somat ic hybr id.
Key words : Citrus; Interspecif ic somat ic hybrid; Po llen character ist ics; Pollen storag e
　　随着原生质体融合技术在柑桔育种上的应用与
发展, 异源四倍体体细胞杂种的潜在价值逐步显示
出来[ 1 3] :除作为砧木(具抗寒、抗某些病虫害,生长
势强等优点)外,还可作为杂交亲本被利用。即以异
源四倍体体细胞杂种作父本,与单胚性柚杂交后,并
结合胚抢救技术可创造具有三亲优良性状的无籽三
倍体柑桔品种 [ 4 6] ,因此研究体细胞杂种花粉特性
(包括花粉形态、花粉量、生活力等)对三倍体柑桔品
种的培育具有重要意义。
然而异源四倍体体细胞杂种由于倍性的增加,


收稿日期: 2002-09-18,修回日期: 2003-01-15。
基金项目: 国务院三峡建设委员会移民科技项目及国家 948项目资助。
作者简介: 刘艳玲( 1976- ) ,女,硕士,现从事水生植物育种研究。
通讯作者。
植株的花期一般晚于同一地区的柚树品种 [ 7, 8] , 并且
与异地柚品种花期更不易相遇, 因此为了满足不同
地区不同柚品种人工授粉的需要, 我们对粗柠檬与
“哈姆林”甜橙种间体细胞杂种的花粉进行贮藏并开
展了人工授粉试验。
1　材料与方法
异源四倍体粗柠檬( C. j ambhiri Lush) + “哈
姆林”甜橙( C. sinensis Osbeck)种间体细胞杂种(简
称 HR)由华中农业大学柑橘研究所通过原生质体
融合产生[ 9] , 栽植土壤后三年半开花,以下各观察项
目均在其枳砧田间高接树上进行。
1. 1　花粉特性
花粉生活力的检测参照邓秀新( 1992)描述的方
法[ 10 ] :采用悬滴培养法,培养基为 0. 8%琼脂+ 16%
蔗糖+ 10 mg / kg 硼酸, 28℃暗培养 18 h 后, 统计花
粉萌发率和花粉管长度,以花粉管超过花粉直径为
花粉发芽的直观标志;花粉粒数/花药:从即将开放
的花中采集 40个花药, 置于小培养皿中加入 4 mL
含吐温- 20的水,用小玻棒将花药捣碎使花粉充分
散出悬浮于水中,混匀后用血球记数板统计出花粉
粒数量/花药。计算公式为:每花药中含花粉粒数=
( 0. 1
L 小方格中的花粉粒数×10×1 000×4) / N,
( N 为所取的花药数) ;花粉形态及大小的观察:把干
燥花粉涂在洁净的载玻片上,观察其形态, 并用显微
测量尺测其纵、横径, 5次重复,每次不少于 50粒。
1. 2　花粉贮藏试验
花粉贮藏试验于 1999年 5月～2000年 5 月进
行。以 HR 的田间高接树为试材, 于 1999年 5月 1
日～5日采铃铛期花苞剥取花药, 置于 25～28℃的
电热鼓风干燥箱中 8～12 h, 散粉后进行低温
( - 20℃)保存,并设计 3种试验处理。
真空保存。
将收集的花粉置于干燥器中, 2周后, 一是将其转至
青霉素小瓶中, 用 50 mL 针管抽气 15～20次后进
行低真空密封保存;二是将花粉用硫酸纸包好放入
带橡皮塞的棕色广口瓶中, 用扩散泵抽真空 20～
30 m in后进行高真空密封保存。 干燥保存。将花粉
分别置于以 NaNO 2 和硅胶作干燥剂的棕色广口瓶
中密封保存。 真空、干燥保存。将花粉分别置于以
NaNO 2、硅胶、CaCl2 作干燥剂的棕色广口瓶中, 用
扩散泵抽真空 20～30 min后密封保存。
1. 3　授粉试验
授粉试验在湖北省宜昌市伍家乡旭光村进行
( 2000年 5月 2日～5月 4日) ,试材为晚白柚的成
年结果树。选树冠大小、生长势相近的单株为小区,
以自花授粉(套袋)为主对照, 自然结实为辅对照, 在
盛花期选择健壮花序上的 2朵花分别授以 HR当年
花粉和贮藏花粉(贮期 1年) , 8次重复, 随机排列。
同时为促进授粉操作的简单化, 用 HR 新鲜花粉进
行了不套袋的去雄、不去雄授粉处理。
1. 4　座果率调查
分别在第一次生理落果(谢花后25 d)和第二次
生理落果(谢花后 50～60 d)时调查座果率。花序座
果率:花序上只要结果( 1或 2个) , 其花序座果率就
为 100%, 反之为 0% ;花朵座果率= (座果数/授粉
花朵数)×100%。
2　结果与分析
2. 1　HR的花粉特性
2. 1. 1　HR花粉离体萌发的培养基　HR花粉离体
萌发的适宜条件见表 1。培养基中硼酸的含量不仅
影响 HR花粉的离体萌发率, 而且影响花粉管的长
度。在含琼脂0. 8%和蔗糖 16%的培养基中, 添加不
同浓度的硼酸后,随着浓度的加大,花粉萌发率逐渐
变小,花粉管也逐渐变短、变粗。虽然 15 mg/ kg 和
10 mg/ kg 的硼酸对花粉萌发率影响不大,但从花粉
管的长度来看, 以 10 mg/ kg 硼酸浓度更适于 HR
花粉的离体萌发。
表 1　硼酸对 HR 花粉离体萌发率和花粉管长度的影响
Table 1　T he effect of bor ic acid on pollen germinabilit y and t he lengt h of HR pollen tube
硼酸　Bor ic acid concentr ation( mg / kg ) 100 50 25 15 10
萌发率　Germinability ( % ) 7. 80 10. 00 11. 89 14. 71 16. 03
花粉管长度　Po llen tube lengt h(
m) 184. 03 204. 95 311. 72 393. 14 538. 11
2. 1. 2　HR 花粉活力　对种间体细胞杂种 HR 的
花粉进行了花粉量、生活力测定,结果表明: HR 每
花药含花粉 19 229. 40粒、染色活力为 77. 41%、萌
发率为 15. 31% , 3个指标都介于两亲本之间,说明
HR的活力相对于高值亲本“哈姆林”甜橙(每花药
含花粉 24 117. 00粒, 染色活力为 84. 20%, 萌发率
为 31. 00% )有所降低, 相对于低值亲本粗柠檬(每
花药含花粉 17 228. 00 粒, 染色活力为 67. 20% , 萌
255　第 3 期　　　　　　　　　　　　刘艳玲等: 柑桔种间体细胞杂种的花粉特性及贮藏研究
发率为 13. 90%)有所提高,这为其作为亲本与单胚
性柚类等杂交奠定了基础。但 HR 小花粉的比例
( 25. 67% ) 远远高于两亲本 (“哈姆林”甜橙为
0. 70% ,粗柠檬为 3. 80% )。
同时对 HR的花粉进行了观察,根据其大小、形
态可划分为 3类(见表 2) ,即长椭圆形大花粉、近圆
形中等花粉和不规则形小花粉。
表 2　HR 花粉形态及大小的观察
Table 2　HR pollen mo rpholog y and size
类型
Type
形状
Morpholog y
大小(横径×纵径)
(
m)
Diameter
( cro ss diamet er×
long itudina l diameter )
大花粉
Big po llen
长椭圆形
Long-ellipse
27. 502×39. 419
中等花粉
M iddle po llen
近圆形
Near ly-circle
25. 930×26. 240
小花粉
Small po llen
不规则
Abnormal
13. 096×15. 715
　　HR每朵花的花药数一般为 25～30个, 每花药
的花粉量约 18 000～19 000粒, 因此每朵花约含花
粉 4. 63×105～5. 55×105粒。HR 花粉的离体萌发
率为 15. 31%, 故每朵花约含 70 885. 3～84 970. 5
粒有萌发力的花粉, 基本可以满足授粉要求。
2. 2　贮藏方法与花粉生活力
不同贮藏条件下 HR 花粉的离体萌发率见表
3。从表 3中可以看出:
以NaNO 2作干燥剂不适于
HR 花粉保存。干燥保存中, NaNO 2 控湿的花粉生
活力与硅胶控湿的花粉生活力差异显著。以硅胶控
湿的花粉生活力随着贮藏时间的延长缓慢下降, 而
NaNO 2控湿的花粉生活力迅速下降, 贮藏 6个月后
萌发率只有 1. 48% ,基本丧失了生活力;真空、干燥
保存中, NaNO 2控湿的花粉生活力与硅胶、CaCl2 控
湿的差异显著。硅胶、CaCl2控湿的花粉生活力下降
缓慢,两者无差异。而 NaNO 2控湿的花粉贮藏 1年
后萌发率只有 4. 16%,明显低于其它干燥剂保存的
效果。 真空能延缓花粉生活力的下降,有利于花粉
保存。真空和非真空保存中, N aNO 2 控湿的花粉生
活力差异显著。贮藏6个月后,非真空保存的花粉萌
发率只有 1. 48%, 而真空保存的花粉生活力为
7. 29%。 真空保存中,高真空保存与低真空保存的
花粉生活力差异不显著, 但从花粉生活力下降的趋
势看,高真空保存的花粉生活力下降较缓慢, 这说明
在同一湿度条件下, 高真空有利于花粉贮藏。
表 3　不同贮藏条件下 HR 花粉的离体萌发率比较
T able 3　Comparision o f HR po llen germinability in different sto rag e conditions
贮藏时间(月)
Stor age t ime ( month)
干燥　Desiccant
NaNO 2
Nitrite
sodium
硅胶
Silica
gel
真空+ 干燥　Vocauum+ desiccant
NaNO2
Nitr ite
sodium
硅胶
Silica
g el
CaCl2
Calcium
chlor ide
真空　Vocauum
高真空
High
vocauum
低真空
Low
vocauum
2　 10. 25 14. 61 11. 61 14. 88 15. 03 15. 07 15. 71
4 6. 77 13. 52 10. 21 13. 80 14. 53 13. 86 14. 33
6 1. 48 12. 96 7. 29 13. 24 14. 41 12. 55 13. 80
8 1. 50 11. 96 7. 02 12. 05 13. 80 11. 22 12. 05
10 1. 05 10. 03 5. 47 11. 88 12. 06 10. 92 11. 44
12 1. 01 8. 62 4. 16 11. 15 11. 94 9. 61 10. 03
方差分析后进一步测验的结果 (= 0. 05)
Var iance analy sis result s
c a b a a a a
　注:方差分析的数据为贮藏第 12 个月时的花粉萌发率; 方差分析的显著水平 = 0. 05; 表中所列数据均为百分数;
差异显著水平用 a , b, c来表示。
　No tes: The data o f var iance analy sis is the germinability of HR po llen st or ed tw elve mont hs; The significant lev el
o f var iance analy sis is = 0. 05; The data of table 1 is in terms of per centage ; a, b and c stand for the ex tent o f
differ ence.
　　从表 3中还可以看出: 无论哪种处理, 随着贮藏
时间的延长, 花粉生活力都逐渐下降, 只是方法不
同,花粉生活力下降的速度不同而已。
2. 3　授粉座果率
从表 4 中可以看出:
HR贮藏花粉的平均座
果率为 45. 75% ,与新鲜花粉的座果率 49. 50%差异
不显著。经授粉前花粉生活力测定,新鲜花粉的生活
力达 14. 59% , 而贮藏花粉的生活力只有 8%～
10% ,但两者的座果率却无差异,这说明 HR 花粉贮
藏 1年后生活力虽有所下降, 但足以引起晚白柚的
授粉受精;  晚白柚自花授粉的座果率为 3. 86% ,
自然结实率为 1. 67%, 两者都很低且差异不显著。
256 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
这说明晚白柚有一定的自花结实能力,但不能满足
生产需要,需异花授粉; 以 HR 为父本与晚白柚杂
交的座果率远远高于其自花授粉及自然结实的座果
率,两者差异显著,这说明 HR异花授粉可显著提高
座果率。!从 HR新鲜花粉不套袋的去雄、不去雄的
授粉结果来看,其平均座果率高达 48. 50% ,与新鲜
花粉(套袋)的座果率( 49. 50%)差异不显著, 说明
HR 授粉操作可简单、方便化。
表 4　HR不同处理花粉的座果率比较
Table 4　Compar ision of the fr uit set w ith differ ent st or ed pollen o f HR
座果率( % )
Fruit set ( % )
HR新鲜花粉
HR fresh
po llen
贮藏花粉( 1年)
Stor ed po llen ( fo r one year )
CaCl2,真空
Calcium
chlor ide,
vo cauum
硅胶,真空
Silica
g el,
v ocauum
硅胶
Silica
g el
低真空
Low
vocauum
自花授粉,套袋
Self-
po llinat ion,
package
天然结实
Natur al
fr uit
set
不去雄,不套袋
Non-
package
w it h
stam en
去雄,不套袋
Non-
package
w ithout
stamen
花序座果率-1
F ruit set of flow er head-1
78. 50 92. 00 82. 00 86. 00 74. 67 31. 99 26. 67 95. 00 95. 80
花序座果率-2
F ruit set of flow er head-2
70. 00 74. 00 66. 00 70. 00 52. 00 6. 260 3. 34 74. 00 78. 00
花朵座果率-2
Fruit set o f flow er -2
49. 50 53. 00 45. 00 49. 00 36. 00 3. 86 1. 67 46. 00 51. 00
方差分析后进一步测验的结果
Var iance analy sis result s
( = 0. 05)
a a a a a b b a a
　注:方差分析的结果包括花序座果率-1、-2和花朵座果率-2;方差分析的显著性水平 = 0. 05; 差异显著水平用 a, b, c 来
表示; “-1”表示第一次生理落果后调查的座果率;“-2”表示第二次生理落果后调查的座果率。
　Not es: The fruit set percentag e o f flow er head-1, -2 and flow er-2 ar e included in the var iance analysis r esults; T he
significant level of v ariance analysis is = 0. 05; a , b and c stand for the ex tent of differ ence; ‘-1’stand fo r the fruit
set per centag e detected after the fir st physio lo gica l dr op; ‘-2 st and fo r the fruit set per centag e detected after the
second physio log ical dr op.
　　
3　讨论
原生质体融合虽可克服柑桔杂交育种中遇到的
珠心胚干扰、雌/雄败育及有性杂交不亲和等困难,
但由于其结果较晚, 皮厚、硬,汁少、酸味重, 口感不
良,因而果实的商品价值不高,目前难以作为栽培品
种直接利用[ 11]。通过对柑桔种间体细胞杂种 HR的
花粉量、花粉生活力进行检测,表明其花粉活力介于
两亲本(粗柠檬与‘哈姆林’甜橙)之间,可作为杂交
亲本被利用, 这与前人 [ 8, 12, 13]的报道是一致的。
HR的花粉大小、形态各异,且小花粉出现的比
率远远高于两亲本,这可能与亲缘关系远近有关,因
为种间体细胞杂种来自双亲的染色体不能正常配
对,最后出现许多落后染色体、单体及多分孢子等,
都会导致小花粉的形成 [ 14 17]。因此进一步研究柑桔
异源四倍体体细胞杂种的减数分裂行为, 提高其花
粉活力,可为其在柑桔育种上更广泛应用奠定基础。
然而由于倍性的增加, HR的花期稍晚于同一
地区柚树的花期,即无法作为授粉品种在同一地区
直接加以利用,因此需对其花粉进行贮藏, 才能满足
不同地区不同柚品种授粉的需要。通过对 HR花粉
的贮藏, 本试验探索出了贮藏的较适条件: 低温
( - 20℃)、低湿(硅胶或 CaCl2控湿)、真空。其中低
温、低湿( < 50% )是贮藏 HR花粉的关键,真空虽然
能够延缓生活力的下降,但它不是 HR 花粉贮藏的
必要条件。
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