全 文 ：植物科学学报 ２０１４ꎬ ３２(３): ２５１~２５８
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ＤＯＩ:１０ ３７２４ / ＳＰ Ｊ １１４２ ２０１４ ３０２５１
金鱼藤中 ＡｐＮＡＰ基因的克隆和表达模式分析
樊金萍∗ꎬ 赵 然
(东北农业大学园艺学院ꎬ 哈尔滨 １５００３０)
摘 要: 金鱼藤(Ａｓａｒｉｎａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ)是玄参科金鱼藤属多年生藤本植物ꎬ 在园林中常用于垂直绿化ꎬ 是良好
的观赏植物ꎬ 但金鱼藤叶片衰老后很快干枯并脱落ꎬ 仅留光秃的茎蔓ꎬ 使其观赏价值大大降低ꎮ ＡｔＮＡＰ 是拟南
芥 ＮＡＣ基因家族中与衰老相关的转录因子ꎬ 在调控叶片衰老过程中有重要的作用ꎮ 本研究以金鱼藤衰老叶片为
材料ꎬ 运用 ＲＴ￣ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ 技术克隆金鱼藤中 ＡｐＮＡＰ 基因 ｃＤＮＡ 序列ꎮ 结果显示ꎬ 该基因位于细胞核中ꎬ
ｃＤＮＡ全长为 １３４１ ｂｐꎬ 开放阅读框为 ９３６ ｂｐꎬ 编码 ３１１个氨基酸ꎬ 相对分子量为 ３５ ２１ ｋＤꎬ 等电点为 ９ １３ꎻ
ＡｐＮＡＰ基因组全长 １５２６ ｂｐꎬ 含有 ２个内含子和 ３个外显子ꎮ 多重序列比对表明ꎬ ＡｐＮＡＰ 属于 ＮＡＣ 转录因子
家族ꎮ 系统进化树分析显示ꎬ ＡｐＮＡＰ 属于 ＮＡＰ 亚组ꎬ 与 ＡｔＮＡＭ的同源关系最近ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ 结果表
明ꎬ 受自然状态下衰老和黑暗处理的诱导ꎬ ＡｐＮＡＰ基因表达量增加ꎬ 这进一步说明 ＡｐＮＡＰ 基因参与调控金鱼
藤叶片衰老的过程ꎮ 该基因的分离对利用转基因技术延缓金鱼藤叶片衰老ꎬ 提高金鱼藤在园林绿化中的观赏价
值具有实际意义ꎮ
关键词: 金鱼藤ꎻ 基因克隆ꎻ ＡｐＮＡＰꎻ 荧光定量 ＰＣＲ
中图分类号: Ｑ９４３ 文献标识码: Ａ 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０３￣０２５１￣０８
收稿日期: ２０１３￣１２￣１２ꎬ 修回日期: ２０１４￣０３￣１２ꎮ
基金项目: 黑龙江省研究生创新科研资金项目(ＹＪＳＣＸ２０１２￣０３２ＨＬＪ)ꎮ
作者简介: 樊金萍 (１９７２ －)ꎬ 女ꎬ 博士ꎬ 硕士生导师ꎬ 研究方向为园林植物遗传育种与生物技术 ( Ｅ￣ｍａｉｌ: ｆａｎ ＿ ｘｕｅｒ２０００＠
ａｌｉｙｕｎ ｃｏｍ)ꎮ
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ)ꎮ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ＡｐＮＡＰ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｓａｒｉｎａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ
ＦＡＮ Ｊｉｎ￣Ｐｉｎｇ∗ꎬ ＺＨＡＯ Ｒａｎ
(Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｒｂｉｎ １５００３０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａｓａｒｉｎａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓꎬ Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅꎬ ｉｓ ａ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｖｉｎｅ ａｎｄ ｇｏｏｄ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ
ｐｌａｎｔ ｆｏｒ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｒｄｅｎ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ ｂｅｃｏｍｅ
ｄｒｙ ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｅｎｅｓｃｉｎｇꎬ ｔｈｅ ｂａｒｅ ｔｅｎｄｒｉｌｓ ｇｒｅａｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｉｔｓ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｖａｌｕｅ. ＡｔＮＡＰ
ｉｓ ａ ＮＡＣ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ＡｐＮＡＰꎬ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｏｆ ＡｔＮＡＰꎬ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ
Ａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＣＥ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｈａｄ ａ ｔｏｔａｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ １３４１ ｂｐ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ
９３６ ｂｐꎬ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３１１ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗａｓ ３５ ２１ ｋＤ ａｎｄ
ｔｈｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｗａｓ ９ １３. Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ １５２６ ｂｐ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｉｎｔｒｏｎｓ ａｎｄ
ｔｈｒｅｅ ｅｘｏｎｓ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａ ＮＡＣ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＮＡＰ
ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｓｈａｒｅｄ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ＡｔＮＡＭ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ｑＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＡｐＮＡＰ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄａｒｋ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ. Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＡｐＮＡＰ ｈａｄ ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｖａｌｕｅ ｏｆ
Ａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｓａｒｉｎａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓꎻ Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇꎻ ＡｐＮＡＰꎻ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ
金鱼藤(Ａｓａｒｉｎａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ)叶绿繁茂ꎬ 花
色素雅ꎬ 在园林中既可做墙体的垂直绿化、 又可做
垂吊植物栽培ꎬ 是良好的观赏植物ꎬ 但其叶片衰老
后ꎬ 会很快干枯脱落ꎬ 仅留下光秃的金鱼藤茎蔓ꎬ
大大降低了其观赏价值ꎮ 目前ꎬ 国内外对金鱼藤的
研究鲜有报道ꎮ ２０１１ 年张美恒等[１]以金鱼藤叶柄
为外植体建立了金鱼藤快速繁殖体系ꎮ
叶片衰老是植物发育的有机组成部分ꎬ 是一个
主动的调控过程[２]ꎮ 叶片衰老包含了叶绿体结构
的破坏ꎬ 叶绿体、 蛋白质、 脂类、 核酸等大分子物
质的降解ꎬ 营养元素的转运和再利用以及最终叶片
的凋亡ꎮ 叶片衰老过程中伴随着细胞结构、 生理代
谢和基因表达方面的一系列复杂有序的变化[３]ꎮ
其中 ＡｔＮＡＰ是拟南芥 ＮＡＣ基因家族中与衰老相关
的转录因子ꎬ 在调控叶片衰老过程中有重要的作
用[４]ꎮ
ＮＡＣ转录因子只存在于植物中ꎬ 且数量众多ꎬ
广泛分布于陆生植物中ꎬ 构成了最大的转录因子家
族之一[５ꎬ６]ꎮ １９９６年 Ｓｏｕｅｒ 等[７]在矮牵牛(Ｐｅｔｕｎｉａ
ｈｙｂｒｉｄ Ｖｉｌｍ)中克隆得到第一个 ＮＡＣ转录因子ꎬ 随
后ꎬ 在拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)、 水稻(Ｏｒｙ￣
ｚａ ｓａｔｉｖａ)约 ２０ 种植物中发现了 ＮＡＣ 基因[８]ꎮ
ＮＡＣ结构域不包含任何已知的蛋白结构域ꎬ 而是
以几个螺旋元件包围着一个扭曲的 β￣折叠片结构
代替了典型的螺旋－转角－螺旋结构[９]ꎮ ＮＡＣ 蛋白
的 Ｎ￣端高度保守ꎬ 由大约 １６０个氨基酸残基组成ꎬ
分为 Ａ、 Ｂ、 Ｃ、 Ｄ、 Ｅ ５ 个亚结构域[６]ꎬ 其中亚域
Ｃ可能与结合 ＤＮＡ有关ꎬ 亚域 Ｅ 可能参与发育时
期调控和(或)组织特异性ꎬ 并协同亚域 Ｄ 与 ＤＮＡ
发生相互作用[９ꎬ１０]ꎮ 研究表明ꎬ ＮＡＣ 转录因子在
植物的生长发育、 器官形成、 激素调节和防御抵抗
多种生物和非生物胁迫等方面都发挥着重要作用ꎮ
如侧根的形成[１１]ꎬ 植物的衰老[１２－１４]ꎬ 次生细胞壁
的形成[１５－１７]ꎬ 对寒冷、 干旱以及盐胁迫的响
应[１８ꎬ１９]等ꎮ
ＮＡＰ (ＮＡＣ￣ｌｉｋｅꎬ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＡＰ３ / ＰＩ) 是
ＮＡＣ基因家族的一个成员ꎬ 具有典型的包含 Ａ、
Ｂ、 Ｃ、 Ｄ和 Ｅ ５个亚结构域的 ＮＡＣ结构域ꎬ 在转
录激活区域没有与其它 ＮＡＣ 家族成员同源的保守
结构域[６]ꎮ １９９８ 年ꎬ Ｓａｂｌｏｗｓｋｉ 等[２０] 通过激活
ＡＰ３ / ＰＩ功能并抑制下游蛋白翻译的方法ꎬ 检测下
游基因的 ｍＲＮＡ水平ꎬ 克隆了 ＡｔＮＡＰ 基因并发现
其能调控花器官的发育ꎮ ２００６ 年 Ｇａｎ 等[１４]在拟
南芥中发现 ＡｔＮＡＰ在叶片衰老中也起着重要作用ꎬ
ＡｔＮＡＰ在叶片未衰老时几乎没有表达ꎬ 而叶片衰
老时表达显著上调ꎬ ＡｔＮＡＰ 的 Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变体
ｎａｐ表现出明显的叶片滞绿表型ꎬ 叶片衰老比拟南
芥野生型晚大约 １０ ｄ 左右[１４]ꎮ 而后ꎬ 研究人员分
别在柑橘(Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ)、 番红花(Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉ￣
ｖｕｓ)、 水稻、 高羊茅(Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ Ｓｃｈｒｅｂ.)
和金丝慈竹(Ｂａｍｂｕｓａ ｅｍｅｉｅｎｓｉｓ ‘Ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖｕｓ’)
中克隆了与 ＡｔＮＡＰ 同源性很高的 ＮＡＣ 基因(Ｃｉｔ￣
ＮＡＣ、 ＣｓａｔＮＡＰ、 ＯｓＮＡＰ、 ＦａＮＡＰ、 ＢｅＮＡＣ１) 并
进行了功能分析ꎬ 发现克隆得到的基因在调控叶片
衰老进程中起着重要的作用[２１－２５]ꎮ 本研究通过分
离克隆金鱼藤叶片中与衰老相关的转录因子 Ａｔ￣
ＮＡＰ同源基因 ＡｐＮＡＰꎬ 分析该基因的功能ꎬ 可以
为金鱼藤叶片衰老机制的研究提供线索ꎬ 同时对延
缓金鱼藤叶片衰老ꎬ 提高金鱼藤的绿化价值有着重
要的作用ꎮ
１ 材料与方法
１ １ 植物材料
金鱼藤(Ａｓａｒｉｎａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ)由东北农业大
学园艺站提供ꎮ 取自然生长状态下完全衰老的叶片
作为 ＡｐＮＡＰ基因克隆材料ꎻ 此外ꎬ 取幼嫩、 开始
衰老(叶尖开始黄化)和完全衰老(明显的黄化现
象)的叶片作为实时荧光定量 ＰＣＲ 材料ꎬ 叶片经
液氮速冻后ꎬ 置－８０℃保存备用ꎮ
１ ２ 总 ＲＮＡ提取和 ｃＤＮＡ合成
采用 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂提取金鱼藤衰老叶片的总
ＲＮＡꎮ 采用 ＴａＫａＲａ公司的 Ｍ￣ＭＬＶ 反转录酶合成
２５２ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
ｃＤＮＡ第一链用于 ＲＴ￣ＰＣＲꎻ 按照 ＴａＫａＲａ公司 ３′￣
Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ Ｖｅｒ ２ ０ 和 ５′￣Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ
Ｓｅｔ Ｖｅｒ １ ０ 说明书进行 ｃＤＮＡ 合成ꎬ 用于 ３′￣
ＲＡＣＥ和 ５′￣ＲＡＣＥ扩增ꎮ
１ ３ ＲＡＣＥ法克隆 ＡｐＮＡＰ基因
以 ｃＤＮＡ为模板ꎬ 在 ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ ｎｃｂｉ.
ｃｏｍ)中搜索拟南芥等其它物种对应的氨基酸和核
苷酸序列并进行比对ꎬ 用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ ０软件
设计简并引物 ＮＡＰ￣Ｆ１ 和 ＮＡＰ￣Ｒ１(见表 １)ꎬ 进行
降落 ＰＣＲꎬ 得到的 ＰＣＲ 产物用 １ ２％琼脂糖凝胶
电泳检测ꎬ 回收的目的片段与 ｐＥａｓｙ￣Ｔ１载体连接并
转化大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ 蓝白斑筛选后
送北京华大基因公司测序ꎮ 降落 ＰＣＲ 反应程序:
９４℃变性 ５ ｍｉｎꎻ ９４℃变性 ３０ ｓꎬ ６０℃退火 ３０ ｓꎬ
７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３个循环ꎻ ９４℃变性 ３０ ｓꎬ ５７℃
退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３个循环ꎻ ９４℃变性
３０ ｓꎬ ５４℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ２５ 个循
环ꎻ ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎬ ４℃保存ꎮ
根据已获得的保守序列ꎬ 设计 ３′￣ＲＡＣＥ 和 ５′￣
ＲＡＣＥ特异性引物 ３′ ｒａｃｅ￣Ｏｕｔｅｒ、 ３′ ｒａｃｅ￣Ｉｎｎｅｒ、 ５′
ｒａｃｅ￣Ｏｕｔｅｒ和 ５′ ｒａｃｅ￣Ｉｎｎｅｒ(表 １)ꎬ 进行巢式 ＰＣＲꎬ
扩增 ３′和 ５′端序列ꎮ 将获得的保守序列、 ３′端序列
和 ５′端序列进行序列拼接ꎬ 得到 ＡｐＮＡＰ 基因的全
长序列ꎮ 设计全长引物 ＧＳＰ￣Ｆ１和 ＧＳＰ￣Ｒ１(表 １)ꎬ
表 １ 用于 ＡｐＮＡＰ基因克隆与表达分析的引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列(５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′－３′)
用途
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ＮＡＰ￣Ｆ１ ＧＧＳＴＴＹＭＧＲＴＴＹＣＡＹＣＣＮＡＣＢＧＡ
ＮＡＰ￣Ｒ１ ＴＣＮＧＴＲＣＣＮＧＴＮＧＣＹＴＴＣＣＡＲＴＡ
ＲＴ￣ＰＣＲ
３′ ｒａｃｅ￣Ｏｕｔｅｒ ＴＧＣＧＧＧＧＣＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＴ
３′ｒａｃｅ￣Ｉｎｎｅｒ ＴＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＣ
３′ ＲＡＣＥ
５′ ｒａｃｅ￣Ｏｕｔｅｒ ＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＣＡＡＡＴ
５′ｒａｃｅ￣Ｉｎｎｅｒ ＣＣＣＡＴＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＴＣ
５′ ＲＡＣＥ
ＧＳＰ￣Ｆ１ ＡＧＴＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡ
ＧＳＰ￣Ｒ１ ＣＡＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＡＴＴＣ
ｃＤＮＡ
ＧＳＰ￣Ｆ２ ＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴ
ＧＳＰ￣Ｒ２ ＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＣＣＡＡＡ
Ｇｅｎｏｍｅ
克隆
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ ＡＴＹＣＴＨＣＧＴＣＴＹＧＡＹＣＴＴＧＣＷＧＧ
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ ＡＣＹＴＴＲＡＴＣＴＴＣＡＴＧＣＴＲＣＴ
Ａｃｔｉｎ克隆
ＮＡＰ￣Ｆ２ ＧＧＣＴＴＴＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＣＧＧＡ
ＮＡＰ￣Ｒ２ ＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡ
ｑＰＣＲ
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ１ ＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣ
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ１ ＣＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＡ
ｑＰＣＲ
扩增全长 ｃＤＮＡꎮ
１ ４ ＡｐＮＡＰ全长基因组的克隆
采用 ＣＴＡＢ法ꎬ 提取金鱼藤叶片中的总 ＤＮＡꎬ
设计基因组全长引物 ＧＳＰ￣Ｆ２ 和 ＧＳＰ￣Ｒ２ (见表
１)ꎬ 扩增 ＡｐＮＡＰ全长基因组ꎮ
１ ５ ＲＴ￣ＰＣＲ法克隆 Ａｃｔｉｎ片段
以 ｃＤＮＡ为模板ꎬ 在 ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ ｎｃｂｉ.
ｃｏｍ)中搜索拟南芥等其它物种 Ａｃｔｉｎ 基因的核苷
酸序列并进行比对ꎬ 用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ ０软件设
计简并引物 Ａｃｔｉｎ￣Ｆ 和 Ａｃｔｉｎ￣Ｒ(见表 １)进行 ＰＣＲ
反应ꎮ ＰＣＲ反应程序: ９４℃变性 ５ ｍｉｎꎻ ９４℃变性
３０ ｓꎬ ５６℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３０ 个循
环ꎻ ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎬ ４℃保存ꎮ
１ ６ 生物信息学分析
用 ＮＣＢＩ中 ＯＲＦ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ ｎｃｂｉ ｎｌｍ ｎｉｈ.
ｇｏｖ / ｇｏｒｆ / ｇｏｒｆ ｈｔｍｌ)分析 ＡｐＮＡＰ 基因的开放阅读
框ꎻ 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ(ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ ｅｘｐａｓｙ ｏｒｇ / ｃｇｉ￣
ｂｉｎ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ)分析蛋白质的理化参数ꎻ 用 Ｃｈｌｏ￣
ｒｏＰ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ ｃｂｓ ｄｔｕ ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＣｈｌｏｒｏＰ / )
在线对氨基酸进行亚细胞定位ꎻ 用 ＤＮＡＭＡＮ 软件
对 ＡｐＮＡＰ基因与其它物种的同源基因进行多重序
列比对ꎬ 用 ＭＥＧＡ ４ ０软件构建系统发育树ꎮ
１ ７ ＡｐＮＡＰ基因表达模式分析
１ ７ １ 黑暗处理后 ＡｐＮＡＰ基因的表达模式分析
将叶龄相同的金鱼藤叶片用铝箔包好ꎬ ２０℃
黑暗离体培养 ０、 ６、 １２、 １８、 ２４、 ３０ ｄ 后ꎬ 分别
提取不同叶片的总 ＲＮＡꎮ
１ ７ ２ 实时荧光定量 ＰＣＲ检测
根据 ＡｐＮＡＰ 和 Ａｃｔｉｎ 基因序列ꎬ 设计特异荧
光定量 ＰＣＲ 引物 ＮＡＰ￣Ｆ２、 ＮＡＰ￣Ｒ２ 和 Ａｃｔｉｎ￣Ｆ１、
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ１(见表 １)ꎮ 以自然状态和黑暗处理后不同
叶片 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ 进行实时荧光定量 ＰＣＲ 反
应ꎬ 以金鱼藤 Ａｃｔｉｎ 基因为内参ꎬ 检测 ＡｐＮＡＰ 基
因的表达量ꎮ 反应条件为: ９４℃变性 ５ ｍｉｎꎻ ９４℃
变性 ３０ ｓꎬ ５７℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３５
个循环ꎻ ４℃保存ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ在 ｉＱＴＭ５荧
光定量 ＰＣＲ 仪上进行ꎮ 采用 ２－ΔΔＣｔ法对数据进行
单因素方差分析ꎬ 统计分析采用 ｏｎｅ￣ｗａｙ ＡＮＯＶＡ
法(ｎ＝３)ꎮ
同时ꎬ 采用高俊凤的分光光度计法[２６]对叶片
３５２ 第 ３期 樊金萍等: 金鱼藤中 ＡｐＮＡＰ基因的克隆和表达模式分析
叶绿素含量进行测定ꎬ 进一步确认不同叶片的衰老
程度ꎮ
２ 结果与分析
２ １ 叶片总 ＲＮＡ提取
从图 １可见ꎬ 用 Ｔｒｉｚｏｌ法提取金鱼藤衰老叶片
的总 ＲＮＡ凝胶电泳有 ２８ ｓ、 １８ ｓ和 ５ ｓ ３条条带ꎬ
其中 ２８ ｓ最亮ꎬ 亮度约是 １８ ｓ的 ２倍ꎬ 说明提取
的总 ＲＮＡ完整ꎬ 可以进行下一步试验ꎮ
2000
bp
1000
750
500
250
100 5
18
28
s
M RNA
图 １ 金鱼藤衰老叶片的总 ＲＮＡ
Ｆｉｇ １ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｌｅａｖｅｓ
２ ２ ＡｐＮＡＰ基因序列的获得
经测序ꎬ 用 ＲＴ￣ＰＣＲ法得到的中间保守片段大
小为 ２５４ ｂｐ (图 ２: ａ)ꎮ ＲＡＣＥ 法克隆得到的 ３′
端和 ５′端序列大小为 １１０７ ｂｐ 和 ３４１ ｂｐ 的片段
(图 ２: ｂꎬ ｃ)ꎮ 将三者进行序列拼接ꎬ 最终得到
ＡｐＮＡＰ 基因的 ｃＤＮＡ全长序列ꎬ 大小为 １３４１ ｂｐꎮ
２ ３ ＡｐＮＡＰ基因组全长的获得
以金鱼藤叶片 ＤＮＡ 为模板ꎬ 进行 ＰＣＲ 反应ꎬ
测序结果发现ꎬ 金鱼藤中 ＡｐＮＡＰ 的基因组全长序
列为 １５２６ ｂｐꎬ 其中包含 ２ 个内含子和 ３ 个外显
子ꎮ 内含子的长度分别为 ８９ ｂｐ和 １０６ ｂｐ(图 ３)ꎮ
２ ４ ＡｐＮＡＰ基因序列分析
通过生物信息学分析发现ꎬ ＡｐＮＡＰ 基因包含
９３６ ｂｐ的开放阅读框ꎬ 编码 ３１１ 个氨基酸序列ꎻ
该基因编码蛋白质的相对分子量为 ３５ ２１ ｋＤꎬ 等
电点(ｐＩ)９ １３ꎬ 为碱性蛋白ꎮ 亚细胞定位发现该
基因位于细胞核中ꎮ
利用 ＤＮＡＭＡＮ软件对 ＡｐＮＡＰ 基因编码氨基
酸序列与其它植物的氨基酸序列进行同源性多重序
列比对ꎮ 结果显示ꎬ ＡｐＮＡＰ 基因具有 ＮＡＣ 家族
Ａ、 Ｂ、 Ｃ、 Ｄ和 Ｅ ５ 个亚结构域ꎬ 且亚域 Ｅ 高度
保守ꎬ 说明 ＡｐＮＡＰ 基因属于 ＮＡＣ 转录因子家族
之一(图 ４)ꎮ
用软件 ＭＥＧＡ ４ ０ 对含目的基因在内的 ２０个
ＮＡＣ转录因子构建系统进化树ꎬ 并采用邻接法
(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ)进行分析ꎬ 结果显示 ＡｐＮＡＰ属
于 ＮＡＰ亚家族ꎬ 可能是 ＡｔＮＡＰ的同源基因ꎬ 具有
与其相似的功能(图 ５)ꎮ
２ ５ ＡｐＮＡＰ基因的表达分析
２ ５ １ Ａｃｔｉｎ基因序列的获得
运用 ＲＴ￣ＰＣＲ 法克隆得到金鱼藤中内参基因
Ａｃｔｉｎ的序列片段ꎬ Ａｃｔｉｎ基因序列大小为 ４６４ ｂｐꎬ
共编码 １５２个氨基酸(图 ６)ꎮ
为进行实时荧光定量 ＰＣＲꎬ 根据已获得的 Ａｐ￣
ＮＡＰ基因和 Ａｃｔｉｎ基因序列ꎬ 重新设计引物ꎬ 进行
ＰＣＲ反应ꎬ 分别得到一段 ２５４ ｂｐ ＡｐＮＡＰ 基因序
列和 １３９ ｂｐ Ａｃｔｉｎ基因序列ꎮ
2000
2000
2000
bp bp bp
1000
1000
500
500
500
250
250 250100
100 100
254 bp
1107 bp
341 bp
M M M1 3’-RACE 5’-RACE
a b c
ａ: ＲＴ￣ＰＣＲ电泳结果ꎻ ｂ: ３′￣ＲＡＣＥ电泳结果ꎻ ｃ: ５′￣ＲＡＣＥ电泳结果ꎻ Ｍ: ＤＬ￣２０００ ｍａｒｋｅｒꎮ
ａ: ＲＴ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＡｐＮＡＰꎻ ｂ: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ３′￣ＲＡＣＥꎻ ｃ: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ５′￣ＲＡＣＥ. Ｍ: ＤＬ￣２０００ ｍａｒｋｅｒ.
图 ２ ＡｐＮＡＰ基因的 ＲＴ￣ＰＣＲ及 ＲＡＣＥ电泳图
Ｆｉｇ ２ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＡｐＮＡＰ
４５２ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
TCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGGAAAAAATAGCCGCCGGATCTCTGATT
TCAAAGAAGAAATAGTTCTCTGAATTTTAGTGAAGGGAATAAAGAAGAAGGAATTTCCTCTC
TGTTTAAGAGCGATCAAAGGCTGAAATTTGGAATAAATATGGGCATCCGAGAAACCGACCC
GCTTTCACAACTGAGTTTGCCTCCCGGGTTCCAGTTCTACCCGACGGATGAGGAGCTTTTGGT
GCAGTACCTCTGCAGAAAAGTTGCGGGGCACTGTTTTCCTTTGCAAATAATTGGAGATGTTG
ATTTGTACAAATTTGACCCGTGGGAGCTTCCAAGCAAAaactagaattctttcatactgtgagcttaatctt
ttttggtttggttttatgattctaaatgttgtgtttgttgtgtgtattcttgaagGCTACATTTGGAGAGAAAGAAT
GGTATTTCTTCAGTCCAAGAGACAGAAAATACCCGAATGGGTCGCGGCCAAATCGAGTAGCC
GGATCCGGGTACTGGAAAGCCACCGGAACTGATAAAATCATTACAACAGAGGGAAGAAAA
GTTGGTATAAAGAAAGCCCTTGTTTTTTACGTTGGGAAAGCGCCTAAAGGAACCAAAACTAA
TTGGATTATGCATGAATATCGACTTTCCGAGCCTTCAAGAAAAAATGGCAGCTCCAAGgtaag
aaaatttataacaattcctttttcttttctttttt taatttatattttggttttcaagtttttaatggatcggattaataattttatttg
gttatgtttagTTGGACGATTGGGTGCTGTGCCGAATCTACAAGAAGAATTCAAGCGGTCAGAAA
CCCGCCATTTCTGCTGTGCAGAGCAAAGAGTACAGCCACGGTTCTTCGTCGTCTTCATCTCAA
TACGACGACGTGTTGGAGTCCTTACCGGAAATCGACGACCGTTTCTTCTCTTTGCCAAGGATG
AATTCCCTCAAGAATCTTCAGCAATTGGGCTCGGGGAATTTTGATTGGGCCACTTTAGCCGG
GCTCAAACCTCTGCCTGAACTCGTACAAGCCCAACAACAAGCCAATATCAACCATAACATGA
GCGGGCAAAATGACATGTATGCCCCCAGCTTCACCCAAAATGTTATGGACGACGAAGTACA
GAGCGGGCTCAAAACTCAACGACTGGAAAACTTTCCACAGAACGCGTTCGCTCAGGGTTATA
CCAACTCGGTCGACCCGTTTGGGATCCGATACCCGAACGGGTTGGGATTCAGACAGTGAAAT
ATACATGAATGCGGGCGATTGTGTAAATAAATGGAATTCTTTGGGCTAACATCTGGCTTTATT
CGTTAATACAGATTGAGAAAGGAAGAGCTCCAAAGGTGTAGTATTCTGAATTTTAGGGGGTC
GTTTGTGAAAATTCAGAAACCATGGTGCCCCCATAGATTTTGTACACGTTTAGGTACATGCAT
ACATCTTCTTTTGCAGATAAATTTAAGGTGCAATCTACCAAAAAAAAAAAAA
!"#$%&()*+,-.
Gray shaded small letters stand for intron sequence
图 ３ ＡｐＮＡＰ基因组全长序列
Ｆｉｇ ３ Ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｏｍｅ
ApNAP Asarina procumbens
AtNAP Arabidopsis thaliana
BeNAC1 Bambusa emeiensis
CsatNAP Crocus sativus
MmNAP Mikania micrantha
ApNAP Asarina procumbens
AtNAP Arabidopsis thaliana
BeNAC1 Bambusa emeiensis
CsatNAP Crocus sativus
MmNAP Mikania micrantha
ApNAP Asarina procumbens
AtNAP Arabidopsis thaliana
BeNAC1 Bambusa emeiensis
CsatNAP Crocus sativus
MmNAP Mikania micrantha
图中 Ａ、 Ｂ、 Ｃ、 Ｄ和 Ｅ 代表 ＮＡＣ家族的 ５个亚结构ꎻ 黑色表示完全保守ꎬ 灰色表示部分保守ꎮ
Ａꎬ Ｂꎬ Ｃꎬ Ｄ ａｎｄ Ｅ ｓｔａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓꎻ Ｂｌａｃｋ ｉｓ ｆｕｌｌｙ￣ｃｏｎｓｅｒｖｅｄꎻ Ｇｒａｙ ｉｓ ｐａｒｔｉａｌｌｙ￣ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ.
图 ４ ＡｐＮＡＰ基因编码的氨基酸与其它植物同源性的多重比对
Ｆｉｇ ４ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｍｉｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＡｐＮＡＰ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｓａｒｉｎａ
ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ
５５２ 第 ３期 樊金萍等: 金鱼藤中 ＡｐＮＡＰ基因的克隆和表达模式分析
AtNAC2 ( BAB20600)Arabidopsis thaliana,
AtNAP ( CAA10955)A. thaliana,
FveNAC ( XP_004297288 )Fragaria vesca,
CitNAC ( ABM67699)Citrus sinensis,
MmNAP ( ABZ89747)Mikania micrantha,
PvNAC2 ( AAK84884)Phaseolus vulgaris,
CsatNAP ( ABU40774)Crocus sativus,
BeNAC1 ( ADP69101)Bambusa emeiensis,
OsNAP ( NP_912423)Oryza sativa,
ApNAP ( )Asarina procumbens
AtNAM ( AAD17314)A. thaliana,
OsNAC5 ( BAA89799)O. sativa,
PxNAM ( AAM34773)Petunia × hybrid,
GmNAC ( AAY46121)Glycine max,
AtNAC072 ( NP_567773)A. thaliana,
AtNAC019 ( AAT02360)A. thaliana,
ATAF1 ( NP_171677)A. thaliana,
AtNAC3 ( BAB20599)A. thaliana,
AtCUC1 ( BAB20598)A. thaliana,
OsNAC1 ( , BAC53810)O. sativa
NAP
AtNAC3
NAM
44
75
62
72
100
100
100
83
100
100
100
100
0.05
89
71
48
54
50
图 ５ ＡｐＮＡＰ基因与其他植物 ＮＡＣ的进化树分析
Ｆｉｇ ５ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ ａｎｄ ＮＡＣ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ
2000
bp
1000
500
250
100
464 bp
M Actin
图 ６ Ａｃｔｉｎ基因的 ＲＴ￣ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ ６ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ
ＲＴ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎ
２ ５ ２ 自然状态下 ＡｐＮＡＰ 基因在叶片中的表达
分析
由图 ７可知ꎬ 随着叶绿素含量的降低ꎬ 叶片衰
老程度的增加ꎬ ＡｐＮＡＰ 基因的表达量显著上调ꎬ
这是金鱼藤叶片衰老的一个正调控因子ꎮ
２ ５ ３ 黑暗诱导后 ＡｐＮＡＰ 基因在叶片中的表达
分析
由图 ８可知ꎬ 随着黑暗处理天数的增加ꎬ 叶绿
素的含量缓慢下降ꎬ 叶片出现早衰现象ꎬ 同时在黑
暗处理 １０ ｄ 以后ꎬ ＡｐＮＡＰ基因的表达量大幅度增
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 1
1
2
2
3
3
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Leaves
Leaves
C
on
te
nt
o
f c
hl
or
op
hy
ll
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
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!
#
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%
&
(
/
)
m
g
g
Ap
N
AP
%
(
)
*
+
A
B
１: 幼嫩叶片ꎻ ２: 开始衰老的叶片ꎻ ３: 完全衰老叶片
１: Ｙｏｕｎｇ ｌｅａｆꎻ ２: Ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｌｅａｆꎻ ３: Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｌｅａｆ
图 ７ 自然状态下不同衰老程度的叶片叶绿素含量(Ａ)
和 ＡｐＮＡＰ基因的相对表达量测定(Ｂ)
Ｆｉｇ ７ Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ (Ａ) ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ (Ｂ) ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｇｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ
６５２ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
0
5
5
10
10
15
15
20
20
25
25
30
30
3 5.
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Days of dark treatment
Days of dark treatment
C
on
te
nt
o
f c
hl
or
op
hy
ll
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
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f A
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AP
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,
(
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)
m
g
g
Ap
N
AP
*
-
.
/
0
,
A
B
图 ８ 不同黑暗处理下金鱼藤叶片叶绿素含量(Ａ)
和 ＡｐＮＡＰ基因的相对表达量测定(Ｂ)
Ｆｉｇ ８ Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ (Ａ) ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ＡｐＮＡＰ ｇｅｎｅ (Ｂ) ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｇｅｄ ｌｅａｖｅｓ
ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄａｒｋ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
加ꎬ 说明该基因能够响应黑暗诱导ꎬ 是金鱼藤叶片
衰老的一个调控基因ꎮ
３ 讨论
ＮＡＰ基因是花瓣和雄蕊形成的靶基因ꎬ 在花
器官形成过程中基因表达上调[１４]ꎮ 番红花中 Ｃｓａｔ￣
ＡＰ３基因能够诱导 ＣｓａｔＮＡＰ 基因在第一轮花瓣中
表达[２７]ꎮ ＮＡＰ基因能响应黑暗诱导ꎬ 使基因表达
上调ꎮ 如在拟南芥叶片衰老过程中ꎬ ＡＢＡ￣ＡｔＮＡＰ￣
ＳＡＧ１１３调控链能够调控气孔关闭和叶片失水ꎮ 其
中 ＳＡＧ１１３是 ＡｔＮＡＰ 的一个靶基因ꎬ 叶片衰老和
受 ＡＢＡ 诱导时ꎬ 该基因表达会上调ꎬ 同时
ＳＡＧ１１３是 ＡＢＡ的一个负调控因子ꎬ 能够阻止叶
片气孔的关闭ꎬ 使叶片失水ꎬ 而引起叶片衰老[２８]ꎮ
Ｚｈｏｕ等[２９]研究发现 ＯｓＮＡＰ 通过参与 ＪＡ 信号传
导途径来调控叶片衰老ꎬ 是叶片衰老的一个正调控
因子ꎬ 反之ꎬ 过表达 ＯｓＮＡＰ 会增强水稻中内源
ＪＡ的产生ꎮ 然而ꎬ ＮＡＰ 基因调控叶片衰老和花器
官形成内在的作用机制仍需进一步探究ꎮ
本研究从金鱼藤衰老叶片中分离克隆得到 Ａｐ￣
ＮＡＰ基因ꎬ 序列比对和系统树分析表明ꎬ 该基因
属于 ＮＡＰ 亚家族ꎬ 含有 ＮＡＣ 家族典型的 Ａ、 Ｂ、
Ｃ、 Ｄ、 Ｅ ５个亚结构域ꎬ 且亚域 Ｅ 高度保守ꎬ 这与
Ｏｏｋａ等[６]的结论一致ꎮ 黑暗处理被认为是一种最
有效最简便的诱导衰老的信号ꎬ 被广泛用来研究叶
片的衰老ꎮ 通过 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 发现ꎬ ＡｐＮＡＰ 基因在
金鱼藤衰老叶片中有较高水平的表达ꎬ 在幼叶中表
达水平较低ꎻ 同时黑暗处理 １５ ｄ后叶片中 ＡｐＮＡＰ
基因表达量开始增大ꎬ 可见该基因能响应黑暗信号
的诱导ꎬ 这与 Ｇｕｏ等[１４]的研究结果一致ꎬ 也进一
步证明了 ＡｐＮＡＰ 具有和 ＡｔＮＡＰ 基因相似的表达
模式ꎬ 在调控叶片衰老过程中起着重要的作用ꎮ
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ｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒｓ
ａｎｄ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｍｅｒｉｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｉｍｏｒｄｉａ
ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ[Ｊ] . Ｃｅｌｌꎬ １９９６ꎬ ８５: １５９－１７０.
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ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡＣ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ
[Ｊ] . ＥＭＢＯ Ｒｅｐꎬ ２００４ꎬ ５ (３): ２９７－３０３.
[１０] Ｊｅｎｓｅｎ ＭＫꎬ Ｒｕｎｇ ＪＨꎬ Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ ＰＬꎬ Ｇｊｅｔｔｉｎｇ Ｔꎬ
７５２ 第 ３期 樊金萍等: 金鱼藤中 ＡｐＮＡＰ基因的克隆和表达模式分析
Ｆｕｇｌｓａｎｇ ＡＴꎬ Ｈａｎｓｅｎ Ｍꎬ Ｊｏｅｈｎｋ Ｎꎬ Ｌｙｎｇｋｊａｅｒ
ＭＦꎬ Ｃｏｌｌｉｎｇｅ ＤＢ. Ｔｈｅ ＨｖＮＡＣ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃ￣
ｔｏｒ: Ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｉｎ ｂａｒｌｅｙ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ
２００７ꎬ ６５ (１－２): １３７－１５０.
[１１] Ｈｅ ＸＪꎬ Ｍｕ ＲＬꎬ Ｃａｏ ＷＨꎬ Ｚｈａｎｇ ＺＧꎬ Ｚｈａｎｇ ＪＳꎬ
Ｃｈｅｎ ＳＹ. ＡｔＮＡＣ２ꎬ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｄｏｗｎ￣
ｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ａｎｄ ａｕｘｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓꎬ
ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｌａｔｅｒａｌ ｒｏｏｔ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００５ꎬ ４４: ９０３－９１６.
[１２] Ｕａｕｙ Ｃꎬ Ｄｉｓｔｅｌｆｅｌｄ Ａꎬ Ｆａｈｉｍａ Ｔꎬ Ｂｌｅｃｈｌ Ａꎬ Ｄｕｂ￣
ｃｏｖｓｋｙ Ｊ. Ａ ＮＡＣ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍ￣
ｐｒｏｖｅｓ ｇｒａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｚｉｎｃꎬ ａｎｄ ｉｒｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ
ｗｈｅａｔ[Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ ２００６ꎬ ３１４: １２９８－１３０１.
[１３] Ｂａｌａｚａｄｅｈ Ｓꎬ Ｋｗａｓｎｉｅｗｓｋｉ Ｍꎬ Ｃａｌｄａｎａ Ｃ. ＯＲＳＩꎬ
ａｎ Ｈ２Ｏ２ ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＮＡＣ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌｓ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ[ Ｊ] . Ｍｏｌ
Ｐｌａｎｔꎬ ２０１１ꎬ ４(２): ３４６－３６０.
[１４] Ｇｕｏ ＹＦꎬ Ｇａｎ Ｓ. ＡｔＮＡＰꎬ ａ ＮＡＣ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｈａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００６ꎬ ４６(４): ６０１－６１２.
[１５] Ｍｉｔｓｕｄａ Ｎꎬ Ｉｗａｓｅ Ａꎬ Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈꎬ Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍꎬ
Ｓｅｋｉ Ｍꎬ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ Ｏｈｍｅ ＴＭ. Ｔｈｅ ＮＡＣ ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓꎬ ＮＳＴ１ ａｎｄ ＮＳＴ３ꎬ ａｒｅ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌｓ ｉｎ ｗｏｏｄｙ
ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００７ꎬ １９:
２７０－２８０.
[１６] Ｍｉｔｓｕｄａ Ｎꎬ Ｓｅｋｉ Ｍꎬ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ Ｏｈｍｅ ＴＭ. Ｔｈｅ
ＮＡＣ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ＮＳＴ１ ａｎｄ ＮＳＴ２ ｏｆ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｎｄ
ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｎｏｔｈｅｒ ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌꎬ ２００５ꎬ １７: ２９９３－３００６.
[１７] Ｚｈｏｎｇ Ｒꎬ Ｄｅｍｕｒａ Ｔꎬ Ｙｅ ＺＨ. ＳＮＤ１ꎬ ａ ＮＡＣ ｄｏ￣
ｍａｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｓｅｃ￣
ｏｎｄａｒｙ ｗａｌｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｆｉｂｅｒｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００６ꎬ １８: ３１５８－３１７０.
[１８] Ｙｏｏ ＳＹꎬ Ｋｉｍ Ｙꎬ Ｋｉｍ ＳＹꎬ Ｌｅｅ ＪＳꎬ Ａｈｎ ＪＨ. Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｃｏｌｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ａ ＮＡＣ￣
ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ ] . ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ
２００７ꎬ ２(７): ６３７－６４２.
[１９] Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｋꎬ Ｔｒａｎ ＬＰꎬ Ｎｇｕｙｅｎ ＤＶꎬ Ｆｕｊｉｔａ Ｍꎬ
Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋꎬ Ｔｏｄａｋａ Ｄꎬ Ｉｔｏ Ｙꎬ Ｈａｙａｓｈｉ Ｎꎬ Ｓｈｉ￣
ｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ￣Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ. Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌ￣
ｙｓｉｓ ｏｆ ａ ＮＡＣ￣ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＯｓＮＡＣ６ ｉｎ￣
ｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００７ꎬ ５１: ６１７ －
６３０.
[２０] Ｓａｂｌｏｗｓｋｉ ＲＷꎬ Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ ＥＭ. Ａ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ＮＯ
ＡＰＩＣＡＬ ＭＥＲＩＳＴＥＭ ｉｓ ａｎ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｆｌｏｒａｌ ｈｏｍｅｏｔｉｃ ｇｅｎｅｓ ＡＰＥＴＡＬＡ３ / ＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ[Ｊ] .
Ｃｅｌｌꎬ １９９８ꎬ ９２(１): ９３－１０３.
[２１] Ｌｉｕ ＹＺꎬ Ｂａｉｇ ＲＭＮꎬ Ｆａｎ Ｒꎬ Ｙｅ ＪＹ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＮＡＭꎬ ＡＴＡＦꎬ
ａｎｄ ＣＵＣ￣Ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐꎬ ２００９ꎬ ２７(３): ２９２－２９７.
[２２] Ｋａｌｉｖａｓ Ａꎬ Ｐａｓｅｎｔｓｉｓ Ｋꎬ Ａｒｇｌｒｉｏｕ Ａꎬ Ｄａｒｅｎｔａｓ Ｎꎬ
Ｔｓａｆｔａｒｉｓ ＡＳ. ＦａｍＲＣＡ￣ＲＡＣＥ: ａ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍ￣
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｃｅ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｃＤＮＡｓ ｉｎ ｏｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ
ＮＡＣ ｇｅｎｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｒｏｃｕｓ (Ｃｒｏ￣
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ｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ＮＡＰ￣ｌｉｋｅ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｃｒｏ￣
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ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅａｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ[ Ｊ] .
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ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ￣ＳＡＧ１１３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ｃ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｈａｉｎ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅ￣
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(责任编辑: 张 平)
８５２ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷