全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 3) : 259～261
Journal of Wuhan Botanical Research
喜树细胞悬浮培养中生理生化指标的测定
高桂珍, 周吉源
(华中师范大学生命科学学院, 武汉 430079)
摘 要: 以喜树(Camp totheca acuminata Decsne. )幼嫩叶片为材料,诱导和筛选愈伤组织,进行细胞悬浮培养。初步
研究了液体培养条件下光照对喜树细胞生长和生理生化特性的影响。结果显示: 在光照条件下培养细胞生长周期
30 d;在黑暗条件下培养细胞生长周期为 27 d, 细胞的增殖曲线呈“S”形;在两种不同光照条件下,其培养液 pH 值
先下降后回升; 培养细胞中可溶性蛋白质含量及过氧化物酶活性均出现两个峰值, 但出现的时间不同。
关键词: 细胞悬浮培养; 光照; 细胞生长; 喜树; 可溶性蛋白质; 过氧化物酶
中图分类号: Q945 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2003) 03-0259-03
Mensuration of Physiological and Biochemical Characters on the
Cell Suspension Culture of Camp totheca acuminata Decsne.
GAO Gui-Zhen, ZHOU Ji-Yuan
( Col leg e of L if e Sc iences, C entral China Normal Univ er si ty, Wuh an 430079, Chin a)
Abstract: With the young leaves o f Camp totheca acuminata Decsne. callus ar e induced and
screened, then establish the suspension cultures, the inf luences o f light on the cell grow th and
physiolog ical and biochemical characters are primar ily studied. The r esults are as fo llow s: When
Camp totheca acuminata Decsne. is cultured in the light and in the dar k, both of their cell grow th
curves are like “S”, but their growth circles are about 30 days and 27 day s respectively ; T he pH
of cultured mediums goes down at f irst , then goes up gradually ; so luble pro tein contents and per-
ox ides act iv it ies of cultured cell have tw o peaks, but they w er e on the dif ferent days.
Key words : Cel l suspension culture; L ight ; Cell gr ow th; Camp totheca acuminata Decsne. ; Solu-
ble protein; Pero xides
进行植物细胞大量培养以实现次级代谢产物的
工业化生产, 其中悬浮培养是一个重要环节,是顺利
过度到工业化生产的关键。喜树为珙桐科旱莲属植
物,是一种重要的木本抗癌药用植物。早在 20世纪
70 年代初 Sakato[ 1]等就进行了喜树的组织培养的
研究。但在国内对喜树细胞悬浮培养及生理生化特
性的研究还很少, 笔者运用不同的光照条件,探讨了
对喜树细胞悬浮培养中细胞生长和生理生化特性的
影响,为次生代谢产物工厂化生产提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 喜树愈伤组织的诱导
供试材料喜树 ( Camp totheca acum inata Dec-
sne. )取自华中师范大学校园。取喜树幼嫩叶片, 清
水洗净后,滤纸吸干, 70%酒精浸泡 30 s后用 0. 1%
HgCl2消毒 5 m in, 无菌水冲洗数遍, 切成0. 5 cm×
0. 5 cm 的小块, 接种于含 NAA 1. 0 mg/ L、2, 4-D
0. 5 mg / L、KT 0. 5 mg/ L 的 B5培养基上( pH5. 8,
收稿日期: 2002-09-09,修回日期: 2002-12-11。
作者简介: 高桂珍( 1977- ) ,女,硕士,发育植物学,从事植物组织培养的研究工作(E -mail : ggzccnu@ s ina. com. cn)。
通讯作者。
高压灭菌) ,于黑暗条件下诱导形成愈伤组织,培养
温度为( 25±2)℃。
1. 2 愈伤组织的培养及细胞悬浮培养
诱导出的愈伤组织接种于含 20 mL 固体培养
基(与诱导培养基相同)的 50 mL 三角瓶中, 每瓶接
种量约为 2 g ,愈伤组织每 30 d继代 1次, 经 3～5
次继代后,选择疏松的愈伤组织转入液体培养基中
培养,每 250 mL 三角瓶中分装100 mL 液体培养基
(同上的固体 B5 培养基去掉琼脂 ) , 转速为
120 r/ min, 分别置于黑暗和光照条件 ( 2 000 lx,
10 h/ d)下培养。
1. 3 鲜重的测定
接种后每隔 2 d取光照和黑暗条件下培养的悬
浮培养细胞, 经减压过滤至干后称其鲜重, 所称的重
减去接种重, 计算出悬浮培养细胞的生长量,绘出增
殖曲线。实验重复 3次,取其平均值。
1. 4 pH值的测定
悬浮细胞培养液 pH 值采用江苏电分析仪器厂
生产的 pHS-4智能酸度计直接测定。
1. 5 可溶性蛋白质含量的测定
用 Folin-酚试剂法[ 2]进行测定, 以小牛血清蛋
白作标准曲线,单位为 mg / g (鲜重)。
1. 6 过氧化物酶( POD)活性测定
在过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚
氧化,生成茶褐色物质,采用愈创木酚 [ 3, 4]测定, 单位
为 A 470min- 1g- 1 (鲜重)。
2 结果与讨论
2. 1 悬浮培养细胞的生长周期
在喜树细胞悬浮培养过程中, 分别置于黑暗和
光照条件下培养,以鲜重的增量( g/ d)为生长指标,
可以看到生长曲线呈“S”形, 并明显的分为 3个时
期:延迟期、指数期和静止期(见图 1)。
从图 1可以看出在光照条件下,其细胞生长速
度较快,生长周期也较长,为 30 d;而在黑暗条件下,
其生长速度较慢,生长周期较短,为27 d。郑光植、梁
峥[ 5]在三分三愈伤组织生长和生物碱含量的影响研
究中发现,光照能促进三分三愈伤组织的生长, 而黑
暗相对抑制细胞的生长。
从图 1还可以看出, 在延迟期( 0～9 d)日培养
物增重缓慢, 这可能是由于刚接种的细胞尚未完全
适应新的环境,不能很好的吸收营养物质。在指数期
( 9～21 d)日培养物增重迅速,而到静止期( 21～27
d)日鲜重的增加几乎停止。这是由于培养基中养分
几乎耗尽,不能提供营养物质。因此,培养细胞的最
佳收获期为 27 d。
图 1 喜树细胞悬浮培养过程中鲜重的变化
Fig . 1 T he changes o f cell yield dur ing cell suspension
cult ur e of Camp totheca acuminata Decsne.
2. 2 培养液 pH的变化
在两种不同条件下, 其培养液pH值变化如图2。
从图 2可以看出,在培养细胞生长周期中培养
液pH 值也发生了变化。最初 3 d 有所下降, 尔后又
回升。这与九连小蘖和人参悬浮培养细胞培养液pH
值变化相似[ 6, 7] , 这可能与不同离子的利用和新物质
的形成有关。
图 2 喜树细胞悬浮培养过程中培养液 pH 值的变化
F ig . 2 T he changes o f pH values o f cultured of
mediums dur ing cell suspension cultur e Camp totheca
acuminata Decsne .
2. 3 可溶性蛋白质含量的测定
蛋白质是细胞中重要组成成分, 在细胞生命活
动中起着重要作用。随着悬浮培养细胞的生长、分裂
和分化, 细胞中可溶性蛋白质含量也发生一定的变
化。在光照和黑暗条件下,培养细胞中可溶性蛋白质
含量变化如图 3。
由图 3可以看出,在光照和黑暗条件下可溶性
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蛋白质含量均有两个峰值, 分别在第 12 d 和第
21 d。这与杨和平等关于马唐及其它植物中的愈伤
组织增殖过程中的结果一致 [ 8, 9]。可溶性蛋白质含量
峰值的高低及出现的时间不同, 可能与各自条件下
细胞生长速度等因素有关, 也可能与蛋白质的合成、
分泌、利用及细胞分裂有关。
图 3 喜树细胞悬浮培养过程中可溶性蛋白质含量的变化
Fig . 3 T he changes o f soluble pr o tein dur ing cell
suspension cultur e o f Camp totheca acuminata Decsne.
2. 4 悬浮培养过程中过氧化物酶活性的变化
过氧化物酶是一类与生长、分化密切相关的酶。
随着悬浮培养细胞的生长、分裂和分化,培养细胞在
光照和黑暗条件下过氧化物酶活性发生相应的变化
(图 4)。
图 4 喜树细胞悬浮培养中过氧化物酶活性的变化
F ig . 4 T he changes of POD activit ies dur ing cell
suspension cultur e o f Camp totheca acuminata Decsne.
从图 4可以看出在黑暗和光照条件下, 其过氧
化物酶活性也有两个峰值。在光照条件下, 两个峰
值分别出现在第 3 d和第 15 d;在黑暗条件下,两个
峰值分别出现在第 3 d和第 18 d。Galtson等人[ 10]认
为损伤能使合成该酶的基因抑制被解除, Ridge 等
人[ 11]则认为损伤使过氧化物酶合成抑制物渗漏, 导
致酶活性增强, 这与我们实验中接种初期酶活性上
升相一致。另外也与可溶性蛋白质含量变化相似, 也
与细胞的生长和分化程度有关。
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