全 文 ：武汉植物学研究
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!∀#∃ % & & ∋ (

) ∗ + ,− . # ∗/ 0 + 1+ − 2 ∗ 3. − 45. # 6 57 5 . ,8 1
甘蓝型油菜胞质体大量制备技术的研究 ’
李昌功 孙海鹏“ 周 嫦 杨弘远
∀武汉大学 生命科学学院植物 生殖 生物学研究室 武汉 9 : ; ; & <∃
提 要 用 = 5 , 5 ∗ ##密度梯度离心法和叮睫橙 ∀. 5 , 4> 4− 5 ∗ , . − ? 5 , ≅ Α ∃结合光照处理两种方法 ,
均从甘蓝型油菜下胚轴原生质体制备到胞质体 。 在 < 个 Β 5 , 5∗ ##梯度 、 : ; ; ; ;  ∀
∗ ∗ ∗ , Χ Δ 4− ∃
与
< Ε 离心 !; Δ 4− 的条件下 , 获得了含胞质体 ; Φ 以上的群体 Γ 以含 ; 、
; 、
<; Δ ? Χ Η ≅ ∗
的酶液酶解下胚轴原生质体 , 纯化后分别给以 : 1 、 Ι 1 、 # 1 光照 ∀光强度 % 9 ; ; ∗ #ϑ∃ 可使原生
质体几乎不能分裂 , 但保持 7 > 以上的生活力 。 由于光照导致 ≅ Α 一Κ Λ ≅ 复合体的 Κ Λ ≅ 降解 ,
造成核不可逆失活 , 从而可以认为经 ≅ Α 与光照处理的原生质体是胞质体 。
关键词 甘蓝型油菜 , 胞质体 , = 5, 8∗ # , 叮咤橙
高等植物种间或品系间细胞质基因组的转移通常是 以重 复多次回交的方式实现的 ,
费时较长 。 此外 , 由于受精前后杂交障碍的存在 , 还使得其应用受到较大的限制 。 原生质
体融合使跨越有性杂交和生殖隔离障碍的基因转移成为可能 , 而不对称融合 , 尤其是有细
胞核的原生质体与无核的胞质体 之间的融合 , 使细胞质基因组的转移仅
次就可以实
现〔‘, ’〕 , 因而值得重视 。 为实现这一 目的 , 大量优质胞质体的制备就成为首要的间题 。 目前
制备胞质体主要有射线 ∀ϑ 一 、 Μ一射线 ∃辐照和密度梯度离心等方法, 前者对基因组的破坏往
往是随机的和不完全的 , 后者能获得较纯的胞质体 。 但现有的报道〔, , ‘, 中所用的离心力很
高 , 操作也较繁琐 , 我 们简化 了现有的 = 5,8 ∗# #密度梯度离心技术 , 并受前人关于叮咤橙
∀. 8 , 4> − 5 ∗, . −? 5 , ≅ Α ∃失活处理应用于不对称融合 〔(〕的启发 , 对 ≅Α 结合光照处理制备
胞质体作 了试验和探讨 。

材料与方法

Ν
下胚轴原生质体 的制备
以甘蓝型油菜 ∀2 ,. % % 48. , , .= + 、 Η Ν ∃品种 中油 <
的无菌苗下胚轴为材料 , 用文献 〔!〕
的方法制备原生质体 。 将原生质体悬浮于0 Ο洗液 〔&
中 , 密度调至
一 ( 又
; ! 个 Χ Δ Η备用 。
收稿 日 %
 ! 一

; , 修回日 %
 & ;
< 。 第 一作者 % 男 Ν : < 岁, 副教授 ∀博士 ∃ 。
, 湖北省 自然科学基金 资助项 目 。
夸 , 武汉大学植物学专业 ! 届毕业生 , 现 在中国科学院 植物研究所攻读 硕士学位
武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷

· < Β 5 , 8 ∗ ##密度梯度离心
首先参照文献〔:〕的方法从甘蓝型油菜下胚轴原生质体制备胞质体 , 用 2 Π Ε Θ Ρ ≅ Λ
)Ι一ΡΕ 离心机 、)≅ Ι∗ 角式转头试验 了离心力在 ; ; ; ∋ : ; ; ; ;  ∀
9 ; ; ; ∋
; ; ∗ , Χ Δ 4− ∃ 、
9 个 =5 , 5 ∗ ## 梯度 ∀从上到下依次 为 % 含 ( Φ 、
; Φ 、 < ; Φ 、 ( ; Φ的 =5 , 5 ∗ ##等渗溶液各 ΙΔ Η ∃
离心 (; Δ 4− 制备胞质体的效果 Γ进一步简化上述方法 , 用 < 个 =5 ,8 ∗# #梯度 ∀( Φ的
Δ Η 、
< ; Φ的 < Δ Η ∃和
个 = 5 ,8∗ # 梯度 ∀<; Φ的 : Δ Η ∃离心制备胞质体 。 作为一个梯度 , 上述悬
浮于 0 Ο 洗液中的原生质体铺于最上层 。
胞质体的鉴定 % 将收集的胞质体用
Φ戊二醛在 9 Ε 下固定过夜 , ; Ν
Δ ∗# Χ Η 柠檬酸 Σ
磷酸二氢钠 ∀Β Τ Ο Ν ;∃ 缓冲液或 0 Ο 洗液充分洗涤后 , 在 Β Τ Ο Ν ∗ 上述缓冲液中以
; 拌? Χ Η
Τ : : < ( 于 <( ’Ε 暗中染色 # 1 , 加等体积甘油透明 , Α ΗΥ Ρ =ς Ο ΩΡΞ 一< 倒置显微镜 ς 激发
光下观察核的有无 , 随机选定数个视野进行统计 , 每一实验统计的原生质体数均在 9; ; 个
以上 。 用文献 〔!〕的方法培养胞质体 , ; Ν
Φ Ε.# 8∗ /#+ ∗ , Ψ 14 35 ∀Ε0 ∃染色观察细胞壁再生
情况 。

Ν : 叮吮橙处理
用含 (; 一
(; Δ ? Χ Η 叮咤橙 的酶液酶解甘蓝型油菜下胚轴 , 将纯化的原生质体分别
给以不同时间的光照 , 光强度为 9 ∗ ; Α #ϑ 。 按文献〔! 〕的方法于暗中进行培养 , 7 > 后统计
原生质体的分裂情况 。 用荧光素二醋酸酷“#+ ∗, 5 7 85 4− >4 .8 53 .3 5 , Ζ Κ ≅ ∃染色反应鉴定原
生质体的生活力 , 并用聚 乙二醇法 〔(∃ 试验 了 ≅ Α 处理后光照
∋ 9 1 的原生质体与青菜
∀2 Ν ‘14 −5 ,#7 4、 Η Ν ∃∀ 品种南京 白∃叶肉原生质体的融合情况 。 青菜原生质体的分离方法与甘
蓝型油菜下胚轴原生质体的分离方法相同 , 只是酶解时间较短 , 仅 7 1 左右即可 。
< 结果
< Ν
=5 ,8 ∗# #密度梯度离心制备胞质体
在不连续的 = 5 , 8 ∗# #密度梯度 、 足够的时间和离心力条件下 , 由于原生质体各组分的
浮力密度不 同 , 细胞核及其周围的少量细胞质被甩出细胞本体 , 并被质膜 包被形成核质
体 , 留下完整质膜包被的含大部分细胞质的胞质体 , 胞质体居上层而核质体在其之下接近
离心管底部 , 用吸管分别吸出即可得到大量的群体 。
试 验了不同离 心力 、 =5, 8∗ −梯度 、离心 时间 及温度对胞质体制 备效果的影响 。
< 一
< ( Ε 范 围内对 胞质体制备 没有明显 影响 Γ (; 一 & ∗ Δ 4− 比较 适当 , 太短 则原生质体分层
表
不同离心力 、梯度对胞质体制备效果的影响
Ξ . [ #5
Π //5 5 3 7 ∗ / > 4//5 , 5 − 3 5 5 − 3 ,4/+ ? . # /∗ , 55 7
. − > ? , . > 45 − 3 7 ∗ − 5Μ 3 ∗ Β #. 7 3 Β , ∗ > + 5 3 #∗ −
梯度数
Λ + − 飞[ 5 , ∗ /
? , . > 45 − 3
第 一界面中胞质体的比率 ∀Φ ∃
6 . 3 5 ∗ / 5 Μ 3∗ Β #. 7 3 7 4− # 7 3 4− 3 5 , /. 5 5
第二 界面中胞质体的比率 ∀ Φ ∃6 . 3 5 ∗ / 5Μ 3 ∗ Β #. 7 , 7 4− Ι − > 4− 35 , /. 5 5
< ( ; ; ; 
∀
& ΑΑ; , Χ − 、4,4 ∃
: ; ; ; ; 
∀
; ;; , Χ − 、4− ∃
< ( ; ; ; 
∀
& ; ; Α , Χ − 飞4− ∃
: ; ; ; ∀∃ ?
∀
ΑΑ ; , Χ − 飞4− ∃
不 够 , 太长对 原生
质 体的损伤较 大 ,
胞质体内的细胞质
聚缩成团 。 从表

可 以看出 , 其它条
件 一定时 , 随离心
力的增 大 , 每一界
面的胞质体 比率升
高 Γ =5 , 5 ∗ ##梯 度的
第
期 李 昌功等 % 甘 蓝型油菜胞质体大量制备技术的研究
数量减少后胞质体的比率反而有所升高 Γ 减少 =5 ,8 ∗# # 梯度数 , 同时相应地减少离心管中
总的液体体积 , 第一界面 ∀从上往下数 , 下述及表
中同 ∃的胞质体所占比率为 < Ν : Φ 。 仅

个 =5 ,8 ∗# #梯度的结果稍差 。 图版 # %
一 9 显示了用简化的 =5 ,8 ∗# #密度梯度离心法制备
胞质体的情况 。 第一界面 中的原生质体主要是胞质体 , 个体较大 , 细胞质内有较多的小泡
或颗粒 , 已看不出明显的细胞质索结构 , 经鉴定 , 仍有一部分 ∀<; Φ以下 ∃有核的原生质体
∀图版 Ω %
, : , 9∃ 。 第二 界面 中的原生质体 , 有的呈椭 圆状 , 是 核质体 〔亦称小原生质体
∀Δ 4− 4=, ∗3 ∗ Β #. 7 3 ∃〕, 有些是细胞质较浓的原生质体 ∀图版 Ω % < ∃ , 也有少量的胞质体 。 将从第
一界面收集到的胞质体进行培养 , ! 1 后用 Ε0 染色可观察到细胞壁再生 , 培养 <9 1 后观
察 , 发现几乎所有的原生质体均破碎 。
< Ν < 叮咤橙处理
从表 < 可以看到 , 随 ≅ Α 浓度从 (; Δ ? Χ Η 升至
(; Δ ? Χ Η , 培养 7 > 后 , 未经光辐照的
原生质体的生活率和分裂率分别从 (& Ν : Φ 和
Ν 9 Φ降到 & Ν ! Φ和 ; Ν & 写 , 表 明 ≅ Α 本身
即可造成原生质体的活力和分裂能力降低 。 ≅ Α 处理后附加不同时间的光照 , 明显地促使
原生质体的活力和分裂能力进一步下降 。 以 ; Δ ? Χ Η ≅ Α 处理为例 , 光照 # 1 的原生质体
比未光照的分裂率降低了近一半 Γ光照 Ι 1 的又比 # 1 的降了 !; Φ多 Γ光照 : 1 的 , 无原生
质体分裂 , 原生质体的活力亦有显著的降低 。 而未经 ≅Α 和光照处理的对照组的原生质
体 , 无论是生活率还是分裂率均远高于 ≅ Α 和光照处理 的 。 继续培养 : 周后观察 , 对照组
原生质体 已形成较大块的愈伤组织 , 而 ≅ Α 与光照处理的组合中仅 (; 一
; Δ ? Χ Η ≅ Α 处
理后光照 # 1 的原生质体出现数个小细胞团 。经 ≅ Α 处理和光照 : 1 以上的原生质体仍能
与青 菜叶肉原生质体融合 ∀图版 Ω % ( , ! ∃ 。
表 < ≅Α 浓度和光照对原生质体生活力和分裂的影响
Ξ . [ #5 < Π //5 5 3 7 ∗ / 5 ∗ − 5 5 − 3 , . 34∗ − ∗ / ≅ Α . − > #4? 1 3 4, , . > 4. 34∗ − ∗ − ∴ 4. [4#43Μ
. − > > 4∴ 47 4∗ − ∗ / 1 ΜΒ ∗ 5 ∗ 3 Μ# Β , ∗ 3 ∗ Β #. 7 3 7 ∗ / 方 Ν Γ % . = + 7
≅ ∀∃ 浓度 ∀− 4 ? 八 ∃
Ε ∗ − 5 5 − 3 , . 3 4∗ − ∗ / ≅ ∀∃
生活率∀Φ ∃6 . 3 5 ∗ / ∴ 4. [ #5 Β , ∗ 3 ∗ Β #. 7 37 分裂率
∀Φ ∃
6 . 35 ∗ / > 4∴ 4> 5 > Β , ∗ 3 ∗ Β #. 7 , 7

; ;

< ;

( ;
; &  Ν
一 一 一 < ( Ν < 一 一 一
( ; ( & : ( < & 99 Ν 9 一

Ν 9 ( Ν 9 < Ν ! 一
6 − 气9 ; 9 ] ⊥ : : 弓Ν !  Ν ( Ν < 9 , !
Ν ! ;
表示 ≅ Α 处理后附加光照 的时间 , 单位 % 1 。
Ω− > ϑ5 . 3 5 7 #4? 1 3 4, , . > 4. 3 4∗ − 34− #5 ∀ + − 4, %

∃ . /35 , ≅ ∀∃ 3 , 5 . , − 45 − 3 Ν
: 讨论
我们通过减少 = 5 ,8 ∗# # 梯度的数量和体积 , 在较低的离心力条件下得到了胞质体 比率
高达 ; Φ以上的结果 , 为通过不对称细胞融合进行有益细胞质基因的转移 、 改 良品种 , 提
供了技术基础 。 Η 5 7 −5 Μ 等 〔‘〕将 Ο ∗# ., , “” , 爪 ? ,# Δ 悬浮细胞的原生质体用甘露醇与蔗糖梯
度在 < : ( ; ;  、 ∗ 一 9 Ε 条件下离心 ! ( Δ 4− , 得到 含胞质体  ; 乡。以上 的群体 Γ 将 6 . =1 “ , , % ‘、
武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷
7 . 3 4∴ + 7 下胚轴原生质体在 = 5 , 5 ∗ ##Χ甘露醇不连续梯度 、
( < ; ; ;  、
< Ε 、 : ; Δ 4− 的条件下
获得 ; Φ 一  ( Φ 的无核率 。 Η ∗ , _ 等‘: 〕用不连续 =5 , 5 ∗ ## 密度梯度 、 : ; ; ; ;  、
< Ε 下离心
!; Δ 4− , 从玉米悬浮细胞的原生质体得到胞质体的纯度为 & 写一  写) 乃, 口78Μ . Δ +7 Δ +3 4Σ
8 + % 和 Λ 48 ∗ 3 4. − . 3. 占. 8 + Δ 的胞质体纯度为  : Φ ∋  ( Φ 。分析上述结果如此不同的原因 , 除
离心力大小不同 , 有的研究者用 Κ Ρ Ο Α 或细胞松驰素 ∀8Μ3 ∗8 1. #. 7 4− 2∃ 处理原生质体外 ,
另一个重要因素就是原生质体来源和状态 , 下胚轴原生质体的细胞核被明显的细胞质索
固着 , 比去掉悬浮细胞原生质体的细胞核要难得 多 , 这一点从 Η 57 − 5 Μ 等 〔‘〕和我们的实验
结果得到了证实 。离心机的角式转头越靠近底部其离心力越大 , 减少了离心管中的液体体
积 , 实际上增加 了上层原生质体所受的离心力 , 这也是本实验中在较低的离心力条件下得
到较好的胞质体制备效果 的原因 。 可以预计 , 利用更高离心力条件 , 胞质体的纯度还可以
提高 。
叮睫橙是一种染料 , 曾用于细胞核染色 。 叮睫橙能插入 Κ Λ ≅ 分子间造成移码突变 。
大量 的 ≅ Α 能与 Κ Λ ≅ 形 成 ≅ Α 一Κ Λ ≅ 复合体 , 在可见光的辐照作用下导致其化学键断
裂 , 使 Κ Λ ≅ 降解川 , 适宜的 ≅ Α 浓度会使细胞核不可逆失活 , 可望成为一种化学处理制
备胞质体的新方法 。 最近 , 何亚文等 〔(〕以 ≅ Α 失活处理的马铃薯栽培 品种与罗丹明 ! ⎯ 失
活的野生种融合 , 可发生代谢互补恢复分裂 , 已得到假定的杂种小愈伤组织 。在本实验 中 ,
从对表 < 的分析可以看出 , 应当存在一个临界值 , 即在某种 ≅ Α 浓度和一定光照时间下 ,
原生质体的细胞核恰恰不可逆失活而细胞质仍有活力 , 整个原生质体在某种程度上可被
认为是胞质体 。进一步的工作是把这样的胞质体与正常原生质体融合 , 对再生植株进行胞
质基因的遗传分析 , 以澄清其用于胞质基因组转移的可能性 。
参 考 文 献
Ρ . #4? . = , Ω ∗ , _ Τ Ν # . _ . , ⎯ 5 3 . #Ν Ε Μ 3∗ Β #. 7 3一 Β , ∗ 3 ∗ Β #. 7 3 /+ 7 4∗ − /∗ , 4− 3 5 , 7 Β 5 5 4/45 5 1#∗ , ∗ Β #. 7 3 3, . − 7/5 , 4− Λ 48∗ ,4. , 矛. Ν 人夕。#
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何亚文 Ν 李耿 光 , 张兰英 Ν 叮陡橙失活处理应用于不对称融合初步探讨 Ν 热带亚热带植物学报 ,
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李昌功 , 周嫦 Ν 杨弘远 Ν 芸苔属花粉 一下胚轴原 生质体融合再生杂种小植株Ν 植物学报 ,
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第
期 李昌功等 % 甘蓝型油菜胞质体大量制备技术的研究

ΟΞ ς Κ ΩΠ Ο Α Λ 2 ς Η Θ = 6 Α Κ ς Ε Ξ ΩΑ Λ Α Ζ ΕΥ Ξ Α =Η ≅ ΟΞ Ο
Ζ 6 Α Ρ Τ Υ =Α Ε Α Ξ Υ Η Α Ζ 2 6 ≅ ΟΟ ΩΕ≅ Λ ≅尸ς Ο
Η 4 Ε 1. − ? ? ∗ − ? Ο + − Τ . 4Β 5 − ? Ι 1∗ + Ε 1. − ? Υ . − ? Τ ∗ − ? Μ + . −
∀扬加。3∗ 即 可 =#. , % , 6 叻八, ) “8 ,4。 , 2 4∗ #∗刀 , Ε∗ ##尸? 5 ) Η 4/8 Ο % 4。 , 8 。 , 0 + 1 . , % ς , % % 二。, 7 43Μ 0 + 1 . − 9 ( ; ; & < ∃
≅ [ 7 3 , . 5 3 2 + #α 5 Μ 3 ∗ Β #. 7 3 7 Ψ 5 , 5 = , ∗ > + 5 5 > /, ∗ Δ 1 ΜΒ ∗ 5 ∗ 3 Μ # Β , ∗ 3∗ Β #. 7 3 7 ∗ / 2 Ν − .= + 7 [ Μ
Δ 5 . − 7 ∗ / . > 47 5 ∗ − 3 4− + ∗ + 7 =5 , 5 ∗ ## > 5 − 7 43Μ ? , . > 45 − 3 5 5 − 3, 4/+ ? . 34∗ − ∗ , 3, 5 . 3Δ 5 − 3 Ψ 431 . 5 , 4Σ
> 4− 5 ∗ , . − ? 5 ∀≅ Α ∃/∗ ##∗ Ψ 5 > [Μ 5 ϑ Β ∗ 7 + , 5 3 ∗ #4? 1 3 4, , . > 4. 3 4∗ − Ν Ρ ∗ ,5 3 1. − ; Φ 5Μ 3∗ Β #. 7 3 7
Ψ 5 , 5 ∗ [3 . 4− 5 > 4− 31 5 4− 3 5 , Β 1. 7 5 [5 3Ψ 5 5 − 0 Ο 7 ∗ #+ 3 4∗ − . − > 7Φ =5 , 5 ∗ ## 4− . > 47 5 ∗ − 34− + ∗ + 7
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< Ε : ; ; ; ;  ∀
∗ ∗ ∗ , Χ Δ 4− ∃ Ν Ξ 15 Β ,∗ Σ
3 ∗ Β #. 7 3 7 3 , 5 . 3 5 > Ψ 43 1 ; Δ ? Χ Η ≅ Α ∀
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1 > + , 4− ? Δ . 5 5 , . 3 4∗ − ∃ Β #+ 7 : 1 4, , . > 4. 3 4∗ −
∀9 ; ; ; #ϑ ∃ ,
; ; Δ ? Χ Η ≅ Α Β #+ 7 < 1 4, , . > 4. 34∗ − ∗ ,
< ; Δ ? Χ Η ≅ Α Β #+ 7
1 4, , . > 4. 3 4∗ − 7 5 #Σ
> ∗ Δ > 4∴ 4> 5 > 4− 5 + #3 + , 5 , [ + 3 5 ∗ + #> 7 + , ∴ 4∴ 5 /∗ , Δ ∗ , 5 3 1. − ( > . Μ7 Ν ≅ 7 #4? 1 3 4− > + 5 5 > /, . ? Σ
Δ 5 − 3. 3 4∗ − ∗ / ≅ Α 一Κ Λ ≅ 5 ∗ Δ Β #5 ϑ , 5 7 + #34− ? 4− > 5 ? , . > . ,4∗ − ∗ / Κ Λ ≅ , 3 15 − + 5#5 + 7 4− . 5 3 4∴ . 35 >
4, , 5 ∴ 5 , 7 4[ #Μ , 31+ 7 31 5 Β ,∗ > + 5 37 Δ . Μ [ Μ 5 ∗ − 7 4> 5 , 5 > . 7 5 Μ 3 ∗ =#. 7 3 7 Ν
Θ 5Μ Ψ ∗ , > 7 2 ,. 7 7 48 . − . =+ 7 , Ε Μ 3∗ Β #. 7 3 , =5 , 5 ∗ ## , ≅ 5 , 4> 4− 5 ∗ , . − ? 5