全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 816−826 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071366, 31271655, 30871488)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 程方民, E-mail: chengfm@zju.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: liukuai2006@163.com
Received(收稿日期): 2012-11-22; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1020.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00816
水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实
特性分析
刘光快 曹珍珍 韦克苏 潘 刚 苏 达 张春娇 程方民*
浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058
摘 要: 采用 RT-PCR 法亚克隆了 PDI 基因保守区内 450 bp 的靶标序列作为干扰区段, 构建了含有内含子 hpRNA
(ihpRNA)的双元表达载体 pTCK303-RiOsPDI, 经农杆菌介导转化日本晴, 获得转基因植株; 通过在 T0代对其潮霉素
(Hyg)抗性基因的 PCR 鉴定, 确定携带有干扰片段的 T-DNA 区已整合到水稻基因组中, 且在转基因 T1代符合 3∶1
的分离模式。半定量 PCR和荧光定量 PCR的检测结果表明, PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的 PDI表达量
均显著降低, 尤其是其籽粒中表达量较微, 几乎能引起靶基因 80%左右沉默。对转基因 T2代植株的高温结实特性和
籽粒理化品质的检测结果, PDI基因沉默会引起高温胁迫处理下结实率的大幅度降低, 耐热性显著下降, 但其在常温
处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外, PDI基因沉默后, 稻米的透明度下降、垩白度增加, 但对籽粒粗蛋白
总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。
关键词: 水稻; 蛋白二硫键异构酶; 基因沉默; RNAi载体构建; 高温胁迫; 结实特性
RNAi Vector Construction for Protein Disulfide Isomerase Gene and Seed Set-
ting Characteristics in Offspring of Transgenic Rice under High Temperature
Treatment
LIU Guang-Kuai, CAO Zhen-Zhen, WEI Ke-Su, PAN Gang, SU Da, ZHANG Chun-Jiao, and CHENG
Fang-Min*
College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
Abstract: To clarify the effect of PDI gene silence on rice yield traits and grain quality, we sub-cloned a 450 bp RNAi fragment
from Nipponbare by RT-PCR, and successfully constructed a binary-vector pTCK303-RiOsPDI containing intron hpRNA (ih-
pRNA), then transformed it into the callus of wild type Nipponbare mediated by EHA105. The T-DNA region for PDI RNA inter-
ference in regenerating rice plants was integrated with rice genome via single copy in T0 generation transgenic plants, and showed
a 3:1 genetic mode in T1 transgenic population, which could be conformed by PCR amplifying analysis and Southern blotting
identification. The PCR and qRT-PCR for PDI gene expression in different organs showed that there were much lower level of
PDI expression in grains, leaves, stem and sheath for transgenic plants compared with those for wild type Nipponbare, with al-
most 80% of the dropping in transgenic seeds. The influence of high temperature stress on seed setting traits, panicle agronomic
traits and grain quality and also its relation to PDI gene expression in developing grains was further examined with T1 generation
of transgenic plants imposed to two temperature treatments under the controlled temperature chambers, the results indicated that
PDI silence transgenic plants had a remarkable lower seed setting rate, somewhat lower grain weight compared with its wild phe-
notype under the high temperature treatment in despite of no obviously varying with its wild phenotype under normal develop-
mental condition, suggesting that PDI gene should be probably responsible for rice tolerance to high temperature stress. More-
over, there were lower translucence and higher chalky degree for transgenic plants than for Nipponbare, although no significant
difference were observed in grain total protein and amylose content between PDI silence transgenic plant and its CK.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Protein disulfide isomerase (PDI); Gene silence; RNA interference; High temperature stress;
Seed setting characteristics
第 5期 刘光快等: 水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析 817


蛋白质二硫键异构酶 (Protein disulfide isom-
erase, PDI)是广泛存在于真核类生物中的多功能酶
蛋白[1-2], 它参与催化二硫键间的氧化还原反应、重
排错配二硫键[1-3], 在新生肽的合成、加工和运输、
成熟多肽的正确折叠, 以及逆境胁迫下受损蛋白的
修复和重折叠等生理过程中起重要作用[1,3-5]。此外,
PDI 还具有分子伴侣的部分功能, 可通过 ATP 依赖
等方式介导其他不同底物蛋白的多肽组装与异构、
二硫键状态调控等过程, 帮助其他代谢途径(如糖转
运、蛋白合成等)中的多种酶蛋白行使其特定的代谢
功能, 因此它与真核类生物中的糖转运及蛋白合成
等代谢环节也可能存在较密切联系[6-10]。
自 20 世纪 60 年代从人肝组织中分离、纯化得
到 PDI 蛋白以来, PDI 在真核类生物(包括动植物、
微生物和人类)中的细胞分布、蛋白结构及其生理功
能已逐渐引起了不少学者的关注[11-15]。现已基本明
确, PDI主要滞留于真核细胞的内质网中, 在内质网
管腔内的含量相当丰富[4,11]; PDI含量及酶活性与内
质网结构有很强相关性, 粗糙内质网越多, 结构越
复杂, 分布越密集, PDI 的含量及活性也就越高[10,12];
近年来, 随着分子生物技术的发展, 人们已在一些
脊椎动物、酵母, 以及拟南芥、水稻等植物中相继
克隆到多个 PDI基因或类 PDI (PDI-like)基因, 并对
相关基因在转录水平上的表达及其器官或组织特异
性进行了研究[5,13,15]。但迄今为止, 国内外对 PDI的
生理功能与基因表达等问题研究, 绝大多数仍主要
集中于酵母等微生物的发育生理学和人类及脊椎动
物的病理学方面, 而在植物上对该酶基因及其功能
研究的文献报道相对较少[9,14], 对于 PDI 在植物逆
境胁迫响应过程中的生理意义及其与植物抗逆(或
耐逆)特性间的相互联系, 以及 PDI对重要农作物有
关品质理化组分的影响作用, 目前尚不清楚。
高温、干旱、盐害等非生物胁迫是限制作物产
量和品质的主要逆境因子。水稻在开花结实期遭遇
高温危害, 会导致水稻结实率下降、稻米垩白度增高、
食味品质变劣, 这一问题已成为目前中国南方水稻生
产实现持续、稳步发展的一个重要制约因素[16]。本课
题组对不同温度处理下水稻胚乳贮藏物代谢相关基
因的表达谱差异及其动态变化特征的检测结果表明,
在水稻胚乳贮藏物代谢相关的诸多功能基因中, PDI
基因是一个对高温胁迫表现较敏感的基因, 且在高
温胁迫下多呈上调表达, 并推测 PDI 基因可能与水
稻在不同温度处理下的胚乳贮藏蛋白合成过程及组
分变化有关[17], 但该阶段性工作尚没有能提供 PDI
基因对水稻耐热特性及贮藏蛋白合成产生影响的较
直接实验证据。为此, 本文利用 RNAi干扰介导的基
因沉默技术, 选取 PDI 基因序列的保守区域作为靶
标, 构建了以 Ubiquitin 启动子驱动的正向 pdi A-内
含子-反向 pdi B的 ihpRNAi 植物双元表达载体, 并
对转基因阳性后代的高温结实特性和常规理化品质
进行了检测分析, 旨在进一步揭示 PDI 基因调控的
有关生理变化与水稻耐热结实特性及其与稻米品质
性状的联系, 为水稻耐热育种和抗热栽培等工作提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
转化受体材料为粳稻品种日本晴。大肠杆菌(E.
coli)感受态细胞 Trans5α Chemically Competent Cell
及克隆载体 pEASY-T1 购自北京全式金生物技术有
限公司。Kanamycin、Rifampicin、IPTG、X-gal 均
购自北京鼎国生物技术有限公司, 总RNA提取试剂
盒、cDNA第一链合成试剂盒、Taq DNA聚合酶、
限制性内切酶 Sac I、Spe I、Kpn I、BamH I, T4-DNA
连接酶, DNA分子量标准 DL2000、DL15000等购自
TaKaRa公司, 琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提
取试剂盒均是 Axygen 公司产品 , 根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 和表达载体
pTCK303由本实验室保存。
1.2 RNAi目标区段选择、引物设计及其亚克隆
根据 GenBank公布的水稻 PDI基因及其登录号
NM_001073968, 在 NCBI数据库中搜索 PDI基因的
编码序列 , 选取其保守区域作为 RNAi 干扰区段 ,
用 Primer Premier 5.0 设计特异引物, 并结合 RNAi
表达载体(pTCK303)的多克隆酶切位点 , 加上相应
的双酶切位点及保护碱基, 同时设计潮霉素(Hyg)抗
性基因的引物(表 1), 由上海生工生物工程有限公司
合成。
提取日本晴灌浆 15 d左右胚乳中的总 RNA, 以
变性甲醛琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 2000微量分
光光度计检测 RNA 质量后, 参照 TaKaRa 公司的
cDNA 第一链合成试剂盒的说明书 , 利用 20 μL
TaKaRa 公司的反应体系反转录合成 cDNA 第一链,
并在反转录前用 DNaseI 对总 RNA 进行消化处理,
以消除 DNA的污染。
以第一链 cDNA为模板进行 PCR扩增, PCR体
818 作 物 学 报 第 39卷

表 1 目标基因的 PCR扩增引物
Table 1 Specific PCR primers for target genes
基因
Gene
引物序列
Premier sequence (5–3)
产物大小
Size (bp)
F: tggtacc (Kpn I) actagt (Spe I) TGCACAAGAGCTAAGCAAGC
PDI
R: tggatcc (BamH I) gagctc (Sac I) AGCTCATCAAAGGGCTTGAA
450
F: GGCGAGTACTTCTACACAGC
Hyg
R: CATGTGTATCACTGGCAAAC
504

系为 50 μL, 由 cDNA模板 1 μL、10 μmol L−1上下
游引物各 2 μL、5 U μL−1 Taq DNA聚合酶 0.8 μL、
2.5 mmol L−1 dNTP 4 μL、10×Taq buffer 5 μL 和
ddH2O 35.2 μL组成。扩增条件为 95℃预变性 4 min;
94℃变性 30 s, 57℃退火 30 s, 72℃延伸 40 s, 扩增循
环为 34次; 72℃后延伸 10 min。利用 1%琼脂糖凝
胶电泳检测 PCR产物, 将扩增得到的目标片段用琼
脂糖凝胶回收试剂盒纯化, 并与 pEASY-T1 载体连
接, 转化 Trans5α感受态细胞, 对所获得的白斑通过
质粒 PCR扩增、Sac I和 Spe I双酶切验证后, −80℃
冰箱保存 , 送至上海生工生物工程有限公司测序 ,
确定其为重组克隆载体 pEASYT1-RiOsPDI。
1.3 中间过渡载体及 RNAi终载体的构建
将上述重组克隆载体(pEASYT1-RiOsPDI)质粒
用 Sac I和 Spe I双酶切, 同时 Sac I和 Spe I双酶切
空载体 pTCK303 质粒, 分别回收 pEASYT1-RiO-
sPDI质粒酶切产物的 RNAi目标区域的 450 bp片段
和 pTCK303质粒酶切产物约 14 kb片段, 将所回收
的 RNAi 目标片段与 pTCK303 质粒载体片段用
T4-DNA 连接酶过夜连接后转化 Trans5α 感受态细
胞, 鉴定筛选出重组质粒, 得到含 RNAi 目标区段
的中间载体, 并将此含 RNAi 正向目标区段的中间
载体命名为 pTCK303-RiOsPDI1。
利用 BamH I和 Kpn I同时双酶切重组克隆载体
(pEASYT1-RiOsPDI)质粒和中间载体 (pTCK303-
RiOsPDI1)质粒, 分别回收 pEASYT1-RiOsPDI 质粒
酶切产物的RNAi目标区段 450 bp片段和 pTCK303-
RiOsPDI1 质粒酶切产物约 14 kb 片段, 经 T4-DNA
连接酶连接后转化 Trans5α感受态细胞, 利用 BamH
I和Kpn I双酶切及 Sac I单酶切终载体, 鉴定筛选出
重组质粒, 得到含正反 RNAi 目标区段的表达载体
pTCK303-RiOsPDI (图 1)。

图 1 PDI沉默表达载体 pTCK303-RiOsPDI框架示意图
Fig. 1 Structure map of pTCK303-RiOsPDI expressing framework

1.4 表达载体的农杆菌转化、转基因植株的获得
及分子鉴定
利用冻融法将重组质粒转化到农杆菌 EHA105
感受态细胞中, 对经 PCR鉴定、筛选后的阳性菌落
进行愈伤组织转化。采用 25℃暗培养 3~4星期的日
本晴成熟胚的愈伤组织, 用农杆菌菌液侵染干燥的
愈伤组织 40 min后, 将愈伤组织相继转移至 CC共
培养基、含头孢霉素(Cef 500 mg L−1)的 N6培养基
以及含潮霉素和头孢霉素(Hyg 50 mg L−1, Cef 500
mg L−1)的筛选培养基分别进行培养、抑菌和抗性筛
选。对于筛选出来的抗性愈伤组织, 用 N6再生培养
基暗培养 1 周后移至光下培养 4~6 周。将长出的小
苗于 1/2 MS培养基中光照条件下生根, 适龄后将小
苗转移至大田生长。
取 T0代转化苗的叶片, 采用 CTAB[18]法提取其
基因组DNA, 以空载 pTCK303质粒为阳性对照, 同
时以非转化的野生日本晴基因组 DNA 为阴性对照,
进行转化苗的潮霉素(Hyg)抗性基因的扩增鉴定。
PCR体系为 10 μL, 由 DNA模板 0.5 μL、10 μmol L−1
上下游引物各 0.5 μL、5 U μL−1 Taq DNA polymerase
0.3 μL、2.5 mmol L−1 dNTP 0.5 μL、10×Taq buffer 1
μL和 ddH2O 6.7 μL组成; 反应条件为 95℃预变性 4
min; 94℃变性 30 s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 50 s,
扩增循环为 30次; 72℃后延伸 10 min。
在 T0代转基因水稻植株的成熟期, 分单株收获
其成熟种子, 当年在海南三亚加代种植成 T1 代株系,
第 5期 刘光快等: 水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析 819


并取 T1 代幼苗期的叶片, 利用对潮霉素(Hyg)抗性
基因的 PCR 扩增反应进行其 T1代的遗传分离鉴定,
PCR体系及鉴定方法同 T0代转化苗。
1.5 转基因 T2 代植株的高温结实特性分析与
PDI基因表达的荧光定量 PCR检测
将从海南加代获得的 T1代转基因种子, 于 2012
年 4 月种植在浙江大学紫金港校区试验农场, 通过
田间湿润育秧获得 T2代的转基因秧苗, 以相同播期
的野生型日本晴为对照, 同时将其 30 d左右的秧苗
移栽于大田, 田间常规管理, 及时防治病虫杂草。待
水稻在田间生长至分蘖后期, 选取发育进程与长势
基本一致的稻株 20 株(对供试 T2代的 20 个单株进
行潮霉素抗性基因鉴定, 以确保其为阳性稻株), 带
泥转入不同的盆钵(每盆 2株)土培, 在齐穗时, 选同
日开花且发育良好的单穗挂牌标记, 并在标记稻穗
抽穗开花时, 将稻株分别移入日均温度为 32℃ (高
温处理, HT)和 22℃ (适温处理, NT) 2台 CONVIRON
气候箱进行人工控温处理, 成熟时收获挂牌标记的
稻穗。高温处理的最高温度和最低温度分别为 36℃
和 28℃, 适温处理的最高温度和最低温度分别为
26℃和 18℃, 日最大温差均为 8℃。温度日变化模
拟自然气候特征, 24 h连续运转, 按文献[17]设定程
序自动控制。除温度因素外, 两台气候箱的光照时间、
光照强度、相对湿度等环境参数设计完全相同。
对两台人工气候箱控温处理的部分稻穗(挂牌
标记), 分别在开花后的第 10 天、第 15 天、第 20
天和第 25天取样, 每次取 2~3个稻穗, −80℃保存。
以每次取样的稻穗中部强势粒为样品, 利用荧光定
量 PCR对 PDI基因在不同温度处理下的表达差异及
其变化动态进行检测。其中, PDI基因荧光定量 PCR
特异扩增所用的上游引物是 5-AGCTGCACAAGAG
CTAAGCA-3, 下游引物是 5-ATCTTGAGTGTCGG
GAAACC-3, 扩增片段大小为 123 bp。以 A-actin基
因为内标, 采用参照基因的 ΔCT 法, 计算目标基因
PDI的相对表达倍数。上述荧光定量 PCR检测所用
的生化试剂、反应体系及内标基因的引物序列与文
献[19]相同。
1.6 理化指标测定
将收获后的成熟稻谷风干、脱壳、碾精、磨粉
后测定稻米直链淀粉和粗蛋白质含量。按农业部颁
布标准NY147-88, 采用简易碘蓝比色法测定稻米直
链淀粉。采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量[20], 氮含
量乘 5.95系数换算成粗蛋白含量。每样品重复 3次。
2 结果与分析
2.1 PDI基因的亚克隆
利用 RT-PCR 将从日本晴发育胚乳中提取的总
RNA反转录成 cDNA第一链后, 进行 PDI基因的亚
克隆。用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测后,
将扩增得到的目标片段回收纯化并与 pEASY-T1 进
行 T-A克隆, 转化到大肠杆菌 Trans5α中, 再对菌液
进行 PCR验证(图 2-A); 利用 Sac I、Spe I双酶切质
粒, 可检测到 450 bp的目标片段(图 2-B)。经 NCBI
BLAST序列比对, 与 NCBI上报道的水稻 PDI基因
序列完全匹配 , 干扰片段在 PDI 基因 (NM_
001073968) mRNA序列的第 290~739碱基之间, 这
表明预期的 RNAi 干涉目标片段正确获得, 且重组
克隆载体 pEASYT1-RiOsPDI已构建成功。

图 2 重组载体 pEASYT1-RiOsPDI的 PCR及双酶切验证
Fig. 2 Identification of recombinant vector
pEASYT1-RiOsPDI by PCR and double digestion
A: 重组克隆载体 pEASYT1-RiOsPDI的菌液 PCR验证电泳图,
泳道 1和 2分别为各重组大肠杆菌的单克隆菌株, M为 DL2000
marker; B: 重组克隆载体 pEASYT1-RiOsPDI的质粒 Sac I和 Spe
I双酶切电泳图, 泳道 1和 2为经双酶切的质粒。
A: Identification of bacteria liquid PCR of recombinant cloning
vector pEASYT1-RiOsPDI in E. coli, lanes 1 and 2 indicate re-
combinant vectors in E. coli, and M is DL2000 marker; B: Elec-
trophoregram of double digestion of recombinant vector
pEASYT1-RiOsPDI plasmid by Sac I and Spe I, and lanes 1–2 are
double digested plasmid.

2.2 RNAi表达载体 pTCK303-RiOsPDI的构建
用 Sac I和 Spe I分别双酶切 pEASYT1-RiOsPDI
质粒和 pTCK303 质粒后 , 分别回收 pEASYT1-
RiOsPDI质粒酶切 PCR产物中的 450 bp片段, 以及
pTCK303质粒酶切 PCR产物约 14 kb片段, 将两者
用 T4-DNA连接酶连接后转化 Trans5α, 经对重组质
粒的 PCR及 Sac I和 Spe I双酶切的鉴定表明, 目标
片段已正向连接到 pTCK303载体中(图 3-A和 3-B),
得到中间载体 pTCK303-RiOsPDI1。
用 BamH I 和 Kpn I 分别双酶切 pEASYT1-
RiOsPDI质粒和中间载体 pTCK303-RiOsPDI1质粒,
820 作 物 学 报 第 39卷


图 3 pTCK303-RiOsPDI载体的构建及其农杆菌 EHA105
的转化
Fig. 3 Construction of pTCK303-RiOsPDI and transforma-
tion to EHA105
A: 重组中间载体 pTCK303-RiOsPDI1的菌液 PCR验证电泳图
谱。泳道 1为重组克隆载体 pEASYT1-RiOsPDI质粒(阳性对照),
泳道 2为阴性对照(未加模板), 泳道 3~5为重组大肠杆菌单克隆
菌株, M为 DL2000 marker; B: 重组中间载体
pTCK303-RiOsPDI1的质粒 Sac I、Spe I双酶切电泳图, 泳道 1
和 2为经双酶切的质粒; C: 终载体 pTCK303-RiOsPDI的质粒
BamH I、Kpn I双酶切及 Sac I单酶切电泳图, 泳道 1为质粒双
酶切图谱, 泳道 2和 3为质粒 Sac I单酶切图谱; D: 终载体
pTCK303-RiOsPDI转化农杆菌 EHA105后的菌液 PCR鉴定电泳
图, 泳道 1为终载体 pTCK303-RiOsPDI大肠杆菌质粒(阳性对照),
泳道 2为阴性对照(未加模板), 泳道 3~6为含终载体
pTCK303-RiOsPDI农杆菌 EHA105单克隆菌液。
A: Identification of bacteria liquid PCR of recombinant intermedi-
ate vector pTCK303-RiOsPDI1 in E. coli, lane 1 indicate plasmid
of recombinant cloning vector pEASYT1-RiOsPDI (positive con-
trol), lane 2 is negative control(no template), lanes 3–5 are recom-
binant intermediate vectors in E. coli, and M is marker; B: Elec-
trophoregram of double digestion of recombinant intermediate
vector pTCK303-RiOsPDI1 plasmid by Sac I and Spe I, lanes 1 and
2 are double digested plasmid; C: Electrophoregram of double
digestion of recombinant final vector pTCK303-RiOsPDI plasmid
by BamH I and Kpn I, and single digestion by Sac I, lane 1 is dou-
ble digested plasmid, and lanes 2–3 are single digestion; D: Elec-
trophoregram of bacteria liquid PCR of recombinant final vector
after transformation to EHA105, Lane 1 is plasmid of recombinant
final vector pTCK303-RiOsPDI (positive control), lane 2 is nega-
tive control(no template), and lanes 3–6 are recombinant final
vectors in Agrobacterium tumefaciens.

回收 pEASYT1-RiOsPDI质粒酶切后的 450 bp片段
和 pTCK303-RiOsPDI1质粒酶切后的约 14 kb片段。
用 T4-DNA 连接酶连接转化 Trans5α 后 , 通过
BamH I和 Kpn I双酶切得到目标片段及 Sac I单酶
切得到约 1.4 kb 片段(正反向加上内含子片段), 鉴
定筛选出重组质粒(图 3-C)。为了确认载体 pTCK303
分别与正向和反向两段 RNAi 片段正确连接, 采用
从内含子向两端的方式对其重组质粒进行测序, 证
实所构建的 RNAi 载体已分别连入了正向及反向两
段 RNAi片段, 从而获得含有正反 RNAi目标区段的
终表达载体 pTCK303-RiOsPDI。
将所构建的终表达载体 pTCK303-RiOsPDI 导
入农杆菌 EHA105中, 对农杆菌菌液的 PCR鉴定结
果显示, 在阳性对照与单克隆菌液中均可扩增一条
明亮的 450 bp 片段条带(图 3-D)。说明 RNAi 载体
pTCK303-RiOsPDI 已成功导入农杆菌 EHA105, 可
进行下一步的愈伤转化。
2.3 农杆菌 EHA105介导的遗传转化、T0代转基
因植株获得及其 T1代的分离鉴定
以成熟胚的愈伤组织为材料 , 与含终载体
pTCK303-RiOsPDI的农杆菌EHA105菌液共培养后,
利用含潮霉素和头孢霉素的培养基进行抗性筛选 ,
并使筛选出的抗性愈伤组织再生, 将再生出的小苗
转移至 1/2 MS培养基中于光照条件下生根, 获得再
生抗性苗, 然后将获得的 8 株再生抗性苗(T0代植株)
转移到大田条件下生长至成熟时收获。期间从 T0代
转化植株叶片中提取植物基因组总 DNA, 以潮霉素
(Hyg)抗性基因为特异扩增对象, 进行 PCR 扩增分
析, 以 pTCK303-RiOsPDI 质粒为阳性对照, 未经转
化的野生日本晴为阴性对照(图 4), 结果显示, 有 5
株能扩增出预期长度为 504 bp的目标条带, 潮霉素
抗性基因表现阳性, 证实带有嵌合基因的 T-DNA区
已整合到水稻植株的基因组中, 有 3 株未扩增出目
标 DNA条带, 说明其为假阳性转基因植株。
对 T0代潮霉素抗性鉴定呈阳性的 5株转基因水
稻分单株收获, 在其 T1代的 5 个株系中, 随机选取

图 4 转基因水稻 T0代的 PCR验证
Fig. 4 Identification of T0 generation of transgenic rice plants
by PCR
第 1泳道为阳性对照(质粒 pTCK303-RiOsPDI), 第 2泳道为阴性
对照(未经转化的野生日本晴), 第 3~8泳道为 T0代转基因植株,
M为 DL2000 marker。
Lane 1 is positive control (plasmid of pTCK303-RiOsPDI), lane 2
is negative control (untransformed wild Nipponbare), lanes 3–8 are
T0 generation of transgenic rice plants, and M is DL2000 marker.
第 5期 刘光快等: 水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析 821


150 个单株提取其叶片基因组 DNA, 并进行潮霉素
抗性基因的 PCR 特异扩增, 阳性植株能扩增出 504
bp 的片段, 否则为分离的阴性植株。结果表明, 有
34 株产生了目标基因的分离, 分离比接近于 3∶1,
符合 3∶1的分离模式。其中, T1代 1号株系 33个单
株的遗传分离 PCR鉴定结果如图 5所示。
2.4 转基因 T2 代植株的农艺表现、高温结实特
性与 PDI基因的表达分析
与野生对照相比, PDI 基因沉默后的转基因植
株在株高、株型、分蘖特性和谷粒粒型等农艺性状
方面十分相近, 几乎难以区分出两者间的差别, 但
两者同一播期条件下种植, PDI 基因沉默阳性植株
的抽穗期一般比其野生对照迟 3~4 d, 且籽粒饱满
度和稻米透明度有所下降(图 6-a~e), 但稻米粗蛋白
和直链淀粉含量的变化不明显(图 6-f)。
人工控温处理的试验结果表明(表 2), PDI基因沉
默阳性 T2代株系在高温处理下的结实率显著下降、稻
米垩白和粗蛋白含量显著增加, 千粒重虽有所下降,
但统计分析未达到显著水平, 这与其野生对照日本晴
对温度处理的效应表现基本一致。但值得关注的是,
PDI 基因 RNAi 沉默株系在高温处理下结实率显著降
低, 其结实率分别为 20.9%和 43.6%; 与常规处理相比,
分别下降 70.6%和 42.9%。上述现象揭示, PDI基因沉
默会引起水稻开花结实期的耐高温特性下降, 导致其
高温胁迫下的结实率大幅降低, 但 PDI 基因沉默并未
引起稻米贮藏蛋白含量的明显下降。

图 5 转基因水稻 T1代的 PCR验证
Fig. 5 Identification of T1 generation of transgenic rice by PCR
泳道 1为阳性对照(质粒 pTCK303-RiOsPDI), 泳道 2为阴性对照(未经转化的野生日本晴), 泳道 3~35为 T1代转基因植株。
Lane 1 indicates positive control (plasmid of pTCK303-RiOsPDI), lane 2 indicates negative control (untransformed wild Nipponbare), lanes
3–35 indicate T1 generation of transgenic rice plants, and M is DL2000 marker.


图 6 转基因水稻(PDI基因沉默阳性植株)与野生对照间的植株形态、籽粒粒型及稻米理化组分比较
Fig. 6 Difference in plant phenotype, grain shape and quality components between PDI gene silencing transgenic plant and wild
Nipponbare (CK)
a: 抽穗期的植株形态; b和 c分别为日本晴的稻谷和稻米; d和 e分别是 PDI基因沉默后的稻谷和稻米; f: 成熟期籽粒中的总蛋白含量
(total protein)和直链淀粉含量(AC)。其中, PDI表示 PDI基因沉默植株, WT表示野生型对照。
a: plant phenotypes of transgenic plant and wild Nipponbare; b and c are grain morphology and dehulled grain shape for Nipponbare, d and e
are those for transgenic plant, respectively; f indicates the total protein and amylose content(AC) for PDI gene silencing transgenic plant and
Nipponbare.


822 作 物 学 报 第 39卷

PDI 基因沉默会引起稻米垩白米率和垩白度的
显著上升, 且在常温处理下与其野生型对照相比已
表现出较明显差别。在高温处理下, 转基因株系和
野生对照的垩白米率和垩白度均呈不同程度的上升
趋势, 但在同一温度处理下 PDI 基因沉默株系的垩
白米率和垩白度均远大于其野生型对照, 尤其是在
高温处理下 , 前者的垩白米率和垩白度分别达
100.0%和 81.3%, 显著高于其野生型对照(表 2)。说
明 PDI基因沉默与稻米垩白性状表现也可能存在一
定联系。

表 2 不同温度处理下 PDI基因沉默转基因水稻与野生型对照(日本晴)的穗部性状和主要品质指标变化
Table 2 Difference in panicle agronomic traits, sterility and major quality parameters for PDI silence transgenic rice and its wild
Nipponbare between normal temperature (NT) and high temperature (HT) treatments
日本晴 Nipponbare PDI沉默株系 PDI silence transgenic rice 植株结实状况与籽粒品质性状
Panicle agronomic traits or grain quality
parameters 常温处理 NT 高温处理 HT 常温处理 NT 高温处理 HT
单株有效穗数 Panicles per plant 6.5±1.8 A 6.7±1.5 A 6.3±0.9 A 6.8±1.3 A
每穗总粒数 Total grains per panicle 139.6±28.1A 154.4±22.5 A 132.2±15.8 A 135.0±21.1 A
每穗结实粒数 Filling grains per panicle 103.2±14.2 A 82.6±10.5 B 95.3±7.3 A 28.8±10.5 C
千粒重 1000-Grain weight (g) 24.2±0.6 A 24.5±0.9 A 22.05±0.6 C 23.33±0.7 B
结实率 Seed-setting rate (%) 76.3±5.3 A 43.6±6.8 C 71.2±8.6 B 20.9±7.6 D
垩白米率 Chalky grain rate (%) 16.5±7. 1D 62.6±9.3 B 39.8±7.6 C 100.0±0.8 A
垩白度 Chalky degree (%) 8.7±3.6 D 29.6±5.3 B 19.4±3.4 C 81.3±4.6 A
直链淀粉含量 Amylose content (%) 16.0±0.7 A 13.3±0.6 B 15.6±0.8 A 12.7±0.3 B
粗蛋白含量 Crude protein content (%) 8.8±0.5 B 11.3±0.7 A 8.6±0.3 B 12.0±0.9 A
NT和 HT分别代表常温及高温。在同一行中的大写字母相同者表示数据间的差异未达 1%统计显著水平。常温处理和高温处理
的日均温度分别为 22℃(日最高温 26℃/日最低温 18℃)和 32℃(日最高温 36℃/日最低温 26℃)。
NT and HT stand for normal temperature and high temperature, respectively..Data followed by the same capital letter mean no signifi-
cant difference at 1% level in the same rows. The daily mean temperatures were controlled at 22℃ (ranging from 26℃ to 18℃) for NT and
32℃ (ranging from 36℃ to 28℃) for HT, respectively.

PDI 基因沉默阳性植株茎鞘、叶片和籽粒器官
中的PDI基因表达量均较其野生型对照呈明显降低,
尤其是其籽粒中的 PDI表达量较微(图 7-a), 几乎能
引起靶基因的 80%左右沉默(图 7-b)。进一步利用荧

图 7 PDI基因在沉默后植株不同器官中的表达情况以及温度处理对发育籽粒中 PDI表达的影响效应
Fig. 7 Difference in PDI expression in various organs between RNAi silence rice and its wild CK (Nipponbare), and also the response
of PDI gene expression in filling endosperms to high temperature treatment
a和 b: 转基因植株与野生型对照(日本晴)不同器官(茎鞘、叶片和籽粒)中的 PDI表达量差异(RT-PCR检测, 以 actin基因为参照)。其
中, 1: 野生型日本晴茎鞘, 2: 转基因植株茎鞘, 3: 野生型日本晴叶片, 4: 转基因植株叶片, 5: 野生型日本晴籽粒, 6: 转基因植株籽
粒。a为电泳图, b为相对表达量。c: RNAi沉默转基因植株与其野生对照(日本晴)发育籽粒中 PDI基因的表达量变化动态及其不同温
度处理间差异(FQ-PCR检测, 以 Actin基因为参照)。其中, CK-HT和 CK-NT分别表示对照材料(日本晴)的高温处理和常温处理,
RNAi-HT和 RNAi-NT表示 PDI基因 RNAi沉默转基因植株的高温处理和常温处理。
a and b indicate the relative expression levels of PDI gene in various organs as assayed by RT-PCR with actin gene as the reference, in which
Lanes 1 and 2 were their stem and sheathes for Nipponbare and its transgenic rice, Lanes 3 and 4 were their leave for Nipponbare and its
transgenic rice, Lanes 5 and 6 were endosperms for Nipponbare and its transgenic rice. c: The temporal pattern of PDI expression in deve-
loping endosperms and its response to high temperature treatment as assayed by qRT-PCR with actin gene as the reference. CK-HT and
CK-NT indicate high temperature (HT) and normal temperature (NT) for Nipponbare, respectively; RNAi-HT and RNAi-NT indicate high
temperature (HT) and normal temperature (NT) for PDI silence transgenic rice, respectively.
第 5期 刘光快等: 水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析 823


光定量 PCR(FQ-PCR)对 PDI基因在籽粒中表达的动
态变化及其温度处理间差异的检测 (图 7-c)表明 ,
PDI 基因在水稻籽粒灌浆中期(第 15 天左右)的表达
量最高, 灌浆后期有所下降。与对照相比, PDI基因
在其 RNAi 沉默籽粒中的表达量在水稻灌浆的各个
时期均处于相对较低的表达水平。不同温度处理间
相比, 高温胁迫会诱导 PDI 基因的上调表达, 转基
因株系与其野生对照这一表现趋于一致。从它们的
相对表达量看 , 转基因株系在高温胁迫下籽粒中
PDI 基因的相对表达量虽有所上升, 但仍显著低于
其野生对照在适温处理下的表达水平。上述现象说
明, 尽管 PDI 基因沉默不会直接引起水稻在正常生
长条件下的结实率下降, 但与水稻在高温胁迫下的
结实特性有着密切联系。在高温胁迫下, 若 PDI 基
因的正常表达受到抑制, 就会对水稻的结实特性产
生不利影响。
3 讨论
RNAi 作为一种反向遗传技术, 现已在农作物
产量、品质、抗逆等重要性状的功能基因验证、表
达调控分析及其有关代谢途径研究方面得到较广泛
应用[21]。与转座子 T-DNA插入及反义抑制等技术相
比, RNAi技术的抑制效果稳定, 对特定基因的抑制
效率更高, 比单独应用正义或者反义 RNA 强 10 倍
以上[22]。本文在前期对水稻在高温胁迫下的有关基
因表达谱等研究工作的基础上, 对行使蛋白二硫键
形成和错配二硫键重排等生理功能的蛋白质二硫键
异构酶(PDI)进行了基因 RNAi沉默。所选取的干涉
区域在水稻 PDI 基因(NM_001073968) mRNA 序列
的第 290~739 碱基之间, 靶标序列的 RNAi 干扰片
段为 450 bp, 结合双元表达载体 pTCK303 (约 14.6
kb)的多克隆酶切位点, 构建了以 Ubiquitin 启动子
驱动的含有内含子 hpRNA (ihpRNA)的双元表达载
体 pTCK303-RiOsPDI。经 T0代和 T1代对其潮霉素
(Hyg)抗性基因的 PCR 鉴定, 证实带有嵌合基因的
T-DNA 已整合到水稻基因组中(图 4 和图 5)。由于
本文目标基因 PDI沉默的发夹结构是由Ubiquitin组
成型启动子所驱动的 , 因而转基因植株不同器官
(茎、鞘、叶片和籽粒)中的 PDI 表达量均受到不同
程度的抑制。在本文结果中, PDI沉默植株的生育期
要比其野生型晚 3~4 d, 其原因可能与 PDI沉默后引
起转基因植株抗逆性下降, 导致其大田条件下生长
发育进程略延缓有关。
大量研究表明, 高温、干旱、盐渍等逆境能诱
导高等植物合成多种类型的热激蛋白, 并作为“分子
伴侣”参与生物在逆境胁迫下的许多代谢过程[9,23]。在
这个过程中的一个显著生理变化是, 细胞中正常的
酶蛋白代谢受到抑制, 而转向合成一些与高温胁迫
的防卫效应有关蛋白[24]。PDI 酶在真核生物的内质
网中除直接参与催化蛋白二硫键形成和减少多肽二
硫键错配等生理作用外, 也同时具有分子伴侣的部
分功能, 可以缓解逆境胁迫对内质网有关代谢反应
的影响[1,3,9]。Ko 等[24]研究表明, PDI 基因表达的消
失, 会减弱植物细胞中内质网信号介导的细胞程序
性死亡过程 , 对植物的逆境胁迫抗性产生负效应 ,
并加速植物衰老和死亡。最近 Yang 等[25]对拟南芥
TMS1 基因突变体的研究揭示, TMS1 基因突变会引
起 PDI 生理功能的部分缺失, 以及 PDI 催化底物的
氧化还原状态改变, 导致拟南芥花粉育性降低、结
实率下降。据 Fatima等[26]报道, BiP基因超表达烟草
的耐旱性增强, 也与其在干旱胁迫下 PDI 基因的高
表达及细胞中 ATP 活性和 Ca2+释放过程有密切联
系。在本文结果中, PDI基因沉默会引起水稻在高温
处理下的结实率明显下降 , 但在正常生长条件下 ,
转基因植株的结实率与对照间的差异并不明显(表
2)。我们推测, 这可能与 PDI 在逆境胁迫下的分子
伴侣特性有关, 由于内质网在逆境条件下的防御代
谢(包括多肽转运、蛋白折叠、钙稳态、多肽修复、
ATP酶激活等)需要 PDI和 Bip等分子伴侣成员的分
工协作和共同参与[1,3,23], 且 PDI 在此逆境防御过程
中的生理作用又是其他分子伴侣(Bip 和 HSPs 等)所
不能替代的[27-28], 因此在逆境胁迫下, 若 PDI 基因
的“正常”表达被抑制, 则不利于内质网等细胞器对
逆境胁迫的防御, 以及缓解逆境胁迫对内质网结构
与代谢功能的伤害。加之花器官是水稻对高温胁迫
十分敏感的器官[17], 这可能是 PDI 基因沉默对高温
胁迫下水稻结实率的影响大于千粒重等产量性状的
一个重要原因。
PDI 在富含贮藏蛋白的植物组织、器官中的含
量较丰富, 可能与籽实器官中的贮藏蛋白合成过程
有 关[10,29-30]。据报道, 玉米醇溶蛋白前体 a-zein 进
入蛋白体是在 PDI协助下进行[31]; 水稻 esp2突变体
材料表现出的贮藏蛋白合成代谢异常, 引起谷蛋白
前体过度增高和谷蛋白积累量降低, 其原因也是由
类 PDI 基因(Protein Disulfide Isomerase Like 1-1,
PDIL1-1)位点产生突变引起的, PDI 缺失会导致谷
824 作 物 学 报 第 39卷

蛋白前体由内质网内腔向液泡的转运过程发生障碍,
进而谷蛋白 57 kD前体在液泡中加工、难以转化成
40 kD酸性亚基和 20 kD碱性亚基[32]。但也有研究
报道认为, PDIL1-1 并不是内质网输出成熟谷蛋白
前体及其向液泡转运过程所必需的 [8,33], 加之醇溶
蛋白和谷蛋白前体在内质网腔中的合成部位不同[34],
因此 PDIL1-1 在蛋白合成中的作用可能主要是与膜
蛋白、糖蛋白等类型蛋白的修饰及其信号传递过程
有关[4,8,35]。最近, 中国农业科学院万建民课题组对
一个新的水稻粉质突变体(T3612)的突变基因的鉴
定结果表明, PDIL1-1 基因是该胚乳粉质突变体材
料的突变位点, PDIL1-1 基因缺失会引起胚乳淀粉
合成代谢途径中质体结合型 ADPG焦磷酸化酶和异
淀粉酶等酶活性的大幅度降低, 导致胚乳淀粉粒发
育不正常、淀粉排列结构松散、支链淀粉分支结构
改变和胚乳粉质突变, 揭示 PDI 基因不仅与水稻胚
乳中的贮藏蛋白积累有关, 而且也与其淀粉合成代
谢过程有较密切联系[36]。据本课题组关于人工控温
处理下水稻胚乳贮藏物代谢相关基因对高温胁迫响
应表达谱征的微阵列检测结果表明, 在水稻胚乳贮
藏蛋白合成代谢的诸多相关基因中, PDI 是一个对
高温胁迫较敏感的基因, 并推测其与高温胁迫下的
水稻贮藏蛋白合成过程及组分变化有关[17]。在本文
研究结果中, PDI 基因对高温胁迫的响应具上调表
达特征, 这与前人的研究报道结论一致。但出乎意
料的是, PDI基因 RNAi沉默后的转基因植株, 其籽
粒中的贮藏蛋白含量并没有出现较显著降低, 稻米
直链淀粉含量也与野生型日本晴相仿(图 6), 此外,
PDI 基因沉默虽然会引起稻米透明度变差、垩白化
程度增加, 但胚乳的完全粉质化现象并不明显(表 2
和图 6)。由于稻米垩白的形成通常是由胚乳淀粉合
成代谢受阻、淀粉粒发育不良、淀粉粒间排列松散
所致, 而 PDI 作为一种特殊的分子伴侣, 可以帮助
糖转运、淀粉合成等代谢途径中的多种酶蛋白行使
其正常的生理功能 [6,10], 与胚乳淀粉合成代谢途径
中的质体结合型 ADPG焦磷酸化酶和异淀粉酶等酶
活性均存在着一定联系[36]。据此笔者推测, 本文中
PDI 基因沉默阳性植株在正常生长条件下稻米透明
度降低、垩白度增加现象的原因, 可能是其 PDI 基
因在籽粒中的正常表达受到抑制后, 引起了胚乳糖
转运或淀粉合成代谢环节的某些关键酶难以行使其
正常功能或在一定程度上受阻, 但可能有关酶基因
(控制胚乳粉质的几个关键基因)的功能尚未彻底丧
失, 因而 PDI 基因沉默的水稻胚乳没有出现完全粉
质化的现象。然而, 对于 PDI 基因 RNAi 沉默后稻
米贮藏蛋白含量却没有出现显著降低的原因, 笔者
目前尚不能从贮藏蛋白合成过程的多肽折叠、蛋白
前体转运、蛋白亚基组装等代谢环节加以明确解释。
与此同时, 鉴于 PDI 在生理上的多功能特征及其与贮
藏蛋白合成和碳水化合物代谢间联系的复杂性[23-34],
因此本文通过 PDI基因沉默方法对 PDI基因与稻米
贮藏蛋白和垩白等品质指标间关系的初步认识, 值
得后续研究工作进一步从籽粒碳、氮代谢的分子生
理角度对有关现象的深层次原因加以解析。
4 结论
以 PDI 基因(NM_001073968) mRNA 序列的第
290~739碱基之间 450 bp的靶标序列作为干扰区段,
所构建的 RNAi 沉默双元表达载体 pTCK303-RiO-
sPDI 转化日本晴后, 转基因植株籽粒、叶片和茎鞘
器官中的 PDI 表达量均受到不同程度的抑制, 尤其
是对籽粒中的 PDI 表达抑制效果更为明显, 几乎能
引起靶基因的 80%左右沉默; PDI 基因沉默转基因
植株与野生对照植株间的株高、株型、分蘖特性和
谷粒粒型等农艺性状指标相仿, 但稻米透明度有所
下降, 垩白度也呈较明显的上升趋势; PDI基因沉默
转基因植株的千粒重、籽粒结实率、直链淀粉含量
和粗蛋白含量等产量品质指标, 在正常生长条件下
与其野生对照相比变化不大, 或者略低于后者, 但
PDI 基因 RNAi 沉默后会引起水稻在高温处理下的
结实率大幅度降低, 对高温胁迫的耐热性(或抗热性)
明显变差。
References
[1] Noiva R, Lennarz W J. Protein disulfide isomerase: a multifunc-
tional protein resident in the lumen of the endoplasmic reticulum.
J Biol Chem, 1992, 267: 3553−3556
[2] Wilkinson B, Gilbert H F. Protein disulfide isomerase. Biochim
Biophys Acta, 2004, 1699: 35−44
[3] Urade R. Cellular response to unfolded proteins in the endoplas-
mic reticulum of plants. FEBS J, 2007, 274: 1152–1171
[4] Kaufman R J. Stress signaling from the lumen of the endoplas-
mic reticulum: coordination of gene transcriptional and transla-
tional controls. Genes Dev, 1999, 13: 1211–1233
[5] Tian G, Xiang S, Noiva R, Lennarz W J, Schindelin H. The crys-
tal structure of yeast protein disulfide isomerase suggests coop-
第 5期 刘光快等: 水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析 825


erativity between its active sites. Cell, 2006, 124: 61–73
[6] Puig A, Gilbert H F. Protein disulfide isomerase exhibits chaper-
one and anti-chaperone activity in the oxidative refolding of ly-
sozyme. J Biol Chem, 1994, 269: 7764−7771
[7] Lebeche D, Lucero H A, Kaminer B. Calcium binding properties
of rabbit liver protein disulfide isomerase. Biochem Biophys Res
Commun, 1994, 202: 556−561
[8] Wetterau J R, Combs K A, Spinner S N, Joiner B J. Protein di-
sulfide isomerase is a component of the microsomal triglyceride
transfer protein complex. J Biol Chem, 1990, 265: 9800−9807
[9] Gilbert H F. Protein chaperones and protein folding. Curr Opin
Biotechnol, 1994, 5: 534−540
[10] Wadahama H, Kamauchi S, Ishimoto M, Kawada T, Urade R.
Protein disulfide isomerase family proteins involved in soybean
protein biogenesis. FEBS J, 2007, 274: 687−703
[11] Edman J C, Ellis L, Blacher R W. Sequence of protein disulphide
isomerase and implications of its relationship to thioredoxin. Na-
ture, 1985, 317: 267−270
[12] Yamauchi K, Lmabert N, Fredman R B. Sequence of mem-
brane-associated thyroid hormone binding protein from bovine
liver: its identity with protein disulfide isomerase. Biochem
Biophys Res Commun, 1987, 146: 1485−1490
[13] Walker K W, Gilbert H F. Scanning and escape during pro-
tein-disulfide isomerase-assisted protein folding. J Biol Chem,
1997, 272: 8845–8848
[14] Van Lith M, Karala A R, Bown D, Gatehouse J A, Ruddock L W,
Saunders P T K, Benham A M. A developmentally regulated
chaperone complex for the endoplasmic reticulum of male hap-
loid germ cells. Mol Biol Cell, 2007, 18: 2795–2804
[15] Xu Z J, Ueda K, Kiyoshi M, Ono M, Inoue M. Molecular char-
acterization of a novel protein disulfide isomerase in carrot. Gene,
2002, 284: 225–231
[16] Cao Y-Y(曹云英), Duan H(段骅), Yang L-N(杨立年), Wang
Z-Q(王志琴), Liu L-J(刘立军), Yang J-C(杨建昌). Effect of
high temperature during heading and early grain filling on grain
yield of indica rice cultivars differing in heat-tolerance and its
physiological mechanism. Acta Agron Sin (作物学报), 2009,
35(3): 512−521 (in Chinese with English abstract)
[17] Wei K-S(韦克苏), Cheng F-M(程方民), Dong H-T(董海涛),
Zhang Q-F(张其芳), Liu K-G(刘奎刚), Cao Z-Z(曹珍珍). Mi-
croarray analysis of gene expression profile to grain storage me-
tabolism in rice endosperm as affected by high temperature at
filling stage. Sci Agric Sin (中国农业科学), 2010, 43(1): 1−11
(in Chinese with English abstract)
[18] Yasuda H, Hirose S, Kawakatsu T, Wakasa Y, Takaiwa F.
Overexpression of BiP has inhibitory effects on the accumulation
of seed storage proteins in endosperm cells of rice. Plant Cell
Physiol, 2009, 50: 1532–1543
[19] Wei K-S(韦克苏), Zhang Q-F(张其芳), Cheng F-M(程方民),
Chen N(陈能), Xie L-H(谢黎红). Expression profiles of rice
soluble starch synthase (SSS) genes in response to high tempera-
ture stress at filling stage. Acta Agron Sin (作物学报), 2009,
35(1): 18−24 (in Chinese with English abstract)
[20] Zakaria S, Mastuda T, Tajima S, Nitta Y. Effect of high tem-
perature at ripening stage on the reserve accumulation in seed in
some rice cultivars. Plant Prod Sci, 2002, 5: 160−168
[21] Auer C, Frederick R. Crop improvement using small RNAs: ap-
plications and predictive ecological risk assessments. Trends Bio-
technol, 2009, 27: 644−651
[22] Hamilton A J, Baulcombe D C. A novel species of small an-
tisense RNA in post-transcripional gene silencing. Science, 1999,
286: 950−952
[23] Boston R S, Viitanen P V, Vierling E. Molecular chaperones and
protein folding in plants. Plant Mol Biol, 1996, 32: 191−222
[24] Ko H S, Uehara T, Nomur Y. Role of ubiquilin associated with
protein-disulfide isomerase in the endoplasmic reticulum in
stress-induced apoptotic cell death. J Biol Chem, 2002, 277:
35386−35392
[25] Yang K Z, Xia C, Liu X L, Dou X Y, Wang W, Chen L Q, Zhang
X Q, Xie L F, He L Y, Ma X, Ye D. A mutation in
THERMOSENSITIVE MALE STERILE 1, encoding a heat shock
protein with DnaJ and PDI domains, leads to thermosensitive
gametophytic male sterility in Arabidopsis. Plant J, 2009, 57:
870–882
[26] Fatima C A, Sonia M B, Carlos M, Wagner C O, Elizabeth P B F.
Enhanced accumulation of BiP in transgenic plants confers tol-
erance to water stress. Plant Physiol, 2001, 126:1042–1054
[27] Wakasa Y, Yasuda H, Ono Y, Kawakatsu T, Hirose S, Takahashi
H, Hayashi S, Yang L J, Takaiwa F. Expression of ER quality
control-related genes in response to changes in BiP1 levels in
developing rice endosperm. Plant J, 2011, 65: 675–689
[28] Houston N L, Fan C, Xiang Q Y, Schulze J M, Jung R, Boston R
S. Phylogenetic analyses identify 10 classes of the protein disul-
fide isomerase family in plants, including single-domain protein
disulfide isomerase-related proteins. Plant Physiol, 2005, 137:
762–778
826 作 物 学 报 第 39卷

[29] Onda Y, Kumamaru T, Kawagoe Y. ER membrane localized
oxidoreductase Ero1 is required for disulfide bond formation in
the rice endosperm. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106:
14156−14161
[30] Koh A, Nishimura K, Urade R. Relationship between endoge-
nous protein disulfide isomerase family proteins and glutenin
macropolymer. J Agric Food Chem, 2010, 58: 12970–12975
[31] Li C P, Larkins B A. Expression of protein disulfide isomerase is
elevated in the endosperm of the maize floury-2 mutant. Plant
Mol Biol, 1996, 30: 873−882
[32] Takemoto Y, Coughlan S J, Okita T W, Satoh H, Ogawa M,
Kumamaru T. The rice mutant esp2 greatly accumulates the
glutelin precursor and deletes the protein disulfide isomerase.
Plant Physiol, 2002, 128: 1212−1222
[33] Muench D G, Wu Y, Zhang Y, Li X, Boston R S, Okita T W.
Molecular cloning, expression and subcellular localization of a
BiP homolog from rice endosperm tissue. Plant Cell Physiol,
1997, 38: 404–412
[34] Satoh-Cruz M, Crofts A J, Takemoto-Kuno Y, Sugino A,
Washida H, Crofts N, Okita T W, Ogawa M, Satoh H,
Kumamaru T. Protein disulfide isomerase like 1-1 participates in
the maturation of proglutelin within the endoplasmic reticulum in
rice endosperm. Plant Cell Physiol, 2010, 51: 1581–1593
[35] Majoul I, Ferrari D, Söling H D. Reduction of protein disulfide
bonds in an oxidizing environment the disulfide bridge of cholera
toxin A-subunit is reduced in the endoplasmic reticulum. FEBS
Lett, 1997, 401: 104−108
[36] Han X H, Wang Y H, Jiang L, Ren Y L, Liu F, Peng C, Li J J, Jin
X M, Wu F Q, Wang J L, Guo X P, Zhang X, Cheng Z J, Wan J
M. The failure to express a protein disulphide isomerase-like
protein results in a floury endosperm and an endoplasmic reticu-
lum stress response in rice. J Exp Bot, 2012, 63: 121–130