全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 658666 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本文由国家自然科学基金项目 (31401419), 湖南省教育厅优秀青年项目 (13B051), 国家高技术研究发展计划 (863计划 )项目
(2011AA10A104, 2012AA101107)和湖南省作物种质资源与创新利用重点实验室科学基金开放项目(11KFXM08)资助。
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401419), Outstanding youth project of Hunan Provincial
Education Department (13B051), the National High Technology Research and Development Program of China (2011AA10A104,
2012AA101107), and Science Foundation of Hunan Provincial Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization in Crop
(11KFXM08).
* 通讯作者(Corresponding author): 官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com
第一作者联系方式: E-mail: ttl205@aliyun.com
Received(收稿日期): 2015-11-13; Accepted(接受日期): 2016-03-02; Published online(网络出版日期): 2016-03-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1605.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00658
甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和
功能鉴定
谭太龙 冯 韬 罗海燕 彭 烨 刘睿洋 官春云*
湖南农业大学农学院 / 国家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南长沙 410128
摘 要: 磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipids:diacylglycerol acyltransferase, PDAT1)是植物三酰甘油(triacylgly-
cerol, TAG)合成的关键酶。本文在甘蓝型油菜湘油 15号 cDNA中克隆到 3个 PDAT1全长编码序列(coding sequence,
CDS), 经比对分别定位于 A02、A10、C09染色体, 分别命名为 BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和 BnPDAT1- C09, 其
序列长分别为 1998、2002和 2005 bp, 各自编码 665、666、667个氨基酸。预测 BnPDAT1基因编码蛋白定位于细胞
质膜, 具有典型的 PDAT1保守结构域。多序列比对和进化分析表明, BnPDAT1基因编码蛋白与甘蓝、拟南芥、亚麻
芥 PDAT1蛋白具有较高的同源性。酵母互补实验证实, 该基因编码蛋白具有 PDAT1酶活性。BnPDAT1基因在湘油
15号中的表达现先上升后降低趋势, 在开花后 25~30 d达最大值, 但 3个拷贝的表达变化规律存在差异。
关键词: 甘蓝型油菜; 磷脂二酰甘油酰基转移酶; 基因克隆; 酵母互补实验
Cloning and Characterization of Phospholipids:Diacylglycerol Acyltransferase
(BnPDAT1) cDNA from Brassica napus L.
TAN Tai-Long, FENG Tao, LUO Hai-Yan, PENG Ye, LIU Rui-Yang, and GUAN Chun-Yun
College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan, Changsha 410128, China
Abstract: Phospholipids:diacylglycerol acyltransferase (PDAT1) is a key enzyme in triacylglycerol (TAG) biosynthesis of plants.
In this study, three novel PDAT1 coding sequences (CDSs) were isolated from cDNA of Brassica napus L. cv. Xiangyou 15 seeds,
which were mapped to the chromosomes A02, A10, and C09, and designated as BnPDAT1-A02, BnPDAT1-A10, and
BnPDAT1-C09, respectively. Three BnPDAT1 CDSs were 1998, 2002, and 2005 bp in length and encoded predicted proteins with
665, 666, and 667 amino acid residues, respectively. BnPDAT1 proteins were predicted to be located on the cell membrane and
have a typical PDAT1 conserved domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that the deduced amino
acid sequences of BnPDAT1 were highly homologous to previously reported PDAT1 in Brassica oleracea, Arabidopsis thalian,
and Eruca sativa. Furthermore, the catalytic enzyme activity of the cloned BnPDAT1 genes was confirmed by the yeast comple-
mentary experiment. The expression level of BnPDAT1s increased gradually in seed development and reached the maximum from
25 to 30 days after flowering. However, three BnPDAT1 copies were also found to be different in expression pattern.
Keywords: Brassica napus L; PDAT1; Gene clone; Yeast complementary experiment
甘蓝型油菜通过不同途径合成三酰甘油(triacy-
lglycerol, TAG)并形成油体储藏于种子中, 这种储藏
油脂是我国最重要的油料来源之一, 对于保证食用
油供给十分重要。我国生产的甘蓝型油菜含油量为
第 5期 谭太龙等: 甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定 659
40%左右 , 与加拿大等发达国家尚具较大差距 , 提
高菜籽含油量可明显提高我国油菜的市场竞争力 ,
产生可观的社会效益[1]。因此, 研究甘蓝型油菜种子
中 TAG合成与积累具有重要的意义。
植物油脂代谢具有高度的生物学复杂性, 如拟
南芥的油脂代谢网络涉及600多个基因[2], 多个基因
影响TAG的合成量。植物TAG合成分为脂肪酸链形
成和TAG组装2个过程, 其中TAG组装量直接决定植
物种子TAG的总量。植物以三磷酸甘油(sn-glycerol-
3-phosphate, G3P)为骨架, 以脂肪酸(fatty acid, FA)
为底物通过一系列酶促反应合成TAG有两种途径。
其一 , Kennedy途径 , 以甘油 -3-磷酸酰基转移酶
(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)、溶血
磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltrans-
ferase, LPAAT)、磷脂酸酯酶 (phosphatidate phos-
phatase, PAP)和二脂酰甘油酰基转移酶 (diacylg-
lycerol acyltransferase, DGAT)连续催化合成TAG[3];
其二 , 不依赖脂酰-CoA的合成途径(即PDAT途径),
以磷脂二酰甘油酰基转移酶 (phospholipids:diacyl-
glycerol acyltransferase, PDAT) 催 化 二 酰 甘 油
(diacylglycerol, DAG)与磷脂(phospholipids, PC)反应
合成TAG与溶血磷脂(lyso-phospholipids, LPC)。两条
途径对植物种子油脂累积具有重要的生理作用, 直
接影响TAG合成的关键酶分别是DGAT与PDAT。
PDAT途径最早发现于酿酒酵母 [4], 并证实PDAT对
于酵母TAG合成的贡献。以酵母PDAT为探针在拟南
芥中获得 2个 PDAT基因At5g13460 (AtPDAT1)和
At3g44830 (AtPDAT2), 对AtPDAT1的功能研究显示
了其PDAT酶活性, 能催化不同链长的酰基转移, 尤
其是对多双键、环氧化以及羟化酰基具有偏好性 ,
显示了PDAT在拟南芥TAG合成中的重要作用 [5]。
PDAT途径在甘蓝型油菜TAG合成中的贡献尚未得
到充分研究, 克隆甘蓝型油菜PDAT基因并进行功能
解析, 将促进油菜TAG合成路径的完善以及高含油
油菜育种的进程。本文通过拟南芥AtPDAT1基因序
列设计引物, 从甘蓝型油菜品种湘油15号中克隆获
得3个PDAT拷贝, 并对其BnPDAT1进行酵母互补功
能验证, 证实BnPDAT1参与TAG合成, 具备PDAT功
能活性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝型油菜双低品种湘油15号由国家油料改
良中心湖南分中心提供。用于异源表达分析的野生
酵母 INVSc1及用于 PDAT1基因功能鉴定的三酰甘
油(TAG)合成缺陷酵母菌株 H1246 由徐荣华博士(中
国科学院西双版纳热带植物园)惠赠。
1.2 RNA提取与 cDNA合成
在 22℃、光周期为 16 h/8 h条件下培养湘油 15
号至 2片真叶, 取幼苗 50~100 mg。加液氮充分研磨
后, 使用 TRIzol RNA提取试剂盒(TransGen生物技
术有限公司 )按其说明书方法提取总 RNA, 以此
RNA 为模板合成第 1 链 cDNA, 参见 Easy Script
First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试 剂 盒
(TransGen生物技术有限公司)说明书合成 cDNA。
1.3 BnPDAT1基因的克隆及序列分析
从拟南芥数据库(http://www.arabidopsis.org/)获
取 AtPDAT1基因序列。使用 Bioinformatics at Geboc
数据库(http://www.bioyq.com/blast/blast.php) “Regular
Blast”进行检索 , 获得白菜 (AA)和甘蓝 (CC)的
PDAT1基因序列以及甘蓝型油菜已知的 EST序列。
用 Vector软件拼接获得油菜 EST序列, 并与白菜和
甘蓝 PDAT1 基因序列比对。分析比对结果, 在 5端
选取一致性较好的区域, 设计含起始密码子的 5端
引物 , 同法设计一段含有终止密码子的 3端引物 ,
合 成 备 用 。 设 计 的 引 物 序 列 为 BnPDAT1-F:
5-ATGCCCCTTTTTCAGCGGAAAAAGC-3; BnPD
AT1-R: 5-TCACAGCTTCAAGTCAATACGCTCA-3。
以 1.2所述 cDNA为模板进行 PCR扩增。PCR体系
含 50 ng μL–1模板 1 μL、10 mmol L–1 dNTPs 0.5 μL、
2 μmol L–1 BnPDAT1-F 0.75 μL、 2 μmol L–1
BnPDAT1-R 0.75 μL、10×反应缓冲液 1 μL、HiFi高
保真 DNA聚合酶 0.5 μL和 ddH2O 15.5 μL。程序为
预变性 95℃ 5 min, 95℃ 50 s, 58℃ 45 s, 72℃ 3
min, 35个循环, 72℃后延伸 10 min。PCR产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶成像系统(Bio-Rad)检测和
记录结果。将 PCR 产物回收后与 pMD18-T 载体
(TransGen 生物技术有限公司)连接, 转化大肠杆菌
感受态细胞 Trans1-T1 (北京天根生化有限公司), 筛
选阳性克隆进行基因测序。通过 BRAD 数据库
(http://brassicadb.org/brad/)对获得的克隆序列进行
染色体步移分析。使用 DNAman 对克隆获得的
PDAT1基因全长 CDS序列进行序列比对。
1.4 BnPDAT1蛋白生物信息学分析
1.4.1 BnPDAT1氨基酸序列特征与二级结构预测
通过 ANTHEPROT 6.2 软件分析来源于甘蓝型
660 作 物 学 报 第 42卷
油菜的 PDAT1拷贝所编码的蛋白质。统计编码蛋白
的氨基酸残基组分、分析编码蛋白的等电点、信号
肽序列和亲疏水特征并使用 Gariner 模型预测二级
结构。使用 PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html)进行
亚细胞定位预测。
1.4.2 BnPDAT1 蛋白同源结构域分析 使用
DNAman对BnPDAT1蛋白进行同源比对分析; 同时
使用 NCBI在线软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分
别对不同的 BnPDAT1 蛋白序列进行保守结构域分
析; 使用 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)及
InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析 BnPDAT1
包含的特殊结构域。
1.4.3 PDAT1蛋白聚类分析 通过 NCBI蛋白数
据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)、String 数
据库(http://string.embl.de/)、PDB数据库(http://www.
pdb.org/pdb/home/home.do)检索来源于不同物种的
PDAT1 相关蛋白序列, 并使用 MEGA5.0 对来源不
同的 PDAT1相关蛋白进行聚类分析。
1.5 BnPDAT1基因的酵母互补功能验证
1.5.1 酵母表达载体构建、转化与酵母培养 将
获得的 BnPDAT1 基因与 HA 标签基序融合连接
PYES2.0 载体, 用氯化锂法转化到酵母菌株 H1246
[酵母突变体 H1246中编码 TAG合成的 DGA1 (编码
DGAT)和 LRO1 (编码 PDAT)以及编码固醇脂合成的
基因 ARE1 和 ARE2 都被敲除了, 因此 H1246 不能
合成中性油脂, 且 H1246 不能形成油体][6], 同时将
对照质粒(未连接 BnPDAT1 基因的 PYES2.0 载体)
转化入酵母菌株 H1246和 INVSc1。
参考徐荣华等[7]的方法培养酵母, 将转 BnPDAT1
基因的酵母(H1246)及转对照质粒的酵母(H1246 与
INVSc1)在尿嘧啶缺陷的合成完全培养基(synthetic
minimal defi ned medium lacking uracil, SC-U)抑制
培养基(2%葡萄糖)中 220转min–1、30℃过夜培养, 以
紫外分光光度计测 OD600 后 , 离心收集菌体 , 用
SC-U诱导培养基(2%半乳糖)重悬菌体至 OD600 = 0.4,
在 220转min–1、30℃条件下培养, 诱导表达培养 36 h,
收集备用。
1.5.2 BnPDAT1 基因在酵母中的表达分析 使
用 TRIzol RNA提取试剂盒(TransGen生物技术有限
公司)分别提取转 BnPDAT1基因酵母(H1246)及转对
照质粒酵母的总 RNA, DNaseI消化后以 1.5%甲醛变
性琼脂糖凝胶电泳检测 , 分别根据克隆到的
BnPDAT1 基因设计特异性引物, 以 RT-PCR 检测目
的基因的表达。
1.5.3 转 BnPDAT1基因酵母的蛋白印迹分析
参考 Isola 等[8]的方法提取转 BnPDAT1 基因和
空载体的酵母总蛋白, 用于蛋白印迹分析。参照鲁
少平等[9]的方法进行 Western blot。一抗使用 HA标
签抗体, 从山羊中提取获得, 二抗使用小鼠抗山羊
抗体, ECL发光检测。
1.5.4 转 BnPDAT1 基因酵母的油脂薄层层析(thin-
layer chromatography, TLC) 使用液氮反复冻融
并研磨破碎酵母细胞, 使用正己烷∶异丙醇(3∶2)
法[10]提取酵母油脂进行 TLC分析, 分析不同酵母菌
株中三酰甘油(TAG)、游离脂肪酸(FFA)和二酰甘油
(DAG)的合成。
1.6 甘蓝型油菜中 BnPDAT1基因时空表达分析
以 1.2方法提取甘蓝型油菜湘油 15号不同时期
的种子、根、叶、花和角果皮总 RNA, 按照宝生物
的 PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser
(Perfect Real-time)试剂盒说明进行反转录 , 获得
cDNA 第 1 链作为 qRT-PCR 模板。仔细分析 1.3 中
克隆获得的 BnPDAT1片段, 从 BRAD数据库中获得
其上下游非翻译区(untranslated region, UTR), 根据
BnPDAT1 各拷贝 UTR 特点设计分型引物 , 以
UBC21 作为内参基因[11], 用于 BnPDAT1 的时空表
达分析, 每样品进行 3 次重复。在 ABI7500 荧光定
量 PCR 系统上运行 qRT-PCR。PCR 体系包含 1 μL
cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green-
Master with ROX、10 μmol L–1正向引物和反向引物
各 0.5 μL、8 μL ddH2O。PCR程序为 95℃ 10 min; 95
℃ 15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 32 s, 35个循环。反应完成
后绘制 95℃ 20 s, 60℃ 20 s, 95℃ 20 s, 59℃ 20 s
熔解曲线, 检测扩增产物的正确性和引物二聚体。
2 结果与分析
2.1 BnPDAT1基因全长 CDS序列的克隆
以湘油 15 号 cDNA 为模板, 克隆到 3 个 CDS
序列, 长度分别为 1998、2002和 2005 bp, 分别定位
于 A02、A10和 C09染色体, 分别命名为 BnPDAT1-
A02、BnPDAT1-A10 和 BnPDATI-C09。通过 BRAD
数据库比对, 确认 3 个 CDS 序列的完整性, 并以 3
条CDS的共同序列作为模板对BRAD数据库进行检
索, 未发现更多 PDAT1同源序列。通过 DNAman多
序列比对发现 , BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10 和
BnPDATI-C09 相似度为 95.29%, 显示了所克隆的
PDAT1 拷贝在进化上的高度同源性, 也体现了甘蓝
型油菜基因组异源多倍性的特点。
第 5期 谭太龙等: 甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定 661
2.2 BnPDAT1生物信息学分析
BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和 BnPDATI-C09
基因各自编码长度 665、666、667 氨基酸残基的蛋
白, 分别命名为 BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10 和
BnPDATI-C09。这 3个预测的 BnPDAT1蛋白的氨基
酸组成、摩尔质量、比体积和等电点见表 1。
亲疏水性分析显示, BnPDAT1 蛋白疏水区域分
布比较均衡, 疏水性氨基酸多于亲水性氨基酸, 且
N端有明显的亲水区域。未发现 BnPDAT1具信号肽
序列, 暗示其不存在跨膜转运, 其合成与功能定位
处于相同的亚细胞结构域。PSORT亚细胞定位预测
显示, BnPDAT1被定位于质膜的可信度为 0.790, 显
示 BnPDAT1是一种膜锚定蛋白。
BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10 和 BnPDAT1-
C09 的二级结构预测结果如图 1, BnPDAT1-A02 具
44% α螺旋, 30% β折叠, 13% β转角, 13%无规卷曲;
BnPDAT1-A10 相应的比例为 33%、21%、24%和
22%; BnPDAT1-C09相应的比例为 33%、21%、24%
和 22%。
通过 SMART 分析发现, BnPDAT1 蛋白在结构
上都具有相似序列特征和相近排布位置的一个低复杂
度区域(LCC)和一个跨膜结构域(TM), 如表 2所示。
表 1 BnPDAT1蛋白信息汇总表
Table 1 Summary of the deduced BnPDAT1 proteins
蛋白编号
Serial number
氨基酸残基数
Number of amino acid residues
摩尔质量
Molar mass (Da)
等电点
Isoelectric point
BnPDAT1-A02 665 73 536.425 6.625
BnPDAT1-A10 666 73 751.473 6.065
BnPDAT1-C09 667 73 947.568 5.955
图 1 BnPDAT1蛋白二级结构
Fig. 1 Secondary structure of BnPDAT1
表 2 BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和 BnPDAT1-C09蛋白特殊结构汇总表
Table 2 Summary of specific region of BnPDAT1-A02, BnPDAT1-A10, and BnPDAT1-C09
蛋白编号
Serial number
N末端
N-terminus
序列
Sequence
C末端
C-terminus
结构类型
Domain type
蛋白长度
Length (aa)
BnPDAT1-A02 7 KKPPPPEKPSEDLPEDDD 24 LCC 18
BnPDAT1-A02 49 CWFIGCVCLTWWFLLFLYNAMPA 71 TM 23
BnPDAT1-A10 7 KKPPSPPPEDLPDDDDDPQKKSHHHKKS 34 LCC 28
BnPDAT1-A10 48 SCCWFIGCVCVTWWFLLFLYNAM 70 TM 23
BnPDAT1-C09 7 KKPPSSPSEDLPDDDDDDPQKKSHHHKKS 35 LCC 29
BnPDAT1-C09 49 SCCWFIGCVCVTWWFLLFLYNAM 71 TM 23
同源比对(图 2)发现, BnPDAT1蛋白存在 4段保
守的 α/β水解酶折叠区(α/β HF)。通过 NCBI数据库
检索发现, BnPDAT1蛋白在 100 (N末端)~300 (C末
端)区间内符合 PLN02733 超家族特征; 全长序列基
本符合 PLN02517 超家族特征 , PLN02733 与
PLN02517 均为磷脂酰胆碱酰基转移酶超家族, 因
此预测, BnPDAT1 具有酰基转移功能, 这与报道的
PDAT1蛋白功能一致。
通过不同数据库, 共获得 30种来源于不同植物
的 PDAT1相关蛋白序列, 聚类分析结果如图 3。
662 作 物 学 报 第 42卷
图 2 BnPDAT1氨基酸序列比对
Fig. 2 Comparison of the amino acid sequences of BnPDAT1
第 5期 谭太龙等: 甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定 663
图 3 不同植物 PDAT1蛋白的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of PDAT1 in different plant species
Cs: 亚麻芥; At: 拟南芥; Br: 甘蓝; Bn: 甘蓝型油菜; Th: 醉蝶花; Si: 芝麻; Csi: 橙子; Gm: 大豆; Jc: 麻风树; Rc: 蓖麻; Fv: 野草莓;
Co: 油茶; Nn: 荷花; St: 马铃薯。
Cs: Camelina sativa; At: Arabidopsis thaliana; Br: Brassica rapa; Bn: Brassica nupas; Th, Tarenaya hassleriana; Si: Sesamum indicum;
Csi: Citrus sinensis; Gm: Glycine max; Jc: Jatropha curcas; Rc: Ricinus communis; Fv: Fragaria vesca; Co: Camellia oleifera; Nn: Nelumbo
nucifera; St: Solanum tumerosum.
PDAT1相关蛋白聚类上分为单、双子叶 PDAT1
以及单、双子叶 PDAT1类似蛋白 4大类, PDAT1蛋
白在单双子叶植物之间有较远的遗传距离。
BnPDAT1 与甘蓝、拟南芥、亚麻芥 PDAT1 蛋白具
有较高的同源性。PDAT1及相关蛋白在进化树中的
位置与相对应的物种进化上的位置比较一致, 显示
PDAT1蛋白在起源上可能比较古老。
2.3 BnPDAT1基因的酵母互补功能验证
2.3.1 BnPDAT1 基因在酵母中正常表达 RT-PCR
分析结果 (图 4)显示在转基因酵母 (H1246)中 ,
BnPDAT1 基因正常编码了 mRNA, 而对照组酵母菌
株(转空载体的 H1246 和 INVSc1)中无 BnPDAT1 基
因编码的 mRNA表达。
图 4 转基因酵母菌株的 RT-PCR检测
Fig. 4 RT-PCR analysis of transgenic yeast
M: 2k DNA分子量参照; 1: H1246转 PYE+BnPDAT1-A02; 2:
H1246转 PYE+BnPDAT1-A10; 3: H1246转 PYE+BnPDAT1-C09;
4: H1246转 PYE; 5: INVSc1转 PYE。
M: 2k DNA marker; 1: H1246 transformed with
PYE+BnPDAT1-A02; 2: H1246 transformed with
PYE+BnPDAT1-A10; 3: H1246 transformed with
PYE+BnPDAT1-C09; 4: H1246 transformed with PYE;
5: INVSc1 transformed with PYE.
664 作 物 学 报 第 42卷
2.3.2 转 BnPDAT1基因酵母合成 BnPDAT1蛋白
蛋白印迹 (Western blot)结果 (图 5)显示 , 转
BnPDAT1 基因的酵母中均有 BnPDAT1 蛋白表达,
转空载体的酵母中未发现 BnPDAT1蛋白。
2.3.3 BnPDAT1 基因恢复酵母突变体(H1246)油脂
合成能力 转 BnPDAT1 基因酵母总油脂 TLC 分
析(图 6)发现, BnPDAT1基因恢复酵母H1246的 TAG
合成能力, 显示 BnPDAT1基因在油脂合成中发挥作
用。转空载体的 H1246菌株相对其他菌株有高得多
的 DAG含量, 转入 BnPDAT1之后 DAG含量明显降
低, TAG含量明显上升, 显示 BnPDAT1能催化 DAG
合成 TAG。
图 5 转基因酵母菌株中 BnPDAT1蛋白的表达
Fig. 5 Expression of BnPDAT1 in transgenic yeast
1: H1246转 PYE+BnPDAT1-A02; 2: H1246转
PYE+BnPDAT1-A10; 3: H1246转 PYE+BnPDAT1-C09;
4: H1246转 PYE; 5: INVSc1转 PYE。
1: H1246 transformed with PYE+BnPDAT1-A02; 2: H1246 trans-
formed with PYE+BnPDAT1-A10; 3: H1246 transformed with
PYE+BnPDAT1-C09; 4: H1246 transformed with PYE;
5: INVSc1 transformed with PYE.
图 6 转基因酵母的油脂 TLC层析
Fig. 6 TLC analysis of lipid in complementation quadruple
mutant strain H1246
TAG: 三酰甘油; FFA: 自由脂肪酸; DAG: 二脂酰甘油。
TAG: triacylglycerol; FFA: free fat acid; DAG: diacylglycerol.
2.4 甘蓝型油菜中 BnPDAT1时空表达特征
为进一步了解 BnPDAT1 在甘蓝型油菜中的功
能, 对甘蓝型油菜不同时期、不同组织中 BnPDAT1
表达进行了分析 , BnPDAT1 的分型定量引物为 :
BnPDAT1-A02-F: 5-TGAATGGTCTGAGCGTATT-3;
BnPDAT1-A02-R: 5-CCATGATGATGATCTCTCTTG-
3; BnPDAT1-A10-F: 5-GAATGGTCAGAGCGTATT
G-3; BnPDAT1-A10-R: 5-TGATGATGATGATGATG
AGC-3; BnPDAT1-C09-F: 5-GAATGGTCAGAGCG
TATTG-3; BnPDAT1-C09-R: 5-CGTGGAAGCAATA
AGTTCA-3; 内参引物为 BnUBC21-F: 5-CCTCTGC
AGCCTCC TCAAGT-3; BnUBC21-R: 5-TATCTCCC
CTGTCTTGAAATGC-3。处于种子不同发育时期的
湘油 15 号不同器官组织中 BnPDAT1 3 个拷贝表达
状况如图 7所示。
图 7 种子不同发育时期种子、叶和花中 BnPDAT1的相对
表达量
Fig. 7 Relative quantity of BnPDAT1 expression in seeds, leaf,
and flower
DAP: days after pollination.
湘油15号种子中BnPDAT1的表达量随种子发育
表现先升高后降低的趋势, 在授粉后25~30 d表达量
达到最大值; 但BnPDAT1各拷贝的表达变化规律有
一定差异, 在授粉25 d后的种子中BnPDAT1-A10和
授粉30 d后种子中的BnPDAT1-A02几乎不表达, 同
时与之对应的另外 2个拷贝高表达 , 这暗示
BnPDAT1的表达可能具有整体调控的特点, 需要进
一步对不同品种(系)的油菜中BnPDAT1表达特征进
行分析验证。2个拷贝表达特点在多个不同含油量材
料中同样存在(未发表)。湘油15号花、叶片、种子中
均有BnPDAT1表达, 但叶片中BnPDAT1-A10表达量
极低。BnPDAT1蛋白催化PC与DAG合成TAG, 在油
菜发育过程中, 尤其是种子发育与油脂储存的过程
中发挥重要功能, BnPDAT1在种子发育过程中的表
达先上调后下调, 与种子发育过程中TAG积累模式
相吻合 , 种子发育中期快速合成和积累TAG, 在种
子发育后期TAG存储渐渐饱和, TAG合成量下调。
BnPDAT1在花、叶中表达水平低于种子油脂合成期,
与种子发育初期表达水平相当, 也显示了BnPDAT1
是一种TAG合成的关键酶, 在花、叶中存在的大量非
TAG合成的脂质代谢活动并不能触发BnPDAT1的大
量表达。
3 讨论
从甘蓝型油菜中克隆获得 3个 BnPDAT1基因拷
贝, 各自编码的 BnPDAT1蛋白的生物信息学分析显
示其具有 PDAT功能结构域, 与甘蓝 BrPDAT1蛋白
第 5期 谭太龙等: 甘蓝型油菜磷脂二酰甘油酰基转移酶(BnPDAT1) cDNA的克隆和功能鉴定 665
和拟南芥 AtPDAT1蛋白均具有较高同源性。通过酵
母互补实验证实 BnPDAT1基因参与 TAG合成过程,
能够恢复中性油脂合成缺陷型酵母的 TAG合成与油
体形成, 说明所克隆的 BnPDAT1 基因具有 TAG 合
成功能。
对 PDAT 及其相似蛋白的聚类分析显示了
PDAT蛋白在进化上较高的保守性, 3个 BnPDAT1拷
贝分别与 2个不同的甘蓝 BrPDAT1拷贝具有高度同
源性, BnPDAT1-A10与BnPDAT1-C09处在进化树同
一低阶分支位置, BnPDAT1-A02 则处在进化树更高
一节点的同一分支位置, 这显示了甘蓝型油菜 A、C
亚基因组在进化关系上仍然具有较高的同源性, 也
间接证实“禹氏三角”中白菜与甘蓝的近缘关系[12]。
预测 BnPDAT1 蛋白被定位于细胞质膜 , 这与
PDAT1 催化 PC 和 DAG 反应生产 TAG 的过程发生
于内质网[13]相吻合, 表明油菜中 BnPDAT1 蛋白合
成和修饰过程发生在内质网, 随后锚定到内质网内
膜发挥功能。
本文通过酵母互补实验, 验证了 BnPDAT1能发
挥TAG合成酶功能, 恢复缺陷型酵母的TAG合成能
力, 这与酵母内源 PDAT蛋白在 TAG合成中的作用
一致, PDAT 途径被认为是酵母 TAG 合成的辅助途
径 [14], 而单独转入 BnPDAT1 即可恢复缺陷酵母
TAG 合成表型, 显示了 BnPDAT1 蛋白能独立合成
TAG, 也暗示了 BnPDAT1 可能在逆境状态下合成
TAG过程中发挥重要功能。
对植物 PDAT 蛋白研究显示了其高度的底物偏
好性, PDAT对环烷化、羟化以及含多双键底物具有
高效催化作用[15]。同样 BnPDAT1 蛋白的合成与表
达可能存在明显的组织特异性, 催化 TAG合成中的
作用可能因底物类型、丰度和合成部位差异而明显
不同, BnPDAT1对 TAG甘油骨架中 sn-2、sn-3位置
的脂肪酸链结构和类型的影响尚待进一步研究, 这
对于油菜品质育种将是一个新的方向。
TAG 合成是影响甘蓝型油菜产量和菜籽油质量
的最关键因素, 研究甘蓝型油菜 TAG合成、积累规
律 , 对于指导油菜育种与生产具有重要意义。而
BnPDAT1 被证实可参与 TAG 合成 , 可能在油菜
TAG合成网络中占有重要地位, 对 BnPDAT1基因的
深入研究具有重大的科研和社会价值。本文克隆获
得的 BnPDAT1有 3个拷贝, 分别定位在 A02、A10、
C09 染色体上, 进化上分别来源于白菜和甘蓝, 序
列相似性超过 95%, 这显示 PDAT 基因起源较早且
保守, 在原始的芸苔属植物中即已存在且具有重要
功能。但具有不同含油量水平的油菜中 BnPDAT1
基因的拷贝状态尚需研究, 以进一步证实 PDAT 途
径在油菜 TAG合成中的作用。同样湘油 15号中克隆
所得 BnPDAT1的 3个拷贝在生长发育过程中的调控
模式和各自对 TAG合成量的贡献尚需进一步研究。
4 结论
从甘蓝型油菜湘油 15 号 cDNA 中克隆到 3 个
PDAT1全长编码序列(coding sequence, CDS), 被分
别定位于 A02、A10、C09 染色体 , 并命名为
BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和 BnPDAT1-C09, 其
序列长分别为 1998、2002、2005 bp, 各自编码 665、
666 和 667 个氨基酸残基。该基因编码蛋白与其他
植物 PDAT1 具有较高相似度, 具有典型的 PDAT1
结构域, 具有 PDAT1酶活性。
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