全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(12): 18191827 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-16)和黑龙江省农业科技创新工程项目(QN015)资助。
This study was supported by the Modern Agro-industry Technology System (CARS-16) and the Agricultural Science and Technology Innova-
tion Program of Heilongjiang Province (QN015).
* 通讯作者(Corresponding authors): 王志英, E-mail: zyw0451@sohu.com, Tel: 13069873855; 张匀华, E-mail: yhzhang9603@126.com,
Tel: 13603639603
第一作者联系方式: E-mail: maligong0@163.com, Tel: 13644577229
Received(收稿日期): 2015-04-20; Accepted(接受日期): 2015-07-20; Published online(网络出版日期): 2015-08-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150811.1728.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01819
向日葵病程相关蛋白 HaPR1基因的克隆与功能
马立功 1,2 张匀华 2,* 孟庆林 2 石凤梅 2 刘 佳 2 李易初 2 王志英 1,*
1东北林业大学林学院, 黑龙江哈尔滨 150040; 2黑龙江省农业科学院植物保护研究所, 黑龙江哈尔滨 150086
摘 要: 病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)经常被用作植物抗病反应的分子标记。本文在核盘菌诱导向日葵
转录组文库的基础上克隆 1个病程相关蛋白 1基因 HaPR1的 cDNA全长序列, 并进行了表达模式和功能分析。结果
表明, 该基因 cDNA全长开放阅读框为 489 bp, 编码 162个氨基酸, 分子量为 17.52 kD, 等电点为 8.19, 具有 6个保
守半胱氨酸, 4个保守的 allergen V5/Tpx-1结构域, GenBank登录号为 KR071874。经比较 HaPR1与多种物种 PR1高
度同源。实时荧光定量 PCR检测结果表明, HaPR1相对表达量在向日葵叶中最高, 根中其次, 茎中最低。干旱、盐、
草酸、核盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草, 提高了转基因株系对核盘菌
的抗性。对抗性株系烟草防御酶活性及丙二醛含量测定发现转基因烟草叶片在核盘菌胁迫下显著提高了 SOD、POD
和 CAT活性, 降低了 MDA含量。初步推断 HaPR1具有抗核盘菌的功能。
关键词: 向日葵; 病程相关蛋白 1; 基因克隆; 功能分析
Cloning and Function Analysis of Pathogenesis Related Protein Gene HaPR1
from Sunflower (Helianthus annuus)
MA Li-Gong1,2, ZHANG Yun-Hua2,*, MENG Qing-Lin2, SHI Feng-Mei2, LIU Jia2, LI Yi-Chu2, and WANG
Zhi-Ying1,*
1 College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2 Institute of Plant Protection, Heilongjiang Academy of Agricultural
Sciences, Harbin 150086, China
Abstract: Pathogenesis-related proteins are commonly used as markers of plant defense responses. The full-length cDNA of
pathogenesis-related protein 1 (PR1) named HaPR1 in Helianthus annuus was cloned based on the transcriptome of H. annuus
induced by Sclerotinia sclerotiorum, and its expression model and function were analyzed in this study. Sequence analysis showed
that the cDNA of HaPR1 (GenBank accession No. KR071874) contained a 489 bp ORF encoding a protein of 162 amino acids
residues with the molecular mass of 17.52 kD and theoretical pI of 8.19, HaPR1 possessed six conserved cysteine and four con-
served allergen V5/Tpx-1 related domain. The HaPR1 was highly homologous with PR1 in other species. Real-time PCR analysis
showed that expression level of HaPR1 was the highest in leaf, and was significantly induced by drought, salt stress, oxalic acid, S.
sclerotiorum and its metabolites. Then the HaPR1 gene was transformed into tobacco by Agrobacterium tumefaciens to further
verify its function. The results showed that the expression of HaPR1 improved the resistance of transgenic lines, and significantly
increased SOD, POD, and CAT activities and reduced the content of MDA. It suggested that HaPR1 has a function of resistance to
S. sclerotiorum.
Keywords: Helianthus annuus; Pathogenesis-related protein 1; Gene clone; Function analysis
向日葵(Helianthus annuus)是我国重要的经济和
油料作物, 在生长发育过程中易受核盘菌、盐碱、
干旱等病原生物和环境因素的危害, 严重影响向日
葵的品质和产量, 所以研究向日葵抗逆和胁迫机制
1820 作 物 学 报 第 41卷


及分离鉴定防卫相关基因对向日葵抗逆分子育种具
有重要意义。
病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)
是植物受逆境胁迫后产生的一类蛋白质的总称 [1],
在植物防卫体系中具有重要作用。这些蛋白能通过
细胞壁加厚、抗菌活性、信号转导等方式参与植物
抗病反应[2]。根据其结构、生物活性等特性主要分
为个 17个亚类[3], 其中 PR1家族基因含量最为丰富,
并且高度保守, 参与多种生物和非生物胁迫的响应,
被认为是植物系统获得性抗性(systemic acquired re-
sistance, SAR)的标志基因[4-5]。在模式植物中外源 SA
能够引起植物产生 SAR并诱导 PR1基因的表达[6-7]。
有学者研究发现某些植物 PR1基因对病原菌表现出
了一定的抗性。Alexander等[8]将 PR1-a基因转入烟
草发现, PR1 基因以组成型高效表达的方式增强了
对疫霉属和斜尖状孢子菌属的抗性; Niki等[9]将 PR1
基因转入拟南芥过量表达增强了对油菜霜霉病毒的
抗性, 且发现该基因的诱导表达与水杨酸的积累密
切相关; Sarowar等[10]将辣椒 PR1蛋白基因转入烟草,
该基因过量表达后不仅增强了对重金属胁迫的抗性,
也增强了对烟草黑胫病菌和野火病菌等多种病原菌
的抗性。植物 PR1 蛋白基因是多基因家族, 但不是
所有 PR1 基因都具有抗病功能。Li 等[11]研究发现,
葡萄中只有碱性蛋白 VvPR1b1基因对烟草野火病菌
有抗病功能; Bonasera等[12]将 PR-1a、PR-1b和 PR-1c
转入苹果后, 发现苹果幼苗没有表现出抗病功能。
PR蛋白基因除抗病功能外, 在植物正常生长、非生
物逆境胁迫、抗衰老和激素诱导等机制中也发挥着
重要作用。Seo等[13]研究发现, 干旱胁迫下, 拟南芥
的 PR1、PR2和 PR5转录水平明显提高。盐胁迫下,
烟草的 PR-5c 受诱导表达 [14]。Agrawal 等 [15-16]和
Livak 等[17]研究发现, 水稻 OsPR1a 和 OsPR1b 基因
不仅受茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、过氧化氢(H2O2)、
蛋白酶抑制剂斑蝥素(CN)和稻瘟病菌(Magnaporthe
grisea)的诱导, 还对光、伤害及磷酸酶抑制剂等化学
和环境胁迫作出反应。
在前期工作中, 本课题通过高通量测序方法从
核盘菌诱导向日葵转录组文库中分离了一个受核盘
菌诱导上调表达的向日葵病程相关蛋白 1 基因
HaPR1。本研究拟从向日葵中克隆完整编码区的
HaPR1 基因的 cDNA, 通过时空表达特性分析, 遗
传转化烟草及检测转基因烟草的抗病性和防御酶活
性, 进一步明确 HaPR1 基因的功能, 为向日葵抗病
育种应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料及处理 以龙食葵2号为材料,
选取饱满、一致的种子, 用1%次NaClO3浸泡10 min
并用无菌水冲洗5~6次后放入发芽盒28℃催芽, 3 d
后将生根的芽放入Hogland营养液于光照培养箱中
培养, 条件为25℃/18℃(昼/夜), 光照时间14 h, 光
照强度600 μmol m–2 s–1。对培养至四叶期的向日葵
幼苗进行胁迫试验。(1)核盘菌诱导处理。取长满核
盘菌菌丝的PDA菌碟接种到幼苗第2片真叶上 , 每
株接1块菌碟, 保湿培养。(2)核盘菌代谢产物和草酸
诱导处理。将核盘菌代谢产物和100 mmol L–1草酸分
别均匀喷洒在叶片上, 每株5 mL。将PDA培养基上
生长7 d的核盘菌接种到PDA液体培养基中, 25℃振
荡培养15 d, 用纱布过滤菌丝即得核盘菌代谢产物,
置4℃备用。(3)干旱和盐胁迫处理: 将向日葵幼苗的
根分别放入15% PEG-6000和150 mmol L–1 NaCl的溶
液中处理。以上各胁迫处理后0、6、12、24和48 h
分别剪取叶片和根约0.2 g, 置–80℃备用。组织特异
性表达分析所用的各个组织材料取自黑龙江省农业
科学院植保所大田种植的龙食葵2号。
1.1.2 菌种、质粒及试剂 核盘菌 [Sclerotinia
sclerotiorum (Lib)de Bary]、大肠杆菌Escherichia coli
TOP10和植物表达载体pROK2由本实验室保存。植
物RNA提取试剂盒TRIzol购自Invitrogen公司。Taq
聚合酶、DNaseI、反转录试剂盒购自宝生物工程有
限公司; 胶回收、质粒提取、酶切产物回收试剂盒
均购自Omega公司; 草酸, 氯化钠、PEG-6000、乙酸
钠、氯仿、异丙醇、无水乙醇等生化试剂均为国产
分析纯试剂。
1.2 HaPR1全长 cDNA的克隆与序列分析
根据对本实验室已完成的核盘菌诱导向日葵转
录组 cDNA 文库分析, 发现一个 Unigene 序列在核
盘菌诱导后变化较大 , 该基因功能注释(Nr-annota-
tion)为病程相关蛋白 1 (pathogenesis-related protein
1), 根据此序列设计克隆该基因全长特异引物
HaPR1F1 和 HaPR1R1 (表 1)。采用 Invitrogen 公司
植物 RNA 试剂盒提取核盘菌诱导向日葵叶片的总
RNA, 参照宝生物公司反转录试剂盒说明书合成
RNA并反转录成 cDNA。然后以 cDNA为模板进行
PCR扩增。PCR扩增程序为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s,
57℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环。72℃ 7 min, 4℃
15 min。将 PCR 扩增目的条带回收纯化后与
第 12期 马立功等: 向日葵病程相关蛋白 HaPR1基因的克隆与功能 1821


pMD18-T 载体连接并转化到大肠杆菌 TOP10, 挑取
阳性克隆、提取质粒, 送上海生工生物工程公司测序。
1.3 生物信息学分析
对该cDNA序列及其编码蛋白进行生物信息学
分析, 包括利用ORF (open reading frame finder, ORF)
查找该基因开放读码框 ; 用ProtParam (http://www.
expasy.ch/tools/protparam.html)网站分析编码蛋白的
基本理化性质; 使用PSORT (http://psort.hgc.jp/form.
html)、MitoProt (http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)
在线软件对蛋白进行亚细胞定位预测; 用BlastP预
测保守区 , 蛋白家族 ; SignalP (http://www.cbs.dtu.
dk/services/SignalP)分析其信号肽序列; 通过(http://
www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)网站分析蛋白保守
结构域; 选取相似性高的序列用CLUSTAL 2.1进行
多序列比对 ; 用MEGA5.1构建系统发育树 , 设
Bootstrap值为1000。
1.4 HaPR1基因表达模式分析
在向日葵开花后期采集同一植株的根、茎、叶、
种子、盘和花组织并提取RNA; 分别提取核盘菌、
代谢产物、草酸、PEG-6000和NaCl处理后向日葵叶
和根的RNA。取1 μg以各处理提取的RNA反转录合
成cDNA后稀释100倍作为qRT-PCR分析的模板; 利
用Primer5.0软件设计HaPR1基因的荧光定量PCR引
物 HaPR1F2和 HaPR1R2、内参基因 actin的引物
actin-F1和actin-F1 (表1)。荧光定量PCR扩增程序为,
94℃预变性3 min; 94℃变性5 s, 57℃退火1 min, 72
℃延伸30 s后测定荧光值, 40个循环, 最后计算溶解
曲线。每个处理3次重复。采用相对定量法, 对所得
数据以2–ΔΔCt法 [18]计算不同胁迫条件下HaPR1基因
相对于内参基因的表达倍数变化趋势。
1.5 植物表达载体构建及转化烟草
以向日葵叶 cDNA 为模板 , 用 HaPR1F3 和
HaPR1R3 引物(表 1)进行 PCR 扩增, 回收的片段与
pMD18-T Vocter 载体连接, 构建 pMD-HaPR1。用
Xba I和 Kpn I双酶切重组质粒 pGM-HaPR1和植物
表达载体 pROK2 质粒, 通过 T4 连接酶将获得目标
基因片段和载体大片段连接, 然后将重组载体转化
到大肠杆菌 TOP10感受态细胞。筛选出阳性的转化
子, 并命名为 pROK2-HaPR1。用冻融法将以上重组
质粒转化根癌农杆菌 EHA105, 挑取阳性克隆进行
PCR 鉴定。通过叶盘法将含有质粒 pROK2-HaPR1
转化无菌的烟草苗。提取转化烟草的 DNA进行 PCR
鉴定, 提取RNA反转录成 cDNA进行RT-PCR鉴定, 组
培扩繁鉴定成功的转 HaPR1基因的烟草无菌苗叶片。
1.6 转基因烟草的抗病性及防御酶活性测定
取生长2个月且长势一致的野生型和转HaPR1
基因过量表达的烟草株系鉴定抗病性。用核盘菌
PDA菌碟接种叶片后保湿培养, 处理后0、24和48 h
分别剪取叶片进行防御酶活性测定。采用氮蓝四唑
(NBT)光还原法 [19]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;
采用愈伤木酚法 [20]测定过氧化物酶(POD)活性; 采
用分光光度法[21] 测定过氧化氢酶(CAT)活性; 采用
TBA反应法 [22]测定丙二醛含量。以上试验每处理3
次重复。用SPSS.11.0软件统计分析。
2 结果与分析
2.1 HaPR1全长 cDNA的获得与序列分析
通过对核盘菌诱导向日葵转录组数据分析, 获
得一个功能注释为病程相关蛋白 1 基因的全长
unigene 序列。为确认该序列的准确性, 根据其两端
非编码区设计特异引物, 以向日葵叶总 RNA的逆转
录产物 cDNA 为模板, 进行 PCR 扩增, 获得 1 条约
600 bp的 cDNA特异扩增条带。对重新测序获得的
HaPR1基因 cDNA序列的 ORF finder分析表明该基

表 1 试验使用的引物
Table 1 Primer used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence (5–3)
用途
Purpose
HaPR1F1 ATGGGGTCATTCAACTTCCA 基因克隆
HaPR1R1 CTAGTAAGGAGACTGGCCAA Gene cloning
HaPR1F2 CTGGTGGACCTTATGGCGAG 荧光定量
HaPR1R2 AGTGCACTGAACCCTAGCAC Real-time PCR
HaPR1F3 ATCGTCTAGAATGGGGTCATTCAACTTCCA 植物表达载体构建与检测
HaPR1R3 CGATGGTACCCTAGTAAGGAGACTGGCCAA pROK2-HaPR1 construction and identification
Actin-F1 AGCGACCACCTTAATCTTC 内标对照
Actin-R1 GGTTTTGTTCCAGCCATC Reference gene
下画线部分表示酶切位点。Sequences underlined indicate enzyme restriction site.
1822 作 物 学 报 第 41卷


因的开放阅读框(ORF)长 489 bp, 编码 162个氨基酸,
GenBank登录号为 KR071874。
ProtParam 预测该基因编码蛋白分子量约为
17.52 kD, 理论等电点为 8.19, 为碱性蛋白。携带负
电荷的氨基酸 (Asp+Glu)的总数目为 6, 正电荷
(Arg+Lys)的数目为 8。该蛋白分子式为 C761H1139N223
O235S11, 原子总数 2369, 为稳定蛋白。信号肽预测表
明 HaPR1蛋白的第 1~第 25个氨基酸为信号肽序列,
具有 6 个保守的半胱氨酸结构基序列, 含有 4 个保
守的 allergen V5/Tpx-1 related结构域(图 1)。BlastP
分析该蛋白具有完整的 SCP 超家族保守结构域, 属
于 PR1-like蛋白。
BlastP序列比对后发现 HaPR1与多条蛋白质序
列有不同程度的相似, 选择与向日葵 HaPR1 相似程
度高的 10种其他植物 PR1蛋白进行多序列比对发现,
HaPR1蛋白与其他物种 PR1蛋白的氨基酸序列的一
致性为 58.39%~66.46%, 信号肽间的相似性较低 ,
而成熟肽之间的相似性较高(62.77%~72.46%)。系统
进化树分析表明, 向日葵 PR1 蛋白与咖啡 Coffea
canephora (AGK89727) 和 茶 树 Camellia sinensis
(AHA56682)的进化关系最近, 属于同一个分支(图 2)。
2.2 HaPR1在向日葵不同组织表达特性分析
在向日葵开花后期, 取同一植株的根、茎、叶、
花、盘和种子, 提取 RNA并逆转录为 cDNA进行不
同组织表达特性分析。设种子中的 HaPR1基因表达
量为 1, 比较分析 HaPR1 基因在向日葵不同器官中
的表达特性。实时荧光定量 PCR 分析表明, HaPR1
基因在向日葵叶中表达量最高, 其次是根、盘、种
和花, 在茎中的表达量最低(图 3)。其中, 在叶中表
达水平分别是根、盘、种、花和茎的 1.90、8.13、10.13、
10.67和 634.55倍。
2.3 HaPR1在生物和非生物胁迫条件的表达
取各种胁迫处理后的向日葵叶片和根提取 RNA,
进行实时荧光定量 PCR分析表明(图 4), 当向日葵叶

图 1 HaPR1与其他植物 PR1蛋白氨基酸序列同源性比较
Fig. 1 Alignment of full-length amino acid residues among HaPR1 and other PR1 proteins
HaPR1: 向日葵, KR071874; StPR1: 马铃薯, CAB58263; MtPR1: 蒺藜苜蓿, XP_003593358; PpPR1: 巴旦木, XP_007201285; PtPR1: 毛
果杨, XP_006379156; SfPR1: 猪毛菜, AFR90191; VsPR1: 夏特沃氏葡萄, ADN43437; CcPR1: 咖啡, AGK89727; SpPR1: 野生马铃薯,
CAD38277; CsPR1: 茶树, AHA56682; VcPR1: 杂交葡萄, ADN43417。下画线表示信号肽序列; 实线框 a~f表示保守的 6个半胱氨酸;
虚线框 I、II、III、IV分别表示 4个保守的 allergen V5/Tpx-1 related结构域。
HaPR1: Helianthus annuus, KR071874; StPR1: Solanum tuberosum, CAB58263; MtPR1: Medicago truncatula, XP_003593358; PpPR1:
Prunus persica, XP_007201285; PtPR1: Populus trichocarpa, XP_006379156; SfPR1: Salsola ferganica, AFR90191; VsPR1: Vitis shuttle-
worthii, ADN43437; CcPR1: Coffea canephora, AGK89727; SpPR1: Solanum phureja, CAD38277; CsPR1: Camellia sinensis, AHA56682;
VcPR1: Vitis hybrid cultivar, ADN43417. Underline indicates the signal peptide sequence; a–f: conserved cysteine; I–IV: conserved allergen
V5/Tpx-1 related domain.
第 12期 马立功等: 向日葵病程相关蛋白 HaPR1基因的克隆与功能 1823



图 2 不同植物 PR1蛋白的系统进化分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of PR1 from different plant species
黑点表示从向日葵中克隆的 HaPR1氨基酸序列。
Black dot stands for HaPR1 amino acid sequences from H. annuus.


图 3 qRT-PCR分析向日葵不同器官中 HaPR1基因的表达
Fig. 3 Expression of HaPR1 gene in various sunflower organs
by qRT-PCR

片受到核盘菌诱导时, HaPR1 基因的表达量随着胁
迫时间的延长呈现先升高后降低的趋势, HaPR1 基
因的表达量 12 h 达到最高, 此后随着时间的延长,
表达水平逐渐降低, 12 h表达量为对照的 4.07倍。
当向日葵叶片受到核盘菌代谢物诱导时, HaPR1 基
因的表达量 24 h 达到最高, 24 h 表达量为对照的
7.75倍。当向日葵叶片受草酸胁迫时, HaPR1基因表
达量随着胁迫时间的延长逐渐升高, 于 24 h达到最
高, 为对照的 14.52 倍, 此后随时间延长, 表达量下
降。当向日葵根受到盐(NaCl)和干旱(PEG-6000)胁迫
时, HaPR1 基因表达量均随着胁迫时间的延长逐渐
升高, 12 h 达到最高, 分别是对照的 1.82 倍和 1.64
倍, 此后随时间延长, 表达量逐渐下降。由此可以看
出, 干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导
向日葵 HaPR1的表达, 其中草酸、核盘菌及其代谢
物均显著诱导叶片 HaPR1基因的上调表达, 表达量
较对照提高 4.07~14.52 倍, 而盐(NaCl)和干旱(PEG-
6000)胁迫时, HaPR1表达量较对照提高 1.64~1.82倍
(图 4)。
2.4 植物表达载体构建及转基因烟草的获得
将 pROK2 质粒和目的基因的双酶切产物连接,
转入大肠杆菌 TOP10 感受态中, 涂布于含有卡那霉
素的 LB 培养平板上, 37℃培养 16 h, 长出转化菌
TOP10-pROK2-HaPR1, 随机挑取单菌落进行菌液
PCR 检测, 电泳结果如图 5; 将菌液 PCR 检测为阳
性的转化子提取质粒, 用 Xba I和 Kpn I限制性内切
酶进行双酶切鉴定 , 电泳结果如图 6。由此可知 ,
HaPR1 基因成功整合到植物表达载体当中。然后用
叶盘法将 HaPR1 转化烟草, 通过抗性筛选, 获得具
有卡那霉素抗性的烟草, 提取转 HaPR1基因烟草的
RNA, 反转录成 cDNA, 进行 RT-PCR 鉴定, 结果表
明获得了能够正常转录的转基因植株(图 7)。
2.5 转基因烟草抗病性及防御酶活性测定
对 8株转HaPR1基因烟草进行了抗菌核病测定,
其中有 2 株(L3和 L5)表现较好的抗病性, 叶面不发
病或与菌碟交界处只出现少量小斑点, 而野生型烟
草则出现明显的病斑(图 8)。为了明确转基因烟草叶
片的抗病机制, 对 L3和 L5进行了防御酶活性测定,
结果表明(图 9), 在接种核盘菌前, 转基因烟草叶片
(L3 和 L5)中 POD 和 CAT 活性显著高于对照(WT),
当接种核盘菌后, 转基因烟草的 CAT 活性随时间的
延长逐渐升高, 而对照烟草则显著下降; 转基因烟
草和对照烟草叶片的 POD活性均随时间延长逐渐下
降, 但转基因烟草 POD 活性下降速度显著快于对照;
在未接核盘菌前 , 转基因烟草和对照烟草叶片的
SOD 活性无显著差异, 当接种核盘菌后, 转基因烟
草和对照烟草的 SOD活性 12 h后逐渐升高, 24 h达
到最高, 48 h 后逐渐降低, 但在核盘菌侵染过程中,
转基因烟草 SOD活性显著高于对照; 在接种核盘菌
1824 作 物 学 报 第 41卷



图 4 以 qRT-PCR分析生物和非生物胁迫处理对 HaPR1表达的影响
Fig. 4 Effect of biotic and abiotic stresses on HaPR1 expression by qRT-PCR
设 0 h的表达量为 1, 数据为 3次独立试验的平均值±标准误不同字母表示差异显著(P < 0.05)。
The 0 h expression level is assigned a value of 1. Values are the mean ± SE of three biological replicates. Bars with different letters show
significant difference at P < 0.05.


图 5 HaPR1转化大肠杆菌的菌液 PCR检测
Fig. 5 Bacteria liquid PCR identification of HaPR1 trans-
formed to Escherichia coli
M: DL2000; 1~6: TOP10-pROK2-HaPR1菌液 PCR产物。
M: DL2000; 1–6: Product of colonial PCR of
TOP10-pROK2-HaPR1.

前以及接菌后, 转基因烟草叶片中 MDA 含量显著
低于对照 (图 9)。以上结果表明 , 烟草中导入的
HaPR1基因通过提高与抗性相关的酶(SOD、POD和
CAT)活性和降低植物体内 MDA 含量来提高对核盘
菌的抗病性。
3 讨论
目前, 研究发现 PRs 基因家族中的 PR1基因在
多种植物中能被病原菌、生物因素和非生物因素诱
导, 通常被认为是植物系统获得抗性的标记基因。
本试验以向日葵龙食葵2号为材料 , 克隆得到了
HaPR1基因 cDNA全长序列。生物信息学分析表明,

图 6 重组质粒 pROK2-HaPR1酶切鉴定
Fig. 6 Identification of recombinant plasmid pROK2-HaPR1
by restriction enzyme
M: DL2000; 1, 2: 重组质粒 pROK2-HaPR1。
M: DL2000; 1, 2: pROK2-HaPR1.

该基因的氨基酸序列与其他植物的 PR1基因具有高
度同源性, 长度也基本相似, 成熟肽序列与其他植
物有很高的相似性, 但信号肽序列构成上有较大差
异。该基因 C 端含有典型的 SCP_PR1_like 结构域,
说明 PR1基因在不同植物中具有一定的保守性。前
人研究表明, 碱性 PR1 蛋白具有更高的抗真菌活
性。本研究中 HaPR1 蛋白预测理论等电点为 8.19,
属于碱性蛋白, 理论上具有较强的抑菌活性, 但由
于不同植物的 PR1 基因的功能存在较大差异, 仅从
氨基酸序列和结构推测其功能是不可靠的, 对此需
第 12期 马立功等: 向日葵病程相关蛋白 HaPR1基因的克隆与功能 1825



图 7 转基因烟草 RT-PCR检测
Fig. 7 RT-PCR identification of transgenic tobacco plants
M: DL2000; L1~L8: 转基因烟草株系; WT: 非转基因烟草株系; P: 阳性对照。
M: DL2000; L1–L8: Transgenic lines; WT: non-transgenic line; P: positive plamid.


图 8 转基因烟草(L3和 L5)和非转基因烟草(WT)接种核盘菌
48 h后叶片症状
Fig. 8 Symptom of transgenic tobacco (L3 and L5) and
nontransgenic tobacco (WT) at 48 hours after inoculation
要进一步的研究和验证。
研究表明, 许多 PR 基因在植物不同组织及不
同生育期表达存在差异, 例如水稻 JIOsPR10基因在
根、茎、花中表达, 而在叶中不表达[23]; 湖北海棠
MhPR8 基因在根中的表达量最大, 其次是茎, 在叶
片中的表达最低[24]; 小麦 TaLr35PR2 基因在叶中表
达量最高, 其次是茎, 在根中不表达[25]。这种组织特
异性表达不仅说明 PR 基因参与了不同类型的免疫
反应, 也表明该基因在植物正常生长发育过程中发
挥一定作用。本研究发现, HaPR1基因主要在向日葵
叶片中表达, 这与大多数 PR 蛋白能在叶片中表达

图 9 核盘菌对转基因烟草防御酶活性及丙二醛含量的影响
Fig. 9 Defense enzyme activity and MDA content in transgenic tobacco treated by S. sclerotiorum
数据为 3次独立处理试验的平均值±标准误, 不同字母表示差异显著(P < 0.05)。
Values are the mean ±SE of three biological replicates. Bars with different letters show significant difference at P < 0.05.
1826 作 物 学 报 第 41卷


相一致, 推测其在向日葵叶片的生长发育或防御反
应中具有重要的作用。
大量报道已证明, PR1 基因不仅受生物和非生
物因素的诱导, 同时也受植物生长调节剂等物质的
调控。PR1 基因的表达能够增加植物抵御病害和其
他各种胁迫的能力。侯丽霞等研究发现, 葡萄 PR1
基因表达受霜霉病菌、低温、盐和干旱胁迫显著诱
导, 同时 SA、ABA、JA、NO、H2O2和 H2S等也可
诱导其大量表达[26]; 王艳等[27]也研究表明, 猪毛菜
SfPR-1基因不仅响应盐、干旱、冷害和 H2O2的诱导,
同时也受 SA、JA、ABA 和乙烯的调控。本研究发
现, HaPR1可响应多种胁迫, 干旱、盐、草酸、核盘
菌及其代谢物均能诱导 HaPR1上调表达, 其中由核
盘菌及其代谢产物和核盘菌主要的致病因子草酸诱
导后 HaPR1的表达量能提高 4.07~14.52倍, 而受盐
和干旱胁迫时, HaPR1 表达量较对照提高了 1.64~
1.82倍, 该结果说明 HaPR1能够响应核盘菌及其毒
素的侵袭。此外, 对过量表达 HaPR1 转基因烟草叶
片进行菌核病抗性测定, 试验结果同样证明 HaPR1
过量表达可以提高植株对核盘菌的抗性。由此说明,
该基因在向日葵抗病机制中具有重要作用。
目前, 通过转基因方法确定了某些 PR1 基因具
有抗病功能[8-10]。PR1基因是多基因家族, 但并非所
有 PR1基因都具有抗病功能。研究表明 PR1基因家
族中只有少数成员表现出抗菌功能, 有的 PR1 基因
参与发育调控, 多数具有未知的生物学功能。本研
究表明 HaPR1基因的表达受核盘菌、草酸等致病因
子显著诱导, 那么 HaPR1 基因是否参与向日葵对菌
核病的防御过程？为更多了解 HaPR1 基因的功能,
构建了植物表达载体 pROK2-HaPR1, 并获得了转
HaPR1 基因的烟草植株, 对转基因烟草进行抗核盘
菌测定发现转化烟草对核盘菌具有较高的抗性。通
过对转基因烟草防御酶活性及丙二醛含量的测定 ,
发现转基因烟草叶片较对照显著提高了 SOD、POD
和 CAT 活性 , 并降低了丙二醛含量。从而推断
HaPR1 基因具有抗核盘菌的功能。植物与病原物互
作中, 不同的病程相关蛋白参与不同的信号传导途
径, HaPR1 基因是否参与其他病害的防御过程以及
具有别的生物学功能还需进一步研究。
4 结论
克隆了 1个向日葵病程相关蛋白 1基因 HaPR1
的 cDNA全长序列, 其 OFR为 489 bp, 编码 162个
氨基酸, 具有 6个保守半胱氨酸, 4个保守的 allergen
V5/Tpx-1结构域。HaPR1的相对表达量在向日葵叶
中最高, 根中其次, 茎中最低。干旱、盐、草酸、核
盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达。该基因在烟
草中过量表达提高了对核盘菌的抗性, 转基因烟草
叶片在核盘菌胁迫下显著提高 SOD、POD 和 CAT
活性, 降低 MDA 含量。初步推断 HaPR1 具有抗核
盘菌的功能。
References
[1] 谢纯政, 刘海燕, 李玲, 梁炫强. 植物病程相关蛋白 PR10 研
究进展. 分子植物育种, 2008, 6: 949–953
Xie C Z, Liu H Y, Li L, Liang X Q. Advances on class 10 patho-
genesis-related proteins. Mol Plant Breed, 2008, 6: 949–953 (in
Chinese with English abstract)
[2] Loon L C, Strien E A. The families of pathogenesis-related pro-
teins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type pro-
teins. Physiol Mol Plant Pathol, 1999, 55: 85–97
[3] Van Loon L C, Rep M, Pieterse C M J. Significance of inducible
defense-related proteins in infected plants. Annu Rev Phytopathol,
2006, 44: 135–162
[4] 牛吉山, 刘瑞, 郑磊. 小麦 PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和
水杨酸诱导表达分析及白粉病抗性研究. 麦类作物学报, 2007,
27: 1132–1137
Niu J S, Liu R, Zheng L. Expression analysis of wheat PR-1,
PR-2, PR-5 activated by Bgt and SA, and powdery mildew resis-
tance. J Triticeae Crops, 2007, 27: 1132–1137 (in Chinese with
English abstract)
[5] Xie X Z, Xue Y J, Zhou J J, Zhang B, Chang H, Takano M. Phy-
tochromes regulate SA and JA signaling pathways in rice and are
required for developmentally controlled resistance to Mag-
naporthe grisea. Mol Plant, 2011, 4: 688–696
[6] Nandi A, Kachroo P, Fukushige H, Hildebrand D F, Klessig D F,
Shah J. Ethylene and jasmonic acid signaling affect the NPR1-
independent expression of defense genes without impacting re-
sistance to Pseudomonas syringae and Peronospora parasitica in
the Arabidopsis ssi1 mutant. Mol Plant Microbe Interact, 2003,
16: 588–599
[7] Flors V, Ton J, van Doorn R, Jakab G, García-Agustín P,
Mauch-Mani B. Interplay between JA, SA and ABA signalling
during basal and induced resistance against Pseudomonas syrin-
gae and Alternaria brassicicola. Plant J, 2008, 54: 81–92
[8] Alexander D, Goodman R M, GutRella M, Glascock C, Wey-
mann K, Friedrich L, Maddox D, Ahlgoy P, Luntz T, Ward E. In-
creased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic
tobacco expressing pathogenesis-related protein 1a. Proc Natl
Acad Sci USA, 1993, 90: 7327–7331
[9] NiKi T, Mitsuhara I, Seo S. Antagonistic effect of salicylic acid
and jasmonic acid on the expression of pathogeneis-relation (PR)
protein genes in wounded mature tobacco leaves. Plant Cell
Physiol, 1998, 39: 500–507
[10] Sarowar S, Kim Y J, Kim E N. Overexpression of a pepper basic
pathogenesis-related protein1 gene in tobacco plants enhances re-
sistance to heavy metal and pathogen stresses. Plant Cell Rep,
2005, 24: 216–224
第 12期 马立功等: 向日葵病程相关蛋白 HaPR1基因的克隆与功能 1827


[11] Li Z T, Dhekney S A, Gray D J. PR-1 gene family of grapevine: a
uniquely duplicated PR-1 gene from a Vitis interspecific hybrid
confers high level resistance to bacterial disease in transgenic to-
bacco. Plant Cell Rep, 2011, 30: 1–11
[12] Bonasera J M, Kim J F, Beer S V. PR genes of apple: identifica-
tion and expression in response to elicitors and inoculation with
Erwinia amylovora. BMC Plant Biol, 2006, 6: 23
[13] Seo P J, Lee A K, Xiang F N, Park C M. Molecular and func-
tional profiling of Arabidopsis pathogenesis-related genes: in-
sights into their roles in salt response of seed germination. Plant
Cell Physiol, 2008, 49: 334–344
[14] Stintzi A, Heitz T, Kauffmann S, Legrand M, Fritig B. Identifica-
tion of a basic pathogenesis-related, thaumatin-like protein of
virus-infected tobacco as osmotin. Physiol Mol Plant Pathol,
1991, 38: 137–146
[15] Agrawal G K, Jwa N S, Rakwal R. A novel rice (Oryza sativa L.)
acidic PR1 gene highly responsive to cut, phytohormones, and
protein phosphatase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun,
2000, 274: 157–165
[16] Agrawal G K, Rakwal R, Jwa N S. Rice (Oryza sativa L.)
OsPR1b gene is phytohormonally regulated in close interaction
with light signals. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 278:
290–298
[17] Agrawal G K, Rakwal R, Jwa N S, Agrawal V P. Signaling mole-
cules and blast pathogen attack activates rice OsPR1a and OsPR1b
genes: a model illustrating components participating during de-
fence/stress response. Plant Physiol Biochem, 2001, 39: 1095–1103
[18] Livak K, Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2-delta delta CT method.
Methods, 2001, 25: 402–408
[19] 邹琦. 植物生理生化实验指导. 北京: 农业出版社, 1991
Zou Q. Laboratory Guide for Plant Physiological and Biochemi-
cal Experiments. Beijing: Agriculture Press, 1991 (in Chinese)
[20] 朱广廉, 钟文海, 张爱琴. 植物生理实验. 北京: 北京大学出
版社, 1991
Zhu G L, Zhong W H, Zhang A Q. Plant Physiology Experiment.
Beijing: Peking University Press, 1991 (in Chinese)
[21] 汤章城, 王国强, 史益敏. 现代植物生理学实验指南. 北京:
科学出版社, 1999
Tang Z C, Wang G Q, Shi Y M. Modern Experiment Guide for
Plant Physiology. Beijing: Science Press, 1999 (in Chinese)
[22] 陈建勋, 王晓峰. 植物生理学实验指导. 广州: 华南理工大学
出版社, 2002. pp 31–32, 117–120
Chen J X, Wang X F. Experiment Manual for Plant Physiology.
Guangzhou: South China University of Technology Press, 2002.
pp 31–32, 117–120 (in Chinese)
[23] Kim S T, Yu S, Kang Y H. The rice pathogen-related protein 10
(Jiospr10) is induced by abiotic and biotic stresses and exhibits
ribonuclease activity. Plant Cell Rep, 2008, 27: 593–603
[24] 张计育, 渠慎春, 薛华柏, 高志红, 郭忠仁, 章镇. 湖北海棠
病程相关蛋白 MhPR8 基因的克隆与表达. 中国农业科学,
2012, 45: 1568–1575
Zhang J Y, Qu S C, Xue H B, Gao Z H, Guo Z R, Zhang Z. Isola-
tion and expression of pathogenesis-related protein gene MhPR8
from Malus hupehensis. Sci Agric Sin, 2012, 45: 1568–1575 (in
Chinese with English abstract)
[25] 栗小英, 高琳, 张艳俊, 王海燕, 刘大群. 叶锈菌及信号分子
诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析. 中国农业
科学, 2014, 47: 2774–2783
Li X Y, Gao L, Zhang Y J, Wang H Y, Liu D Q. Expression and
analysis of β-1,3-glucanase gene in wheat TcLr35 induced by
wheat leaf rust pathogen and signal molecule. Sci Agric Sin, 2014,
47: 2774–2783 (in Chinese with English abstract)
[26] 侯丽霞, 高超, 车永梅, 赵方贵, 刘新. 葡萄病程相关蛋白 1
基因的克隆和表达分析. 植物生理学报, 2012, 48: 57–62
Hou L X, Gao C, Che Y M, Zhao F G, Liu X. Gene cloning and
expression analysis of pathogenesis-related protein 1 in Vitis vi-
nifera L. Plant Physiol J, 2012, 48: 57–62 (in Chinese with
English abstract)
[27] 王艳, 陈西, 周莲洁, 杨中敏. 费尔干猪毛菜病程相关蛋白基
因 SfPR-1 的表达规律和植物表达载体构建. 生物技术通报,
2014, (1): 117–124
Wang Y, Chen X, Zhou L J, Yang Z M. Expression profiles of
pathogen-related protein gene (SfPR-1) from Salsola ferganica
and construction of plant expression vectors. Biotechnol Bull,
2014, (1): 117–124 (in Chinese with English abstract)