全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1400−1408 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A104), 国家公益性行业(农业)科研专项经费项目(200903002-04)和国家现
代农业产业技术体系建设专项(CARS-13)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 孙万仓, E-mail: wangcangsun@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: xiucunzeng@126.com
Received(收稿日期): 2012-12-23; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-05-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130520.1159.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01400
白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性
分析
曾秀存 1,2 孙万仓 1,* 方 彦 1 刘自刚 1 董 云 3 孙 佳 4 武军艳 1
张鹏飞 1 史鹏辉 1 孔德晶 1 张腾国 5 何 丽 1 赵彩霞 1
1甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州 730070; 2河西学院农业与生物技术学院, 甘肃张掖 734000; 3甘肃省农业科学院作物研究所, 甘肃兰
州 730070; 4 Department of Plant Sciences, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, S7N5A8, Canada.; 5西北师范大学生命
科学学院, 甘肃兰州 730070
摘 要: 抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根
据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因 APX 的同源保守序列设计引物, 采用 RT-PCR 扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇
油 7号的 DNA, 获得 APX基因开放阅读框, 长度为 753 bp, 编码 250个氨基酸残基, 推导的氨基酸序列具有 APX蛋
白的典型特征。生物信息学分析显示, 与已报道的大白菜的 APX氨基酸序列同源性达 99%, 该酶蛋白具有高度的进
化保守性, 其保守序列属于植物的 POD超家族, APX相对分子质量和理论等电点依次为 27.7 kD和 5.58; APX基因无
信号肽, 是一个亲水性蛋白, 可推测其定位于细胞质中; 二级结构预测表明陇油 7 号的 APX 是由不规则卷曲和 α-螺
旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量 PCR 和酶活性分析显示, 该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导, 表明该基因在白
菜型冬油菜陇油 7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。
关键词: 白菜型油菜; 低温; APX基因克隆; 表达分析; APX活性
Cloning, Expression, and Activity Analysis of Ascorbate Peroxidase (APX)
Gene from Winter Turnip Rape (Brassica campestris L.)
ZENG Xiu-Cun1,2, SUN Wan-Cang1,*, FANG Yan1, LIU Zi-Gang1, DONG Yun3, SUN Jia4, WU Jun-Yan1,
ZHANG Peng-Fei1, SHI Peng-Hui1, KONG De-Jing1, ZHANG Teng-Guo5, HE Li1, and ZHAO Cai-Xia1
1 Agricultural College, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, Hexi University, Zhangye
734000, China; 3 Crop Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070 China; 4 Department of Plant Sciences, Univer-
sity of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, S7N5A8, Canada.; 5 College of Life Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China
Abstract: Ascorbate peroxidase (APX) is a key enzyme which eliminates oxygen free radicals and increases plant resistance in
adverse circumstances. The complete open reading frame of APX gene was cloned from an extremely low temperature (–32 ) ℃
resistant winter turnip rape (Brassica campestris L.) cultivar Longyou 7 using the method of reverse transcription PCR (RT-PCR).
The primers were designed according to the published APX cDNA sequences. The sequence of APX from B. campestris L. was
753 bp, encoding a protein of 250 amino acid residues with a predicted molecular weight of 27.7 kD and a theoretical pI of 5.58.
Bioinformatics analysis showed that the predicted APX protein contained a conserved amino acid sequence corresponding to the
plant peroxidase (POD) superfamily. The APX had no signal peptide and was a hydrophilic protein locating in cytoplasm. The
prediction of the second structures indicated the APX was a steady protein with more random coils and α-helices. The expression
analysis of APX gene using real time RT-PCR and the activity of APX in response to lower temperature showed that the APX
could be induced and the activity of APX could be changed by lower temperature. In conclusion, APX gene might play a role in
cold tolerance of the B. campestris L. cultivar Longyou 7.
Keywords: Winter rape (Brassica compestris L.); Lower temperature; APX gene cloning; Expression analysis; Activity of APX
第 8期 曾秀存等: 白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析 1401


干旱和低温等环境胁迫严重影响植物的正常生
长发育, 使细胞代谢不协调, 产生大量伤害自身的
活性氧, 引起膜脂过氧化、膜蛋白聚合等反应, 从而
破坏生物膜的结构和功能, 损伤植物细胞[1-2]。H2O2
是一种主要的活性氧, 及时清除 H2O2对于维持植物
细胞正常的生理功能非常重要。抗坏血酸过氧化物
酶(APX)就是植物进化出来的一种清除植物叶绿体
和胞质中 H2O2 的抗坏血酸-谷胱甘肽循环机制的关
键酶[3-4], 它利用抗坏血酸作为电子供体清除植物体
内产生的 H2O2 [5-6], 从而提高植物抵御氧化胁迫能
力, 增强植物的抗逆性。盐地碱蓬[7]、白桦[8]、黑麦
草[9]、番茄[10]等植物的研究已证实 APX基因在抗氧
化胁迫中的重要作用。目前, 已有许多植物的 APX
基因被克隆, 但用于 APX 基因克隆和功能研究的植
物大都是正常环境下生长的模式材料, 而对于能在
北方寒区安全越冬的白菜型冬油菜 APX 基因的克
隆、生物信息学分析及低温胁迫下基因的表达研究
报道较少。冬油菜种植北移可使其成为北方寒区一
种重要的生态作物和油料作物, 但北方寒区冬季酷
寒, 多风干旱, 极端低温导致植物体内过量 H2O2活
性氧积累, 使其不能安全越冬。因此, 利用现代生物
技术发掘北方寒区冬油菜的抗寒基因, 开展抗寒转
基因育种具有非常重要的意义。基于 APX能及时清
除 H2O2, 使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵抗低
温胁迫[11-12], 本研究克隆了超强抗寒冬油菜陇油 7
号的 APX 基因, 测定该基因在组织中表达, 比较陇
油 7 号和天油 4 号在不同低温胁迫下叶片和根部
APX 活性, 以期明确白菜型冬油菜在越冬过程中抵
御低温胁迫的机制和 APX 基因的抗寒功能, 为北方
寒区冬油菜分子抗寒育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
超强抗寒白菜型冬油菜品种陇油 7 号和抗寒性
较弱的白菜型冬油菜品种天油 4 号, 均由甘肃农业
大学农学院作物遗传育种系提供。选取饱满、大小
一致的油菜种子, 用 0.1% (V/V)氯化汞消毒 10 min,
蒸馏水冲洗 3 次后, 播于铺两层滤纸的培养皿, 置
恒温培养箱(24±1)℃催芽 , 待胚根露白后播至装有
育苗基质的营养钵(上口径 10 cm, 下口径 7 cm, 高
10 cm)内, 培养幼苗至六叶期, 备用。
1.2 总 RNA的提取及反转录
按照 TRIzol试剂的用户手册提取陇油 7号幼苗
的叶片总 RNA, 电泳检测后, 按照 M-MuLV第一链
cDNA 合成试剂盒(BS249)的说明得到单链 cDNA,
置–20℃冰箱保存, 备用。
1.3 引物设计与 APX基因克隆
根据GenBank数据库中已报道的大白菜 APX基
因(GenBank登录号为 GQ500125)的核苷酸序列设计
引物: Apx-F (5′-GGATCCATGACGAAGAACTAC-3′),
Apx-R (5′-CTTAAGAGCATCAGCAAACCC-3′)。以
陇油 7 号油菜幼嫩叶片的反转录 cDNA 为模板, 用
引物 Apx-F和 Apx-R进行扩增。扩增产物经生工生
物工程(上海)股份有限公司的普通琼脂糖凝胶 DNA
纯化回收试剂盒(生工 SK1141)回收, 并与 pUCm-T
载体连接, 反应体系与反应条件为 10 倍的连接液
1 μL, pUCm-T Vector 1 μL, T4连接酶 1 μL, 回收
DNA 2 μL, 将混合反应液置 16~23℃连接 1~2 h。将
连接后的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞, 过夜培
养, 蓝白斑筛选后挑取白斑, 经含有氨苄青霉素的
液体培养基振荡培养 12 h后, 以 PCR检测菌落, 将
阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行
测序。
1.4 APX预测蛋白的生物信息学分析
将获得的 APX 基因在 NCBI 网站上 Blast 比对,
用 ORF Finder寻找开放阅读框, 并对 F-box区域进
行分析; 利用 DNAStar 软件进行多重序列比较和氨
基酸同源性分析, 产生的多重比对结果通过 MEGA
4.0软件构建系统发生树; 利用 http://www.expasy.ch
/tools/protparam.html 网站分析来源于 NCBI 中已注
册的大白菜 APX (登录号为 ACV92696.1)、甘蓝型
油菜 APX (登录号为 CAA72247.1)、甘蓝 BO-APX1
(登录号为 BAB84008.1)、芥菜型油菜 APX (登录号
为 AAN60795.1) 、 拟 南 芥 APX1 ( 登 录 号 为
AEE28205.1)以及本研究克隆的 APX 蛋白质的各种
理化性质; 利用在线工具 TMHMM 和 SignalP 分析
蛋白跨膜结构域和预测信号肽; 利用 ExPASy 工具
中的 SOPMA软件预测蛋白质二级结构。
1.5 白菜型冬油菜 APX 基因在低温胁迫下的表
达量
选取生长健壮、六叶期的陇油 7 号和天油 4 号
植株, 于 4℃培养 8 d后保存于液氮, 继而转入超低
温培养箱在–4℃处理 3 d, 取叶片和根备用, 最后将
植株置–8℃培养 3 d, 取叶片和根, 冷冻保存, 备用。
以未低温处理的植株为对照(CK)。用低温处理以及
对照叶片和根部提取 RNA。根据扩增所获得的基因
1402 作 物 学 报 第 39卷

序列设计特异引物 AR (5-GGAGCAGTTCCCTACC
ATC-3)和 AF (5-CACCAGACAAAGCGACAAT-3),
选取 Actin 基因作为内参基因 (正向引物 Act-R:
5-TTCTTACCCTCAAGTATCCG-3; 反 向 引 物
Act-F: 5-TCACCAGAGTCGAGCACA-3) 。 参 考
Green-2-GoqpcR Mastermix-LowRox (2x) (上海生物
工程有限公司 )试剂盒说明书 , 采用两步法进行
Real-time PCR 扩增 , 扩增程序为预变性 95℃ 10
min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 40个循环, 每个 cDNA
样品重复 3 次。根据得到的 Ct值, 利用 Kenneth 和
Thomas报道的 2–ΔΔCt方法[13]分别计算出不同温度处
理下陇油 7号和天油 4号叶片和根部 APX基因的表
达量, 绘出折线图。
1.6 抗坏血酸过氧化物酶活性测定
于 2010 年 8 月 20 日播种陇油 7 号和天油 4 号
于甘肃省永登县秦王川甘肃农业大学试验基地, 待
幼苗长至五叶期, 分别于 10月 8日(气温 14~20℃)、
10月 17日(气温 8~17℃)、10月 31日(气温–2~12℃)、
11月 15日(气温–10 ~ –4℃)、2011年 1月 18日(气
温–20~ –8℃)取样。参照邹琦[14]的方法测定 APX活
性。3 mL 反应混合液中含 50 mmol L–1 K2HPO4-
KH2PO4缓冲液(pH 7.0)、0.1 mmol L–1 EDTA-2Na、
0.3 mmol L–1抗坏血酸(AsA)、0.06 mmol L–1 H2O2和
APX酶液 0.1 mL。加入 H2O2后立即在 20℃下测定
10~30 s内 OD290值变化, 计算单位时间 AsA减少量
即 APX活性。
2 结果与分析
2.1 APX基因克隆
以大白菜 APX 基因序列为参考, 紧邻其起始
密码和终止密码设计引物, 以陇油 7号 cDNA第一
链为模板, 进行 RT-PCR扩增, 得到约 750 bp片段
(图 1), 回收纯化片段, 连接到 T载体后转化和利用
菌液 PCR筛选阳性克隆(图 2)。从图 2可以看出, 随
机挑取的 6个克隆中的 4个在 750 bp左右出现目的
片段, 说明克隆的 APX基因已插入载体中。将阳性
克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序, 得
到 762 bp cDNA 序列(图 3)。测序结果经 NCBI
的 Blast 程序检索数据库分析显示, 该序列与大白
菜和甘蓝同源基因具有高达 99%以上的同源性, 认
为所获得的序列为白菜型冬油菜 APX 基因保守区
序列。

图 1 白菜型油菜 APX基因的 RT-PCR
Fig. 1 RT-PCR results of APX gene in winter turnip rape
M: DL2000 marker; 1: APX基因扩增结果。
M: DL2000 marker; 1: PCR product of APX gene.


图 2 菌液 PCR的电泳结果
Fig. 2 Electrophoresis results of PCR
M: DL2000 marker; 1~6: 菌液 PCR产物。
M: DL2000 marker; 1–6: PCR products.

2.2 白菜型油菜 APX 基因 cDNA 序列分析及结
构功能预测
白菜型冬油菜 APX基因的 cDNA序列含有一个
长度为 753 bp的完整开放 ORF, 编码含 250个氨基
酸的蛋白质(图 4)。
利用 Protparam 预测 APX 基因编码蛋白质的理
化性质, 结果表明(表 1)白菜型油菜品种陇油 7 号
APX基因蛋白相对分子质量约 27.7 kD, 含有 Leu、
Ala、Gly、Glu、Pro、Arg、Asp等含量丰富的氨基
酸, 其中以 Leu所占比例最高, 达到 10.8%。预测不
稳定指数为 38.82, 属于稳定蛋白。总平均疏水指数
为–0.405, 等电点为 5.58, 其氨基酸残基数、分子量
和理化性质与大白菜几乎一致, 而与甘蓝型油菜、
甘蓝和芥菜型油菜以及拟南芥略有差异。
利用在线工具 TMHMM和 SignalP 3.0对陇油 7
号 APX 基因的 N 端前 70 个氨基酸序列进行信号肽
预测, 结果表明陇油 7号 APX基因的 N端不存在任
何信号序列, 是非分泌性蛋白(图 5), 推测其定位于
第 8期 曾秀存等: 白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析 1403



图 3 APX基因的编码区核酸序列及推导氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of APX gene
方框为起始密码子 ATG; *为终止密码子 TAA。ATG is indicated in box; TAA is marked by asterisk.


图 4 白菜型冬油菜 APX的 ORF
Fig. 4 Open reading frame of APX gene in winter turnip rape

细胞质中。进一步采用 ProtScale 分析其疏水性, 结
果显示, 陇油 7号 APX基因的 N端氨基酸基本以亲
水氨基酸为主, 进一步证实其 N 端不存在信号肽序
列。与前述 SignalP 3.0软件预测的结果一致。疏水性
预测结果表明, 其亲水性/疏水性的最大值是位于氨基
酸残基序列第 103 位的 Val, 其分值为 2.256, 而位于
第 120 位的 Glu 分值最低, 为–2.856, 这与亲水性/
疏水性的图形一致(图 6)。根据氨基酸分值越低亲水
性越强, 分值越高疏水性越强的规律, 在整个肽链
中亲水性氨基酸残基的数量要多于疏水性氨基酸残
基, 因此, 推测白菜型冬油菜品种陇油 7 号的 APX
蛋白为亲水性蛋白。
用在线工具 SOPMA预测, 白菜型冬油菜品种陇
油 7号 APX蛋白的二级结构由 α-螺旋(alpha helix)、
无规则卷曲(random coil)、延伸链(extended strand)以
及 β-转角(beta turn)组成, 4种二级结构元件所占比例
分别为 40.40%、40.40%、11.20%和 8.00% (图 7)。
用 NCBI在线 CDS程序分析发现 APX基因编码
1404 作 物 学 报 第 39卷

表 1 十字花科植物 APX 基因编码蛋白质预测的理化性质
Table 1 Physico-chemical properities of APX cDNA and their amino acid sequences of several rape plants
十字花科植物
Some plants in
mustard family
氨基酸残基
Number of
amino acids
相对分子
质量
Molecular
weight (kD)
理论等电点 pI
Theoretical
isoelectric point
蛋白质不稳
定指数
Protein
instability
平均疏水指数
(GRAVY)
Grand average of
hydropathicity
氨基酸组
成种类
Types of
amino acid
含量最丰富的
氨基酸
The most abundant
amino acids (%)
白菜型冬油菜
Winter turnip rape
250 27.65 5.58 38.82 –0.405 20 Leu 10.8, Ala 10.0, Gly 8.4
大白菜
Chinese cabbage
250 27.68 5.58 39.80 –0.408 20 Leu10.8, Ala 10.0, Gly 8.4
甘蓝型油菜
Brassica napus
250 27.64 5.70 41.92 –0.315 20 Leu 10.8, Ala 10.8, Gly 8.0
甘蓝
Cabbage
250 27.68 5.58 37.51 –0.398 20 Leu 10.4, Ala 10.0, Gly 8.4
芥菜型油菜
Brassica juncea
250 27.56 5.63 27.18 –0.230 20 Leu 11.2, Ala 10.4, Gly 8.0
拟南芥
Arabidopsis thalian
250 27.56 5.72 33.87 –0.385 20 Leu 9.2, Ala 10.4,Gly 8.4, Asp 8.4


图 5 以 Signal P 3.0程序预测白菜型冬油菜 APX信号肽
Fig. 5 Predicted signal peptide by Signal P 3.0

蛋白含有保守序列, 属于植物的 POD 超家族, 同时
在 CCD数据库中比对发现该蛋白含 3个结合位点即


图 6 ProtScale程序预测白菜型冬油菜 APX的疏水性
Fig. 6 Hydrophobicity of APX predicted by ProtScale
亚铁血红素结合位点、底物结合位点和 K+阳离子结
合位点以及 1 个由第 4~247 位共 244 个氨基酸组成
的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)保守结
构域(图 8)。
相似性比较发现 APX 蛋白与大白菜、甘蓝、
萝卜、芥菜和拟南芥的同源蛋白具有很高的一致性,
达到 91%~99% (图 9), 这暗示该蛋白为白菜型冬油
菜中的APX同源蛋白。进一步分析甘蓝型油菜APX
蛋白与其他植物 APX 蛋白亲缘关系, 将同源蛋白
进行系统发生分析。如图 10所示陇油 7号 APX基
因的蛋白与大白菜(B. rapa subsp. pekinensis)、甘蓝
(B. oleracea var. italica)、萝卜(Raphanus sativus)和
芥菜(B. juncea)属于同一亚族 , 亲缘关系更近 , 而
与胡黄连 (Picrorhiza kurrooa)、地黄 (Rehmannia
glutinosa)和高粱(Sorghum bicolor)的亲缘关系相对
较远。
第 8期 曾秀存等: 白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析 1405




图 7 预测白菜型冬油菜 APX蛋白质的二级结构
Fig. 7 Predicted second structure of APX in winter turnip rape
蓝色: α螺旋; 紫色: 无规则卷曲; 红色: 延伸链; 绿色: β转角。
Blue: alpha helix; Purple: random coil; Red: extended strand; Green: beta turn.



图 8 白菜型冬油菜 APX结构域预测分析
Fig. 8 Predication of domains of APX protein in winter turnip rape




图 9 白菜型冬油菜 APX蛋白与其他植物 APX蛋白氨基酸的多重比较
Fig. 9 Sequence multi-alignment of the deduced APX protein of winter rape with other species
1406 作 物 学 报 第 39卷


图 10 陇油 7号 APX蛋白与其他相关蛋白序列的系统进化树分析
Fig. 10 Phylogenetic analysis of Longyou 7 APX proteins with other related proteins

2.3 白菜型冬油菜 APX基因表达的定量分析
实时荧光定量 PCR分析表明(图 11和图 12), 低
温胁迫下两品种的 APX基因表达量均较正常温度下
增加, 随着处理温度的降低, 均呈“上升-下降-上升”
的趋势, 陇油 7号 APX基因表达量在 4℃、–4℃和–8
℃较对照分别增加 26.9、17.2 和 37.9 倍, 而天油 4
号相应只增加 11.5、5.7 和 16.3 倍; 根部 APX 基因
表达呈先上升后下降的趋势, 陇油 7 号和天油 4 号
在–4℃表达量达最大, 分别为对照的 38.7 倍和 20.4
倍, 在–8℃时, 表达量下降, 分别为对照的 16.5 倍
和 9.7倍; 在同一低温下, 陇油 7号叶片和根部 APX
表达量均明显高于天油 4号, 这与其大田表现一致。


图 11 低温胁迫下白菜型冬油菜叶和根中 APX基因的实时荧光
定量 PCR分析
Fig. 11 RT-PCR analysis of APX gene in leaves and roots of
winter turnip rape under low temperature


图 12 低温胁迫下白菜型冬油菜叶片及根部 APX基因的相对表达量
Fig. 12 Relative expression of APX gene in leaves and roots of
winter turnip rape under low temperature
2.4 冬油菜两品种 APX活性的比较
由图 13 所示, 随着取样时间的延迟(即温度的
降低) , 陇油 7 号和天油 4 号根部的 APX 活性呈先
上升后下降的趋势, 10 月 31 日根部的酶活性最高,
分别为 10月 8日样品的 2.33倍和 1.41倍。说明 10
月 31 日的低温(气温–2~12℃)是冬油菜耐受力的一
个转折点, 而后随着气温的下降, APX 活性开始降
低, 在 2011年 1月 18日(气温–20~ –8℃)陇油 7号的
APX 活性接近 10 月 8 日(气温 14~20℃)水平, 而天
油 4 号较 10 月 8 日下降 44.78%。两品种叶片 APX
活性呈“上升-下降-上升”的趋势, 10 月 17 日(气温
8~17℃)陇油 7号和天油 4号APX活性是 10月 8日(气
温 14~20℃)的 2.56 倍和 1.33 倍, 而后由于气温的下
降, APX 活性呈下降趋势, 在 10 月 31 日(气温–2~
12℃)时, 酶活性降到最低, 但 11 月 15 日(气温–20~
–8℃)时, APX活性又开始上升, 这一变化趋势与低温
胁迫下叶片中 APX 基因表达量的变化一致。同时陇
油 7 号的 APX 活性明显高于天油 4 号, 说明在低温
胁迫下, 陇油 7号清除 H2O2的能力强于天油 4号。


图 13 APX活性变化
Fig. 13 Effects of low temperature stress on APX activity of
winter rape
第 8期 曾秀存等: 白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析 1407


3 讨论
生物或非生物胁迫会使植物产生过多的活性氧
物质, 造成细胞膜和细胞器不同程度的损伤[15-16]。
细胞器中多种同工酶或非酶的抗氧化防御系统保证
了细胞中的活性氧维持在正常水平, APX 是这个系
统中与 H2O2亲和力最强的过氧化物酶, 其在响应逆
境胁迫中具有重要的作用[17]。本研究克隆了超强抗
寒白菜型冬油菜 APX基因的 cDNA序列, 氨基酸序
列分析表明它拥有完整的编码框, 所编码蛋白与十
字花科的大白菜和甘蓝具有极高的同源性, 保守区
含有 APX 蛋白保守序列, 属于植物的 POD 超家
族, 显示所克隆基因序列的准确性和该基因进化的
保守性。
在逆境条件下, 植物的抗性与植物体内 APX 基
因的表达以及酶活性水平具有密切关系。本研究发
现, 低温胁迫下 APX 的表达量均高于对照, 且陇油
7 号的表达量比天油 4 号更加明显, 说明 APX 基因
在冬油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。前人已
在番茄[8]、拟南芥[18]、橡胶树[19]等研究表明 APX的
过量表达可增强植物的抗寒性。陇油 7 号的酶活性
高于天油 4号, 这与低温胁迫下, APX活性越高植株
的抗寒性越强[20-21]以及陇油 7 号比天油 4 号更抗寒
一致, 也为进一步研究白菜型冬油菜品种陇油 7 号
的抗寒机制提供了方向。低温胁迫下 APX活性的提
高远不如转录水平的提高明显, 说明 APX可能存在
转录水平上的调节、蛋白质翻译水平上的调节、酶
原的激活, 也可能是 mRNA以不转录的 mRNP形式
暂时储存起来[22]。
对植物来说, 不同部位、不同组织的 APX活性
存在差异[1]。在自然降温条件下, 冬油菜根部 APX
活性高于叶片, 说明 APX 对清除根部 H2O2发挥重
要作用。根是北方寒区冬油菜越冬的唯一器官, 根
部的 APX 活性随气温的下降呈先上升后下降趋势,
这与根部 APX基因表达量变化趋势一致, APX活性
的升高是冬油菜经受低温胁迫过程中正常的防御性
反应, 说明冬油菜根部抵御膜脂过氧化的能力提高,
有利于根部经受更低温度或更长时间的低温胁迫 ,
维持较高的抗寒力, 而后酶活性下降可能是由于经
过前期的低温锻炼, 逐渐适应低温, 转入正常生长
状态, 这符合冷驯化提高植物耐低温能力的分子机
制[23-26]; 叶片中 APX活性随温度降低呈现“上升−下
降−上升”的趋势, 最初 APX活性的升高可维持较高
的抗寒力, 抵御最初的低温导致的膜脂过氧化, 而
后逐渐适应了低温, 转入正常生长状态, APX 活性
下降, 但由于温度的大幅下降, 叶片内产生大量的
H2O2, 又促使 APX活性上升, 这与 APX基因表达量
的变化趋势一致。
4 结论
从超强抗寒白菜型冬油菜品种陇油 7 号获得了
由 753个核苷酸组成的 APX基因 ORF, 该基因编码
250个氨基酸, 在进化上非常保守; APX基因编码亲
水性蛋白, 由不规则卷曲和 α 螺旋组成, 属于植物
的 POD 超家族, 无信号肽。与正常生长条件相比,
在低温胁迫下 APX 基因的表达量和酶活性均提高,
超强抗寒性品种陇油 7号 APX基因表达量及酶活性
高于抗寒性弱的耐寒品种天油 4 号, 说明北方白菜
型冬油菜 APX 基因表达和 APX 活性提高受低温胁
迫诱导, 且有利于增强白菜型冬油菜抗寒性。
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