全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(8): 11221133 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2003-Q04)资助。
This study was supported by the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology (948 Program) (2011-G15).
* 通讯作者(Corresponding author): 徐明良, E-mail: mxu@cau.edu.cn, Tel: 010-62733166
第一作者联系方式: E-mail: liu_yongj@126.com
Received(收稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-05-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160530.0905.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01122
玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析
刘永杰 马传禹 马雪娜 徐明良*
中国农业大学国家玉米改良中心, 北京 100193
摘 要: 赤霉菌茎腐病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum, 有性态, Gibberella zeae)引起的一类土传性病害, 严
重危害玉米的产量和品质。本研究依据玉米第 10和第 1染色体上的 2个抗茎腐病 QTL, qRfg1和 qRfg2、培育近等基
因系 NIL-R (2个 QTL位点均为抗病等位基因)和 NIL-S (2个 QTL位点均为感病等位基因)。在成株期和幼苗期接种
禾谷镰刀菌, 两近等基因系的抗性差异均显著。用 2个近等基因系的幼根接种禾谷镰刀菌, 进行转录组分析研究。结
果表明, 与 NIL-S相比, NIL-R在接种禾谷镰刀菌后, 乙烯(ethylene, ET)合成、信号途径基因, 病程相关蛋白、脱氧
雪腐镰刀菌烯醇毒素(deoxynivalenol, DON)解毒基因等呈现特异上调表达。与 NIL-S 相比, 有 1170 个基因在 NIL-R
对照组中表达量较高, 其中水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯合成和信号介导途径以及苯丙
烷合成途径中的基因显著富集; 接种禾谷镰刀菌 6 h或 18 h后, 病程相关蛋白、激素 JA和 ET合成基因、DON解毒
基因在 NIL-R中表达量较高。
关键词: 玉米; 茎腐病; 转录组; 抗性; JA/ET; 苯丙烷
Transcriptional Analysis of Maize Resistance against Fusarium graminearum
LIU Yong-Jie, MA Chuan-Yu, MA Xue-Na, and XU Ming-Liang*
National Maize Improvement Center of China, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: Gibberella stalk rot, caused by Fusarium graminearum (teleomorph, Gibberella zeae), is one of the most devastating
soil-borne diseases in maize. It seriously decreases maize yield and quality. Molecular mapping led to the identification of two
QTLs, qRfg1 and qRfg2, on chromosomes 10 and 1 respectively, conferring resistance to Gibberella stalk rot. In order to charac-
terize the defense mechanism of maize against F. graminearum, NIL-R with resistant alleles at both QTLs and NIL-S with the
susceptible alleles at both QTLs were generated and used in transcriptome analysis. After inoculation of young seedling roots of
both NILs with the F. graminearum spores, the inoculated roots were sampled at 0, 6, and 18 hours after inoculation (hai) for
transcriptome analysis using RNAseq. The basal difference was achieved by the comparison between control samples. In total,
2958 genes were differentially expressed between control samples of NIL-R and NIL-S, among which 1170 genes were more
abundant in NIL-R. GO analysis revealed that genes involved in biological processes related to JA/ET and SA biosynthesis, JA/ET
mediated signaling pathway and SA mediated signaling pathway were significantly enriched. Phenylpropanoid biosynthesis proc-
ess was enriched in the genes more abundant in NIL-R and genes encoding enzymes involved in phenylpropanoid biosynthesis
like PAL, 4CL2, CAD, and HCT were more abundant in NIL-R. There were 431 genes differentially expressed between NIL-R
and NIL-S at 6 hai, among which 83 genes were more abundant in NIL-R. Genes encoding pathogenesis-related (PR) proteins like
lipid-transfer protein and germin-like protein were more abundant in NIL-R. Among the 1292 genes differentially expressed be-
tween NIL-R and NIL-S. At 18 hai, 291 genes were more abundant in NIL-R. Genes involved in ET biosynthesis like ACO and JA
biosynthesis like LOX were more abundant in NIL-R. Genes involved in DON detoxification like PDR1 and MDR2 were more
abundant in NIL-R. After inoculation with F. graminearum, 428 genes were exclusively up-regulated in NIL-R at 6 hai compared
with control. Genes involved in ET biosynthesis and ET-mediated signaling pathway like ACO, ERF, EBF1, and EIL1 and patho-
genesis-related genes like PR1, OSM34, and germin-like protein were exclusively up-regulated in NIL-R. At 18 hai, 359 genes
were exclusively up-regulated in NIL-R compared with control. Pathogenesis-related genes like PR1, PR4, and genes encoding
第 8期 刘永杰等: 玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析 1123


the transporters of DON out of cytoplasm like ABC transport family protein, heavy metal transport protein and MATE efflux fam-
ily protein were exclusively up-regulated in NIL-R. All these results indicate that NIL-R can increase the resistance of maize to F.
graminearum by the constitutive resistance characterized by the higher expression of genes related to defense responses. Genes
involved in defense responses exclusively up-regulated in NIL-R and higher expression level of disease resistance genes in NIL-R
at 6 and 18 hai may restrict the pathogen invasion after infection. The phenylpropanoid biosynthesis pathway and
DON-detoxification proteins identified in this study are important for the resistance against F. graminearum infection.
Keywords: Maize; Stalk rot; Transcriptome; Resistance; JA/ET; Phenylpropanoid
玉米茎腐病, 又称茎基腐病, 是一类危害严重
的土传性病害, 降低玉米的产量和品质。茎腐病由
多种病原菌通过根系或茎基部伤口单独或复合侵染
玉米所致, 其中包括腐霉菌、炭疽菌和镰刀菌等。
赤霉菌茎腐病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminea-
rum, 有性态 Gibberella zeae)引起[1]。该病原菌还可
引起玉米穗腐病 [2], 小麦 [3]和大麦 [4]赤霉病。此外 ,
禾谷镰刀菌还可以侵染水稻[5]和拟南芥[6]。
禾谷镰刀菌是镰刀属致病菌的一种, 该类病菌
分泌的脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素 (deoxynivalenol,
DON), 严重危害人畜的健康; 美国食品药品委员会
规定实用面粉中该毒素的含量不能超过 1 µg g–1 [7]。
DON 对细胞功能的影响在动物中研究较为深入, 有
报道称DON可与 60S核糖体亚基结合来抑制蛋白质
的合成, 进而激活细胞衰亡程序导致细胞死亡[8-10]。植
物中, DON可体外抑制小麦核糖体中蛋白的合成[11]。
DON 并非病原菌生长必需, 但有报道称该毒素影响
病原菌致病性, DON 可作为一种有毒因子参与到病
原菌侵染寄主的过程中[10]。与野生型相比, 毒性合成
基因 tri-5突变株在侵染小麦和玉米时致病力减弱[12-14];
DON 不仅可引起细胞内过氧化氢的积累以至于引
起细胞程序化死亡, 还可以激活抗性响应基因病程
相关蛋白(PR)的表达[15]。寄主细胞可通过诱导毒素
降解基因或毒素转运基因的表达来降解毒素或将毒
素转运出胞质[16]。小麦抗赤霉病 QTL-Fhb1 可能编
码一种DON-葡糖基转移酶(DON-glucosyltransferase,
DOGT)或者能够调节该转移酶的蛋白[17]。有报道指出
UDP-葡糖基转移酶(UDP-glucosyltransferases, UGTs)
和 ABC 转运蛋白(ABC transporters)能够降低 DON
的毒性[17-18]。DON或镰刀菌接种的寄主中都会诱导
产生解毒蛋白如谷胱甘肽 S-转移酶 (glutathione
S-transferases, GSTs)、多药抗性蛋白 multidrug re-
sistance protein (MRP)、MATE efflux family proteins、
重金属转运蛋白(heavy metal transport/detoxification
proteins)、多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance,
PDR)、 PDR 类 ABC 转运蛋白 (PDR type ABC
transporters)等[19-21]。
Kruger 等[22]将禾谷镰刀菌接种到小麦颖壳后发
现 312 个基因差异表达, 其中包括编码苯丙烷代谢
途径的酶类、氧化还原过程酶类、GSTs、PR蛋白和
其他抗性或逆境相关的蛋白的基因; Boddu 等[20]利
用 DON接种大麦后发现被诱导的主要为 PR蛋白基
因、氧化胁迫相关基因、苯丙烷类合成酶。Zhu等[23]
以 F. oxysporum 接种拟南芥后发现多种植物激素,
茉莉酸(jasmonic acid, JA)、乙烯(ethylene, ET)、水杨
酸(salicylic acid, SA)、生长素(auxin)及信号传导途径
基因都被诱导。Lanubile 等[24]利用 Fusarium verti-
cillioides 接种穗腐病抗性不同的玉米后发现, 编码
PR蛋白、苯丙烷代谢途径酶类的基因、氧化胁迫相
关基因、ET信号途径的基因在抗病和感病材料中都
被诱导, JA信号途径在抗病材料 CO441中被诱导。
尽管目前对茎腐病的研究较多, 多个抗茎腐病
QTL 和基因都被定位, 但茎腐病的抗病机制仍不是
很清楚。本研究利用不同抗性水平的近等基因系接
种禾谷镰刀菌后进行转录组测序, 试图揭示玉米对
禾谷镰刀菌的抗性机制, 对于研究寄主和病原菌互
作, 加速茎腐病抗性育种进程具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 玉米材料
早期研究中, 本实验室利用抗病自交系 1145 和
感病自交系 Y331配制回交群体定位了 2个抗茎腐病
QTL, qRfg1和 qRfg2, 抗病等位基因均来自 1145。在
高世代回交群体中, 分别挑选带有最短 qRfg1 (0.7
Mb)和 qRfg2 (4 Mb)抗病区段的二个重组个体, 杂交
后自交, 得到近等基因系 NIL-R (qRfg1++/qRfg2++)
和NIL-S (qRfg1– –/qRfg2– –)。利用GoldenGate 3KSNP
(Illumina, San Diego, CA, USA)对 2个 NIL的基因组
进行检测, 发现二者 99%以上的遗传背景和轮回亲
本 Y331 一致。从 2 个近等基因系各取 80 粒种子进
行发苗。种子经灭菌的 ddH2O浸泡 12 h后用 70%的
酒精消毒5 min。用灭菌的ddH2O冲洗一次, 再用10%
的次氯酸钠(NaClO)浸泡 30 min, 浸泡过程中每隔 10
min 摇晃一次, 再用灭菌的 ddH2O 冲洗 3 次后转置
1124 作 物 学 报 第 42卷

20%的多菌灵(carbendazol)溶液中浸泡 12 h, 用灭菌
的 ddH2O 冲洗干净后放入灭菌的发芽盒中。将发芽
盒于 16 h光照/8 h黑暗, 温度为(27±1)℃的光照培养
箱中培养。待玉米根长到 6~8 cm长时接种禾谷镰刀
菌孢子液。
1.2 孢子液培养和接菌
利用绿豆培养基(mung bean medium)培养禾谷
镰刀菌, 获取孢子液[25]。首先将禾谷镰刀菌在 PDA
培养基上扩繁, 待菌丝长满整个培养基时, 将整个
PDA 培养基接种到绿豆培养基中, 将绿豆培养基在
180转 min–1的转速下暗培养 7 d, 整个过程保持 25
℃的恒定温度。用纱布将绿豆培养基过滤, 去除菌
丝、孢子囊和 PDA 培养基; 然后将过滤液在 4℃离
心机中以 7500 × g的速度离心 15 min后去除上清液;
得到的孢子经灭菌的 ddH2O 悬浮混匀后, 浓度调至
1×107个 mL–1, 于 4℃冰箱保存备用。在转速为 50×g
的摇床上, 将玉米根在孢子液中浸泡 1 h, , 以保证
孢子液悬浮; 再将接种后的玉米幼根转移至(27±1)
℃, 16 h光照/8 h黑暗的恒温培养箱中培养。
1.3 总 RNA提取
接种后 0 h (将玉米幼根在孢子液中浸泡后立即
取出)、6 h和 18 h取样, 每个样品由 10根玉米幼根
组成, 设 2 个生物学重复。立刻将样品用液氮冷冻
并转移至70℃保存备用。按照 TRIzol 试剂盒
(Invitrogen公司, 美国)说明书提取玉米幼根总 RNA,
并用 RNeasy Mini试剂盒(Qiagen公司, 荷兰)处理。
用 Nanodrop 分光光度计和 1%琼脂糖凝胶检测所提
取总 RNA的浓度和质量。将所得的 RNA样品用于
转录组测序。
1.4 转录组测序
测序所用 RNA 由贝瑞和康公司进行测序文库
的构建并利用 Illumina HiSeq 2000平台对 12个样品
的 cDNA文库测序。测序所得的原始序列(raw reads)
经过质量处理(去除短片段和低质量片段)后得到高
质量 clean reads。
1.5 转录组数据分析
利用 Tophat 2.0.7将得到的 clean reads与 B73玉米
基因组比对[26], 只保留能够特异比对到玉米基因组的
片段用于后续分析。利用 FPKM (Fragments Per Kilobase
of exon model per Million mapped reads)计算基因的表
达量, 随后用 DEseq进行差异基因的筛选[27]。筛选条件
为两基因之间的 P-value/FDR < 0.05, Foldchange > 1。根
据玉米基因组注释基因, 对于玉米中无功能注释信息
的基因, 通过 Blast2Go比对拟南芥数据库进行注释[28]。
将所得差异基因进行 Gene Ontology (GO)分析[29]。
1.6 荧光定量 PCR
荧光定量 PCR 中用到的 cDNA 是利用 M-MLV
第 1链合成试剂盒(Invitrogen, 美国)合成。荧光定量
PCR用到的染料为 SYBR Green II (TaKaRa, 日本),
仪器为 Roter-Gene 6000 (Corbett Research, 悉尼, 澳
大利亚)。PCR过程中以玉米 GADPH作为内参基因,
以 2−ΔΔCt方法计算基因的相对表达量, 每个基因设 2
个生物学重复。荧光定量 PCR 中用到的引物均用
Primer 3.0设计, 所选基因及引物序列见表 1。

表 1 Real-time qRT-PCR分析中所用引物序列信息
Table 1 Primers used in real-time qRT-PCR analysis
基因编号
Gene ID
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
GRMZM2G148087 TCGAGGTACAAGGCCATGAC CTGGAACGAGAAGTCTGGGT
GRMZM2G103342 AGTAGATGATCCCTGTCCGC GCCGCCACCCTCTTATTAGA
GRMZM2G112488 TGAAGGTGGACTCGACGTAC CGATCGCATGCATGGTCTAG
GRMZM2G127087 GACCAGACAAGAGCTACCGA CCCATTCCAACAAACGCAGA
GRMZM2G402631 CGGCAACAGCAACTACCAAG GCACACAAATCCAGCTACGT
GRMZM2G453805 CGTGCAGAACAACTACAGCA ATGCGTCTTTGTCTCCCGAT
GRMZM2G162505 ACCTCCACCAATCCAACCAA CAACAGCCGCTACAAGTACC
GRMZM2G169726 CTCTCGTTCACAGTGCAAGC CACGGACTTTTGCTTGGACA
GRMZM2G336824 CCACCCTTCTCCAGATCCTC AGACTCACAAAGGGAGCCAA
AC205502.4_FG004 AGAGGTCACACGCTTCATGA GCCATGCTCACTGATGTAGC
GRMZM2G136372 GGACGCCATGGATGCTATTC GAATAGCATCCATGGCGTCC
GRMZM2G006853 TCCTCCACACTACAAACGCA GGACGCCATGGATGCTATTC
GRMZM2G065585 TCGAGACCTACATCTTCGCC GACCTCGGCGTCTTGTTTAG
GRMZM2G118809 GCCTATGCCACATTTGCACT GCTTCATCTTCGTGCTCCTG
GRMZM2G028306 AGAGAAAAGGCTGGAGTGCT GATTTAGTCGCTGCAGGGTG

第 8期 刘永杰等: 玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析 1125


2 结果与分析
2.1 表型鉴定
在成株期和幼苗期, 分别评价 NIL-R 和 NIL-S
对禾谷镰刀菌的抗性。与 NIL-S相比, NIL-R在 2个
时期均可显著提高玉米对禾谷镰刀菌的抗性(图 1)。

图 1 玉米在成株期和幼苗期对禾谷镰刀菌的抗性
Fig. 1 Disease resistance against F. graminearum at seedling
and mature stages.
A: NIL-R和 NIL-S在幼苗期对禾谷镰刀菌的抗性; B: NIL-R和
NIL-S在成株期对禾谷镰刀菌的抗性。**代表与 NIL-S相比,
NIL-R极显著(P ≤ 0.01)提高玉米对禾谷镰刀菌的抗性。
A: disease resistance of NIL-R and NIL-S against F. graminearum
at seedling stage; B: disease resistance of NIL-R and NIL-S against
F. graminearum at mature stage. ** indicates significance at P ≤
0.01 when compared NIL-R with NIL-S.

2.2 转录组测序质量及 reads的比对
转录组测序后, 2个 NIL共得到 175 570 000个
reads, 平均每个样品中 reads数为 29 261 667。对每
个样品 reads 进行质量检测, 各样品的 Q30 均值为
94.6, Q20均值为 86.1。所有样品的 2个生物学重复
之间的皮尔森系数高于 0.96。利用 Tophat 2.0.7将所
得 reads与B73基因组参考序列比对, 共 131 170 000
个 reads 可比对到 B73 基因组上, 平均每个样品有
21 861 667 个; 114 640 000 个 reads 可特异比对到
B73基因组上, 平均每个样品有 19 106 667个。
2.3 荧光定量 PCR
在NIL-R和NIL-S中选取 15个差异表达的基因,
利用实时荧光定量 PCR检测禾谷镰刀菌接种后 0 h、
6 h和 18 h基因的表达情况。如图 2, 两平台数据间
的皮尔森相关系数为 0.78, 说明了 RNAseq 数据的
可靠性, 可进行禾谷镰刀菌接种后的转录组分析。
2.4 接种禾谷镰刀菌后 NIL-R 和 NIL-S 中基因
的差异表达
接种禾谷镰刀菌后, 对 NIL-R 和 NIL-S 中基因
的表达进行分析, 共检测到 5583个基因差异表达(图
3)。与对照组相比, 接种后 6 h, 1495个基因在 NIL-R
中差异表达, 其中 940个上调表达, 555个下调表达;
NIL-S中有 2964个基因差异表达, 其中 1455个上调
表达, 1509 个下调表达。接种后 18 h, NIL-R 中有
1846 个基因差异表达, 其中 1317 个上调表达, 529
个下调表达; NIL-S 中有 3856 个基因差异表达, 其
中 2018个上调表达, 1838个下调表达。

图 2 Real-time qRT-PCR分析验证实验
Fig. 2 Validation of DEGs by qRT-PCR
散点图代表两种平台中 log2转化后的基因表达水平。
Scatter plots indicate the log2 transformed expression values in
qRT-PCR analysis and RNAseq for 15 selected genes.

图 3 接种禾谷镰刀菌后, NIL-R和 NIL-S中差异表达的基因
Fig. 3 The expression pattern of differentially expressed genes
in NIL-R and NIL-S during infection of F. graminearum
图中每列代表该时间点与对照相比的差异倍数 log2的转换值。标
尺表示的是与对照相比该基因的表达情况: 红色代表该基因上
调表达; 蓝色代表该基因下调表达。
Each column represents the log2 fold change of differentially ex-
pressed genes at the indicated times relative to the levels of control
samples. The color scale indicates transcript abundance relative to
the control samples: red, increase in relative transcript abundance;
blue, decrease in relative transcript abundance.
1126 作 物 学 报 第 42卷

接种后 6 h, NIL-R和 NIL-S中共有的差异基因
1067个, NIL-R特有差异基因 428个, NIL-S特有差
异基因 1897 个; 接种后 18 h, 共有差异表达基因
1267个, NIL-R特有的 579个, NIL-S特有的 2589个
(图 4-A)。分析共有差异表达基因后发现, 接种后 6 h,
NIL-R和 NIL-S有 669个基因上调表达, 390个基因
下调表达, 5个基因在 NIL-R中上调而在 NIL-S中下
调表达, 3个基因在 NIL-R中下调而在 NIL-S中上调
表达; 接种后 18 h, NIL-R和 NIL-S共有的差异表达
基因中, 949个上调表达, 304个下调表达, 9个基因
在 NIL-R中上调而在 NIL-S中下调表达, 5个基因在
NIL-R 中下调而在 NIL-S 中上调表达。NIL-R 和
NIL-S 共有差异表达基因中, 上调表达的基因多于
下调表达的基因(图 4-B)。

图 4 接种禾谷镰刀菌后 NIL-R和 NIL-S中差异表达基因的维恩图
Fig. 4 Veen diagrams of all the differentially expressed genes (DEGs) in the resistant NIL-R and susceptible NIL-S after inoculation
of F. graminearum
A: 接种 6 h和 18 h后, NIL-R和 NIL-S中差异基因的维恩图; B: 接种 6 h和 18 h后, NIL-R和 NIL-S中共有表达基因的表达趋势。
A: differentially expressed genes in NIL-R and NIL-S at 6 and 18 hai; B: up- and down-regulated genes among common DEGs in NIL-R and NIL-S.

2.5 NIL-R特异上调表达的抗病相关基因
接种后 6 h, NIL-R中特有的 428个差异基因中,
上调表达的 266个, 下调表达的 162个; 接种后 18 h,
NIL-R中特有的 579个差异基因中, 上调表达的 359
个, 下调表达的 220 个。为研究 NIL-R 对禾谷镰刀
菌的抗性响应, 对 NIL-R 中 2 个时间点特有上调表
达的基因进行分析。接种后 6 h, NIL-R中多种和抗
病相关的基因特有上调表达(表 2), 包括编码 ET 合
成酶 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase 1,
ACO)和乙烯信号途径中 ethylene-responsive factor-
like protein 1 (ERF1)、EIN3-binding F-box protein 1
(EBF1)、ETHYLENE-INSENSITIVE3-like 1 (EIL1),
病程相关蛋白 PR4、索马甜蛋白(putative thaumatin
domain family protein)、germin-like protein 2 frag-
ment (GLP2 fragment)、脂转运蛋白 (lipid-transfer
protein, LTP)及其他抗性相关蛋白 GST23、过氧化物
酶(peroxidase 16, POD16)、LRR 激酶(leucine-rich
repeat protein kinase family protein)的基因。
接种后 18 h, NIL-R中有 359个基因特有上调表
达 , 其中包括编码解毒蛋白 ABC 类转运蛋白
(ABC-2 type transporter family protein)、重金属转运
蛋白(MATE efflux family protein), 及编码病程相关
蛋白(PR1、PR4), 编码激酶类基因和苯丙烷代谢途
径中合成木质素的羟基肉桂酰辅酶 A奎尼羟基肉桂
转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA hikimate/quinate hy-
droxycinnamoyl transferase, HCT)的基因等(表 3)。
第 8期 刘永杰等: 玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析 1127


表 2 接种后 6 h, NIL-R中特异上调表达的抗病相关基因
Table 2 Disease resistance genes specifically up-regulated in NIL-R at 6 hai
基因编号
Gene ID
差异倍数
FC (6 h/0 h)
基因功能
Gene function
GRMZM2G445575 2.20 TGACG motif 结合因子 TGACG motif-binding factor 4 (TGA4)
GRMZM2G013448 3.47 乙烯合成基因 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase 1 (ACO1)
GRMZM2G018984 2.25 ERF家族转录因子 Integrase-type DNA-binding superfamily protein (encodes an ERF family protein)
GRMZM2G111415 2.48 ERF家族转录因子 Integrase-type DNA-binding superfamily protein (encodes an ERF family protein)
GRMZM2G053503 2.80 乙烯响应蛋白 Ethylene-responsive factor-like protein 1 (ERF1)
GRMZM2G137582 2.37 EIN3-binding F-box protein 1 (EBF1)
GRMZM2G003558 2.32 ETHYLENE-INSENSITIVE3-like 1 (EIL1)
GRMZM2G147809 2.25 DREB2A互作蛋白 2 DREB2A-interacting protein 2 (DRIP2)
GRMZM2G117942 3.51 病程相关蛋白 PR4
GRMZM2G122018 3.19 萌发素类似蛋白片段 Germin-like protein 2 fragment
GRMZM2G092474 2.46 索马甜功能域蛋白家族 Putative thaumatin domain family protein
GRMZM2G379898 5.92 脂类转移酶 Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein
GRMZM2G416632 2.26 谷胱甘肽转移酶 Glutathione transferase 23 (GST23)
GRMZM2G170044 2.47 脂类结合蛋白 Lipid binding protein
GRMZM2G106511 2.53 损伤诱导蛋白 Wound-induced protein
GRMZM2G415390 2.51 抗病响应蛋白 Disease resistance-responsive family protein
GRMZM2G044049 3.22 过氧化物酶 Peroxidase superfamily protein
GRMZM2G080183 3.51 过氧化物酶 Eroxidase 16
GRMZM2G337768 5.61 类伴刀豆球蛋白凝集素蛋白激酶 Concanavalin A-like lectin protein kinase family protein
GRMZM2G002124 2.47 蛋白激酶 Protein kinase superfamily protein
GRMZM2G313643 2.02 富含亮氨酸重复的跨膜蛋白激酶 Leucine-rich repeat transmembrane protein kinase
GRMZM2G079583 2.14 富含亮氨酸重复的蛋白激酶家族蛋白 Leucine-rich repeat protein kinase family protein
GRMZM2G497710 2.63 蛋白激酶 Protein kinase superfamily protein
GRMZM2G009166 2.06 凝集素蛋白激酶 S-locus lectin protein kinase family protein
GRMZM2G118657 2.01 葡糖基转移酶 UDP-glucosyl transferase 85A7 (UGT85A7)
GRMZM2G135862 5.66 类受体蛋白 Receptor like protein 38
FC: fold change.

表 3 接种后 18 h, NIL-R中特异上调表达的抗病相关基因
Table 3 Disease resistance genes specifically up-regulated in NIL-R at 18 hai
基因编号
Gene ID
差异倍数
FC(18 h/0 h)
基因功能
Gene function
GRMZM2G059799 2.81 乙烯响应蛋白 Ethylene-responsive protein
GRMZM2G099867 2.18 脂类结合蛋白 Lipid binding protein
GRMZM2G031102 2.19 脂类结合蛋白 Lipid binding protein
GRMZM2G170044 2.38 脂类结合蛋白 Lipid binding protein
GRMZM2G127251 2.13 羟基肉桂酰辅酶 A奎尼羟基肉桂转移酶
Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase (HCT)
GRMZM2G025971 5.50 羟基肉桂酰辅酶 A奎尼羟基肉桂转移酶
Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase (HCT)
GRMZM5G874756 2.08 ABC类转运蛋白 ABC-2 type transporter family protein
GRMZM2G123486 2.41 重金属转运/解毒蛋白 Heavy metal transport/detoxification superfamily protein
GRMZM2G132690 3.28 重金属转运/解毒蛋白 Heavy metal transport/detoxification superfamily protein
GRMZM2G031938 2.07 解毒蛋白 MATE efflux family protein
GRMZM2G367348 5.45 病程相关蛋白 PR1
1128 作 物 学 报 第 42卷

(续表 3)
基因编号
Gene ID
差异倍数
FC (18 h/0 h)
基因功能
Gene function
GRMZM2G419675 22.05 病程相关蛋白 PR4
GRMZM2G162505 2.25 几丁质酶 Chitinase 2
GRMZM2G006047 2.22 脂类转移酶 Lipid transfer protein
GRMZM2G431506 2.08 呼吸爆发氧化酶 Respiratory burst oxidase protein F (RBOH F)
GRMZM2G471357 2.07 过氧化物酶 Peroxidase 52 (POD52)
GRMZM2G451097 3.38 过氧化物酶 Peroxidase superfamily protein
GRMZM2G410766 2.00 逆境响应蛋白 Stress responsive protein
GRMZM2G073884 16.07 富含亮氨酸重复的跨膜蛋白激酶 Leucine-rich repeat protein kinase family protein
GRMZM2G421669 Inf 富含亮氨酸重复的跨膜蛋白激酶 Leucine-rich repeat protein kinase family protein
GRMZM2G084825 2.48 富含半胱氨酸的受体激酶 Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase) 10 (CRK10)
GRMZM2G175874 2.57 富含半胱氨酸的受体激酶 Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase) 25 (CRK25)
GRMZM2G142037 2.03 类伴刀豆球蛋白凝集素蛋白激酶 Concanavalin A-like lectin protein kinase family protein
GRMZM2G134724 2.37 凝集素蛋白激酶 Lectin protein kinase family protein
GRMZM2G406601 15.58 凝集素蛋白激酶 Lectin protein kinase family protein
GRMZM2G022645 2.51 蛋白激酶 Protein kinase family protein
GRMZM2G002124 3.13 蛋白激酶 Protein kinase superfamily protein
GRMZM2G397889 8.60 凝集素受体激酶 Receptor lectin kinase (RLK)
GRMZM2G387381 2.50 受体激酶相关蛋白 Receptor-like protein kinase-related family protein
GRMZM2G076417 7.06 类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶 Subtilisin-like serine endopeptidase family protein
Inf代表该基因在对照组不表达, 在接种后 18 h时表达。
FC: fold change. Inf means this gene only expressed at 18 h, but not expressed in control samples.

接种后 6 h, 5 个基因 (GRMZM2G429000、
GRMZM5G805132、GRMZM2G456217、GRMZM5
G847744、GRMZM2G576460)在 NIL-R 中上调而在
NIL-S 中下调表达。其中 GRMZM2G429000 和
GRMZM5G805132 编码赤霉素响应蛋白 2 (Gibbe-
rellin responsive 2, GAR2)。
接种后 18 h, 9 个基因 (GRMZM5G884819、
GRMZM2G084583、GRMZM2G392148、GRMZM2
G155216、GRMZM2G353753、AC207722.2_FG009、
AC190623.3_FG001、GRMZM2G081239、GRMZM2
G092427)在 NIL-R中上调而在 NIL-S中下调表达。
其中 GRMZM2G084583 编码 Typical P-type R2R3
Myb protein fragment, GRMZM2G081239 编 码
NOD26-like membrane integral protein, 5个基因编码
光吸收有关蛋白, 2个为功能未知蛋白。
2.6 NIL-R和 NIL-S间差异表达的基因
接种后 0 h, 2958个基因在 NIL-R和 NIL-S间差
异表达, 其中 1170 个基因在 NIL-R 中表达量较高,
1788个基因在 NIL-S中表达量较高(图 5)。接种后 6
h, 431 个基因在 NIL-R 和 NIL-S 间差异表达, 其中
83 个基因在 NIL-R 中表达量较高, 348 个基因在
NIL-S中表达量较高。接种后 18 h时, 1292个基因
在 NIL-R 和 NIL-S 间差异表达, 其中 291 个基因在
NIL-R中表达量较高, 1001个基因在NIL-S中表达量
较高(图 5)。两近等基因系之间差异表达的基因在 0 h
最多, 接种后 6 h最少。

图 5 NIL-R和 NIL-S间差异表达的基因
Fig. 5 Differentially expressed genes between NIL-R and
NIL-S
Up表示在 NIL-R中高表达, Down代表在 NIL-S中高表达。
Up means more abundant in NIL-S; down means more abundant in
NIL-R.
第 8期 刘永杰等: 玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析 1129


2.7 NIL-R 通过组成型高表达抗性相关基因抵
御禾谷镰刀菌入侵
对 NIL-R和 NIL-S在接种后 0 h的差异表达基
因进行分析, 获得二者间的本底差异。对 NIL-R 中
表达量较高的 1170个基因进行 GO 分析, 功能归为
3 类, 即生物学过程(biological process)、分子功能
(molecular function)和细胞组分(cellular component)。
就生物学过程中富集的 go term而言, 和抗病有关的
go term在 1170个基因中显著富集(FDR < 0.05)。植
物激素 JA、SA和 ET相关的生物学过程的基因显著
富集, 这些基因参与 JA合成、响应和信号介导途径,
ET合成、响应过程, SA合成、响应和信号介导途径
以及 SA介导的系统获得性抗性(SAR)。JA合成途径
中 编 码 12- 氧 - 植 物 二 烯 酸 还 原 酶 (12-oxo-
phytodienoic acid reductase, OPR3)和脂氧化酶
(lipooxygenase, LOX)的基因 , JA 信号途径中的
JAZ1、JAZ3、JAZ10等基因在 NIL-R中表达量较高。
乙烯合成酶, 如 ACC、ACO31、ACS2 (Acc synthase
2)、ACS7, 乙烯信号途径基因, 如 2个 ERF-1 (Eth-
ylene responsive element binding factor 1)、1个 ERF4
在 NIL-R 中高表达。此外, 次生代谢有关的生物学
过程, 如苯丙烷代谢途径、肉桂酸、香豆酸、植物
抗毒素合成途径在 NIL-R 本底表达量较高的基因中
显著富集(图 6)。编码苯丙烷代谢途径的关键酶苯丙
氨酸解氨酶(PHE ammonia lyase 1, PAL1)、PAL2的
基因 , 编码肉桂酸 -乙醇脱氢酶 (cinnamyl-alcohol
dehydrogenase, CAD)、木质素合成酶 HCT的基因在
NIL-R中表达量较高。由此表明, NIL-R可以通过抗
病相关基因的组成型高表达, 预先储存大量的抗病
次生代谢产物来抵抗病原菌的入侵。
2.8 禾谷镰刀菌侵染后 NIL-R 与 NIL-S 之间差
异表达的抗性相关基因
NIL-R 可以通过抗病相关基因的组成型高表达,
阻碍病原菌入侵来提高抗性。此外, 抗、感近等基
因系在接种 6 h和 18 h后有大量差异表达的抗性相
关基因。接种后 6 h, 在 NIL-R中表达量较高的抗病
相关基因主要编码类黄酮醇合成酶 (flavonol syn-
thase-like protein)、 transmembrane BAX inhibitor
motif-containing protein 4 (TMBIM 4)、 LTP 、
germin-like protein (GLP) subfamily 1 member 11、过
氧化物酶(peroxidase R15, POD R15)、LRR蛋白激酶
(leucine-rich repeat protein kinase family protein)、
CDPK 相关激酶 (CDPK-related kinase 1, CRK1;
CDPK-related kinase 3, CRK3)等蛋白的基因(表 4)。

图 6 NIL-R对照组中表达量较高基因的 GO功能分析
Fig. 6 GO analysis of genes more abundant in NIL-R control samples
图中所示为生物学过程分类中部分 go term。
Go terms in this figure are part of the go terms enriched in biological process.
1130 作 物 学 报 第 42卷

表 4 接种后 6 h, NIL-R中高表达的抗病相关基因
Table 4 Disease resistance genes more abundant in NIL-R at 6 hai
基因编号
Gene ID
差异倍数
FC (NIL-R/NIL-S)
基因功能
Gene function
GRMZM5G807276 2.02 类黄酮醇合成酶 Flavonol synthase-like protein
GRMZM2G162276 3.28 脂类转移酶 Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein
GRMZM2G094328 4.87 萌发素类似蛋白 Germin-like protein subfamily 1 member 11
GRMZM2G313184 2.29 过氧化物酶 Peroxidase R15
GRMZM2G378949 4.61 钙依赖蛋白激酶 CDPK相关激酶 CDPK-related kinase 1 (CRK1)
GRMZM2G138245 2.30 钙依赖蛋白激酶 CDPK相关激酶 CDPK-related kinase 3 (CRK3)
GRMZM2G160619 3.16 富含亮氨酸重复的跨膜蛋白激酶 Leucine-rich repeat protein kinase family protein
GRMZM2G014672 2.19 含 BAX抑制 motif的跨膜蛋白 Transmembrane BAX inhibitor motif-containing protein 4
GRMZM2G009837 5.55 bHLH DNA结合蛋白 Basic helix-loop-helix (bHLH) DNA-binding superfamily protein
GRMZM2G087445 6.24 bHLH DNA结合蛋白 Basic helix-loop-helix (bHLH) DNA-binding superfamily protein
GRMZM2G147809 3.59 DREB2A互作蛋白 DREB2A-interacting protein 2 (DRIP2)
GRMZM2G455869 2.07 转录因子 MYB52
GRMZM2G076417 3.61 类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶 Subtilisin-like serine endopeptidase family protein
FC: fold change.

接种 18 h后, 在 NIL-R中表达量较高的抗病相
关基因包括 ET合成相关基因 ACO、ACO1, JA合成
基因 LOX10, 编码多种激酶 , 如 CRK1、 BAK1
(BRI1-associated receptor kinase 1)、富含半胱氨酸受
体激酶 10 (cysteine-rich RECEPTOR-like protein
kinase 10, CRK10)、LRR 激酶、细胞壁相关激酶
(wall-associated kinase 2, WAK2)、LRR 受体激酶
(LRR-RLK family protein)的基因, 编码木质素合成
关键酶 HCT、解毒蛋白 PDR1、多药抗性相关蛋白 2
(multidrug resistance associated protein 2, MDR2)、
POD R15的基因等(表 5)。
3 讨论
禾谷镰刀菌是一类危害严重的病原菌, 它可以
侵染大麦、小麦、玉米等多种禾谷类作物。禾谷镰
刀菌属半活体营养型病原菌, 其特点为病原菌侵入
寄主后先以活体营养型存活, 当寄主出现局部组织
坏死和菌丝大量繁殖后, 病原菌再以坏死营养型在
寄主组织内繁殖。SA、JA/ET 在植物与病原菌的互
作中发挥重要作用; SA主要介导对活体营养型和半
活体营养型病原菌的抗性; JA/ET 主要针对坏死营
养型病原菌的入侵[30]。
JA可正向调节由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病
的抗性[16]。Xiao等指出, JA合成酶 AOS和 OPR3在
抗、感赤霉病小麦中都被诱导, 而 JA信号途径中的
COI1 和 JAZ 只在抗病材料中被诱导, 因此 JA 可正
向调控小麦对 F. graminearum的抗性[31]。ET合成基
因只在感病小麦中被诱导, 抗性小麦可通过抑制 ET
信号途径而提高抗性, 故 ET 可负向调控小麦对 F.
graminearum 的抗性[31]。而有报道指出, ET 合成基
因 ACO 在抗性材料中被诱导, 故 ET 也可正向调控
小麦对 F. graminearum 的抗性 [32-33]。本研究中 ,
JA/ET合成和信号途径相关基因在接种后 0 h、18 h
的NIL-R中表达水平较高; 且 ET合成基因 ACO, ET
信号途径中的基因 ERF、EBF1、EIL1在接种后 6 h
的 NIL-R 中特异上调表达, 说明本研究中 JA/ET 合
成和信号途径可正向调控玉米对 F. graminearum 的
抗性。
次生代谢产物在植物的生物和非生物胁迫中发
挥重要作用。苯丙烷代谢途径可产生木质素、黄酮
类、植物抗毒素等多种次生代谢产物[34]。PAL 是苯
丙烷代谢途径的关键酶, 可以催化苯丙氨酸向肉桂
酸的转化, 肉桂酸经 C4H 转化为香豆酸, 随后经
4CL转化为 4-酰基-辅酶 A。4-酰基-辅酶 A可经 CAD
和 HCT 转化为木质素, 也可经 CHS 和 FLS 转化为
黄酮醇。多个报道指出, 镰刀属病原菌侵染可诱导
PAL 的表达[19,22,24]。用 F. verticillioides 接种不同穗
腐病抗性玉米发现, 与感病材料相比, 3个 PAL基因
在抗性材料中被较高水平的诱导, 2个 PAL在抗性材
料中本底表达水平较高; 此外木质素合成相关基因
Caffeoyl-o-methyltransferase 1 (COMT1)在未接种的
抗性材料中表达量较高[24]。Ye等[35]研究表明, 接种
后 6 h, 抗病近等基因系玉米幼根表皮侵入的 F.
graminearum 菌丝少于感病近等基因系, 此结果表
第 8期 刘永杰等: 玉米抗禾谷镰刀菌的转录组分析 1131


表 5 接种后 18 h, NIL-R中高表达的抗病相关基因
Table 5 Disease resistance genes more abundant in NIL-R at 18 hai
基因编号
Gene ID
差异倍数
FC (NIL-R/NIL-S)
基因功能
Gene function
AC148152.3_FG005 2.38 乙烯合成酶 ACC oxidase(ACO)
GRMZM2G033935 2.25 乙烯合成酶 ACO1
GRMZM2G027439 2.10 BAK1激酶 BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1 (BAK1)
GRMZM2G015419 3.00 脂氧合酶 Lipoxygenase (LOX10)
GRMZM2G378949 7.24 钙依赖蛋白激酶 CDPK相关激酶 CDPK-related kinase 1(CRK1)
GRMZM2G084825 2.08 富含半胱氨酸的受体激酶 Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase) 10 (CRK10)
GRMZM2G021624 2.19 富含半胱氨酸的受体激酶 Cysteine-rich RLK (RECEPTOR-like protein kinase) 10 (CRK10)
GRMZM2G148702 2.03 富含亮氨酸受体激酶 Leucine-rich receptor-like protein kinase family protein
GRMZM2G141288 2.14 富含亮氨酸受体激酶 Leucine-rich receptor-like protein kinase family protein
GRMZM2G160619 2.97 富含亮氨酸受体激酶 Leucine-rich receptor-like protein kinase family protein
GRMZM2G469313 2.47 富含亮氨酸受体激酶 Leucine-rich receptor-like protein kinase family protein
AC217293.3_FG007 2.36 细胞壁相关激酶 Wall-associated kinase 2 (WAK2)
GRMZM5G832772 2.20 多药抗性相关蛋白 Multidrug resistance associated protein 2 (MDR2)
GRMZM2G000614 2.36 多向耐药性蛋白 Pleiotropic drug resistance 1 (PDR1)
GRMZM2G025971 3.84 羟基肉桂酰辅酶 A奎尼羟基肉桂转移酶
Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase (HCT)
GRMZM2G160400 21.08 羟基肉桂酰辅酶 A奎尼羟基肉桂转移酶
Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase (HCT)
GRMZM2G175576 2.17 重金属 ATP酶 Heavy metal atpase 2 (HMA2)
GRMZM2G313184 2.75 过氧化物酶 Peroxidase R15
GRMZM2G011422 3.50 含 R2R3MYB蛋白 R2R3MYB-domain protein Fragment
GRMZM2G431506 2.26 呼吸爆发氧化酶 Respiratory burst oxidase protein B
GRMZM2G147809 2.75 DREB2A互作蛋白 DREB2A-interacting protein 2 (DRIP2)
FC: fold change.

明与感病近等基因系相比, 抗性材料可抑制病原菌
入侵。苯丙烷代谢途径产物酚类在抗茎腐病玉米近
等基因系[35]和抗赤霉病小麦材料[36]中含量较高, 而
酚类物质可与细胞壁共价结合, 致使病原菌侵染位
置细胞壁坏死而抵抗病原菌入侵; 此外, 木质素积
累可使玉米根部外皮组织加厚, 进一步抑制病原菌
的入侵[35]。接种 F. culmorum后, 2个抗病小麦品种
中木质素积累量较感病小麦品种中高[22]。本研究的
NIL-R 中高表达的基因在苯丙烷合成途径中显著富
集; 此外还包括肉桂酸、香豆酸、植物抗毒素等次
生代谢产物合成途径。多个苯丙烷代谢途径的关键
基因, 如 PAL1、PAL2、CAD、HCT等在接种后 0 h
的 NIL-R中表达量较高。结果表明, 苯丙烷代谢途径
可通过组成型抗性提高玉米对禾谷镰刀菌的抗性。
禾谷镰刀菌可分泌 DON, 该毒素可作为有毒因
子参与到病原菌侵染寄主的过程中[10]。DON并非病
原菌生长必需 , 但有报道称毒素影响病原菌致病
性。与野生型相比, 毒性合成基因 tri-5 突变株在侵
染小麦时致病力减弱[12-13]。研究报道, 动物中 DON
可与 60S 核糖体亚基结合来抑制蛋白质的合成进而
激活细胞衰亡程序导致细胞死亡[8-10]。DON 可体外
抑制小麦核糖体中蛋白的合成[11]。所以有研究认为,
DON 可通过抑制寄主体内抗性蛋白的合成来延缓
或抑制寄主的抗性。此外, DON 不仅可引起细胞内
过氧化氢的积累引起细胞程序化死亡, 还可以激活
抗性响应基因病程相关蛋白的表达[15]。寄主细胞可
通过诱导毒素降解蛋白的合成降解毒素或毒素转运
蛋白的合成将毒素转运出胞质[15]。接种后 18 h, 编
码 ABC-transport family protein 、 Heavy metal
transport protein、MATE efflux family protein的基因
在 NIL-R中特异上调表达。PDR1、MRD2在接种后
18 h的 NIL-R中表达量较高。故 NIL-R可通过诱导
毒素降解或转运基因的表达而降低毒素对寄主细胞
的毒性, 抑制 F. graminearum的进一步入侵。
RLK 是一类位于质膜上的受体激酶, 它可被病
原菌的相关分子模式 PAMP或MAMP识别, 而激活
1132 作 物 学 报 第 42卷

下游的 PTI抗性反应。FLS2是一类位于质膜的 LRR
型受体激酶, 该激酶可识别细菌的鞭毛蛋白而提供
对细菌的抗性; BAK1是一类LRR型受体激酶, 它可
通过调节 BRI1参与到 FLS2调节的 PTI反应中[37]。
本研究中多种 RLK基因在接种后 18 h的NIL-R中特
异上调表达。BAK1基因在接种后 18 h的 NIL-R中
表达量较高。说明 PTI 免疫反应在玉米抵抗禾谷镰
刀菌侵染的过程中发挥重要作用。
4 结论
与NIL-S相比, NIL-R可能主要依赖本底高表达
抗性相关基因(如 JA/ET合成和信号途径相关基因、
苯丙烷代谢途径合成基因)来抵抗病原菌的入侵; 病
原菌入侵后, 编码病程相关蛋白(PR)、木质素合成、
DON 降解或转运等基因的高表达限制病原菌的进
一步扩展和繁殖 ; 此外 , 编码受体激酶的基因在
NIL-R 中的高表达说明了 PTI 免疫反应在玉米抵抗
禾谷镰刀菌侵染的过程中也发挥了重要作用。
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