全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(3): 405 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由江苏省自然科学基金项目(BK2012767)和中央高校基本科研业务费专项(KYZ201301)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 谭河林, E-mail: hltan@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2014-09-03; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2015-01-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150112.0939.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00405
甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶 I基因的克隆及表达模式
谭河林 1, 许欣颖 1 付立曼 1 向小娥 2 李剑桥 1 郭昊伦 1 叶文雪 1
1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2 南京农业大学动物科学类国家教学示范中心, 江苏南京
210095
摘 要: DNA甲基化作为一种表观遗传调控方式, 在植物体生长发育中起重要作用, 而甲基转移酶 I (DNA methylase
I, MET1)在甲基化过程中起主要作用。本研究克隆到 5个油菜 BnMET1 同源基因, 并比较了白菜 BrMET1、甘蓝
BoMET1 和油菜 BnMET1 同源基因的进化及其表达模式。结果显示, 白菜和甘蓝 MET1 同源基因在进化中较为保守,
而油菜 BnMET1 基因结构发生较大改变; 部分油菜 BnMET1 同源基因表达发生沉默, 而激活表达的 BnMET1 表达模
式较其亲本白菜和甘蓝直系 MET1同源基因发生明显的改变。上述结果表明, BnMET1同源基因通过改变基因结构以
及表达模式影响油菜组织中 BnMET1基因剂量, 从而调节油菜的生长发育。
关键词: DNA甲基化; 甲基化酶 I; 基因进化; 基因差异表达
Cloning and Expression Pattern of DNA Methylase I (MET1) from Brassica
napus L. and Its Progenitors
TAN He-Lin1,*, XU Xin-Ying1, FU Li-Man1, XIANG Xiao-E2, LI Jian-Qiao1, GUO Hao-Lun1, and YE
Wen-Xue1
1 State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China; 2 Animal Sciences National Teaching Demonstration
Center, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Methylation in genomic DNA, a way of epigenetic regulation, plays an important role during the growth and develop-
ment of plant. As allotetraploid oilseeds plant, Brassica napus (AACC, 2n = 38) originated from the natural cross between Bras-
sica napus (AA, 2n = 20) and Brassica oleracea (CC, 2n=18), containing duplicate genes. Here, we isolated and characterized
five BnMET1s, which are orthologous gene of Arabidopsis AtMET1 acted as transferase in DNA methylation. Our results showed
that there were conspicuous variations in gene structures of BnMET1s compared with its orthologos of BrMET1 and BoMET1,
leading to more abundant divergences in coding region of BnMET1s. Moreover, we found that some divergences among BnMET1
paralogous genes were derived from its progenitor orthologous genes of B. rapa or B. oleracea. Furthermore, the transcription
analysis indicated that partial BnMET1 paralogs were silence, and the expression patterns of the activated BnMET1 were altered in
contrast to its BoMET1 orthologs in B. oleracea and BrMET1 orthologs in B. rapa. Taken all these together, we speculated that
duplicate BnMET1s regulate the development process of B. napus with a certain gene dosage kept by altering their gene structures
and spatio-temporal expression patterns.
Keywords: DNA methylation; Methylase I ; Gene evolution; Differential expression
DNA甲基化作为调控植物生长发育的一种重要
方式, 其作用机制是对基因DNA序列中胞嘧啶进行
甲基化修饰, 从而影响基因的表达(基因被激活或者
被沉默)来调控植物的生长发育[1-2]。DNA甲基化在
不同物种、不同时空、不同器官之间表达的变化是
植物正常生长发育所必需的[3-4]。目前, 多种植物甲
基化酶基因被克隆并进行了详细的功能分析, 但是
对于大多数为多倍体的农作物其甲基化酶研究相对
滞后。因此, 对多倍体甲基化酶基因的克隆和研究,
有助于阐明多拷贝甲基化酶基因对多倍体作物生长
调控的机制。
DNA甲基化是新生DNA链胞嘧啶(C)被甲基化
406 作 物 学 报 第 41卷


酶共价甲基修饰的过程[5]。植物细胞中甲基化酶较
多, 根据甲基化酶的结构和功能差异, 可将植物细
胞中的DNA甲基化酶分为MET1甲基转移酶、染色质
甲基化酶和结构域重排甲基转移酶3类[6]。MET1甲
基转移酶主要是对新生DNA链中重复和单拷贝序列
进行甲基化修饰 [7], 从而维持基因组DNA序列中的
甲基化水平[8]。现已在诸多植物中分离鉴定到MET1
及其同源基因[9]。第一个植物MET1甲基转移酶基因
由Finnegan等[10]在拟南芥中分离得到。拟南芥ATMET1
突变体植株具有矮小, 开花延迟等表型 [11-12], 这些
表型主要是由于甲基化酶突变使得特殊位点的甲基
化缺失导致。研究发现 ATMET1突变体中开花控制
因子FWA缺少甲基化导致开花延迟[13]。在需春化作
用的小麦中也发现同样的现象, 从小麦克隆的5个甲
基化酶基因, 在春化小麦中的表达受到推迟或抑制[14],
表明小麦营养生长向生殖生长转化过程与甲基化相
关。从烟草克隆的甲基转移酶NtMET1, 其反义转基
因导致烟草基因组甲基化水平下降, 导致植株的形
态建成受到影响[15]。从草莓基因组克隆的2个MET1
基因 , FaMET1a和FaMET1b, 体外繁殖试验表明其
表达水平与草莓基因组整体甲基化水平具有一定相
关性[16]。此外, 植物甲基化酶MET1还参与植物的应
激反应。研究发现, 玉米甲基转移酶ZmMET1对低温
处理后的植物部分组织DNA甲基化水平降低具有抑
制作用 [17]。从冷处理水稻材料表达谱发现OsMET1
表达水平显著上升[18]。
甘蓝型油菜(Brassica napus, AACC)是我国最重
要的油料作物之一, 是由白菜(Brassica rapa, AA)和
甘蓝(Brassica oleracea, CC)自然杂交进化形成的异
源四倍体作物 [19]。白菜和甘蓝基因组测序表明 ,
MET1基因在白菜和甘蓝基因组中均有3个旁系同源
基因[20-21]。最近, 甘蓝型油菜基因组测序表明甘蓝
型油菜基因组中有6个BnMET1旁系同源基因[22]。这
些BnMET1同源基因在油菜基因组形成和进化过程
中, 通过何种方式调控加倍后同源基因的表达, 维
持一定水平的BnMET1基因剂量 , 影响油菜的生长
发育 , 目前不得而知。本研究克隆油菜基因组
BnMET1同源基因, 通过分析其与白菜和甘蓝MET1
直系同源基因的进化关系以及在不同器官的表达模
式 , 揭示多倍体油菜中多拷贝BnMET1基因协同表
达调控油菜生长发育的模式。
1 材料与方法
1.1 油菜 BnMET1 基因克隆及白菜和甘蓝基因
的获取
利 用 拟 南 芥 AtMET1 (Arabidopsis thaliana
MET1, AtMET, At5g49160)蛋白序列在白菜数据库
BRAD (http://brassicadb.org/brad/)进行 BlastP和基因
注释检索, 获得白菜和甘蓝 MET1 基因。以白菜和
甘蓝 MET1 基因 CDS 序列为模板, 分别设计油菜
BnMET1基因同源克隆引物(表 1)。
1.2 BnMET1、BrMET1和 BoMET1进化分析
克隆所得的 BnMET1 DNA序列通过基因在线预
测 GENESCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)
获得 BnMET1 基因相应的蛋白序列和基因结构, 白菜
和甘蓝 MET1 蛋白序列从 BRAD 数据库下载。利用
MEGA软件构建基因进化树。利用在线GSDS 2.0 (GSDS,
http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)软件构建基因结构图。

表 1 克隆 BnMET1基因所用引物
Table 1 Primers used for cloning BnMET1 genes
基因
Gene
上游引物
Forword
Primer
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物
Reverse
Primer
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
来源
Resource
BnMET1-1 BnF1 ATGGTGAGTAACGGAGCTAAGGC BnR1 CTAGTTTGTTTTGGGGACCTTCT
Bol045816
(BoMET1-1)
BnMET1-2 BnF2 ATGGTGAGAAACGGAAGCAAGGC BnR2 CTAATTACTTTTGGCGAAGTTGTTG
Bra039939
(BrMET1-1)
BnMET1-3 BnF3 ATGGTGAGAAACGGAAGCAAGGC BnR3 CTAATTACTTTTGGCGAAGTTGTTG
Bol031719
(BoMET1-2)
BnMET1-4 BnF4 ATGGAAGAAGAATCTTCTAAT BnR4 TTATTGTTGAAGAGGAAGTTTCTTG
Bol016616
(BoMET1-3)
BnMET1-5 BnF5 ATGGATGATGGAAACTCATGGA BnR5 TTAGGGTTTCTGTTGAAGAGGAGGT
Bra010026
(BrMET1-3)
BnMET1-6 BnF6 ATGGTGAGAAACGGAACCAAGGC BnR6 CTAGTTTGTTTTGGTGACCTTCTTG
Bra030191
(BrMET1-2)
第 3期 谭河林等: 甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶 I基因的克隆及表达模式 407


1.3 组织材料的采集与 RNA的提取
将油菜中双 11、白菜型油菜 TN004 和羽衣甘
蓝种植在试验田中, 每个材料种植 3 行, 每行种植
10穴, 每穴 1株, 株行株距为 20 cm × 40 cm。植株
将抽薹开花时 , 采集幼嫩叶片 ; 植株开花时 , 标记
开花时间, 收集开花后 7 d (7 days after flower)、
14 d和 21 d角果, 从每个植株剪取 1~2个角果, 十
株角果混在一起; 同时从每株采取 1~2 个花蕾, 十
株花蕾混在一起, 即每个材料具 3 个生物重复。田
间所采集的样品用液氮速冻 , 然后转入–80℃冰箱
保存待用。
使用 Plant RNA Mini Kit (Watson Biotechnol-
ogies) RNA 提取试剂盒, 按其操作说明提取组织总
RNA。取 4 L RNA, 加入 96 L DEPC-H2O, 振荡混
匀, 用紫外分光光度计测定 260 nm波长 OD值, 其
数值即为 RNA浓度。
1.4 cDNA合成
取1~2 g总RNA, 加DEPC水至10 L。加入Oligo
(dT)15 1 L和10 mmol L–1 dNTPs 1 L, 混匀。放入
PCR仪中65℃ 5 min, 然后取出置冰上 , 快速加入
5×缓冲液4 L、RNase inhibitor 1 L、0.1 mol L–1
DTT 2 L、5 U L–1反转录酶H 0.5 L, 在PCR仪上进
行反转录反应(cDNA合成), PCR程序为42℃ 50 min;
45℃ 10 min; 50℃ 10 min; 70℃ 15 min。完成反应
后加1 L 10 mg mL–1 RNase, 于37℃放置30~60
min。将分装产物保存于–80℃冰箱待用。
1.5 MET1表达模式分析
为了区别每个油菜、白菜和甘蓝 MET1 同源基
因的表达差异, 根据 MET1同源基因 CDS序列特异
性 , 设计每个 MET1 同源基因特异对引物 ; 用
BnACTIN、BrACTIN和 BoACTIN作为油菜、白菜和
甘蓝的内参(表 2)。
实时荧光定量 PCR使用 Promega qRT-PCR mix,
反应体积 20 L, 含 qPCR SYBR Green Master Mix
10 L、上下游引物各加 0.5 L、合成的 cDNA经 10
倍稀释后的 8.5 L, 实时定量 PCR反应条件为 95℃
5 min; 95℃ 10 s, 58℃ 30 s, 65℃ 10 s; 40个循环。
每个反应 3个技术重复。

表 2 完成基因表达分析所用引物
Table 2 Primers used in qRT-PCR for determining MET1 expression
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5–3)
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5–3)
BnMET1-1qF CAATTGGCGATCTTCCATCC BrMET1-3qF TACTCCAGAGTTGAAAATAAA
BnMET1-1qR CAAATCTACCACTTGCCCTT BrMET1-3qR TTTTTTTGAGGTTTTTGAGG
BnMET1-2qF GGCGATCTTCCATCCGTAGA BoMET1-1qF CAATTGGCGATCTTCCATCC
BnMET1-2qR CAAATCTACCACTTGCCCTT BoMET1-1qR CAAATCTACCACTTGCCCTT
BnMET1-3qF AATGGAGAATCCAATATAG BoMET1-2qF TTTTACCAGGTTTCGCTGCT
BnMET1-3qR TTTTACCAGGTTTCGCTGCT BoMET1-2qR AATGGAGAATCCAATATAA
BnMET1-4qF TACTCCAGAGTTGAAAATAAA BoMET1-3qF TACTCCAGAGTTGAAAATAAA
BnMET1-4qR TTTTTTTGAGGTTTTTGAGA BoMET1-3qR TTTTTTTGAGGTTTTTGAGA
BnMET1-5qF TACTCCAGAGTTGAAAATAAA BnACTINF ACGAGCTACCTGACGGACAAG
BnMET1-5qR TTTTTTTGAGGTTTTTGAGG BnACTINR GAGCGACGGCTGGAAGAGTA
BrMET1-1qF GGCGATCTTCCATCCGTAGA BoACTINF ATCGAGCACGGTATTGTAAGC
BrMET1-1qR CAAATCTACCACTTGCCCTT BoACTINR CCCACTAGCGTAAAGAGAAAG
BrMET1-2qF AATGGAGAATCCAATATAG BrACTINF GTTGCTATCCAGGCTGTTCT
BrMET1-2qR TTTTACCAGGTTTCGCTGCT BrACTINR AGCGTGAGGA AGAGCATAAC

2 结果与分析
2.1 BnMET1基因克隆
利用拟南芥 AtMET1 蛋白序列在白菜数据库
BRAD 进行 BlastP, 获得白菜 (B. rapa)和甘蓝 (B.
oleracea)最大相似性的基因各 3个, 即 Bra039939、
Bra030191和 Bra010026; Bol045816、Bol031719和
Bol016616。进一步在白菜和甘蓝数据库中通过基因
注释方式检索白菜和甘蓝 MET1 基因, 获得白菜和
甘蓝的 MET1 基因各 3 个, 与利用拟南芥蛋白比对
结果相一致。把获得的白菜 MET1 基因分别命名为
BrMET1-1、BrMET1-2和 BrMET1-3; 甘蓝 MET1基
因分别命名为 BoMET1-1、BoMET1-2和 BoMET1-3。
油菜是白菜和甘蓝基因组杂交形成的, 由于目
前尚无 BnMET1 相关核酸序列, 因而以白菜和甘蓝
408 作 物 学 报 第 41卷


MET1 基因序列为模板设计油菜 BnMET1 基因同源
克隆引物。为获得 BnMET1基因组 DNA序列, 了解
基因编码区结构变异 , 以油菜中双11 品种基因组
DNA 为模板, 进行 PCR 扩增(图 1)。扩增片段经测
序, 序列利用基因在线预测 GENESCAN (http://genes.
mit.edu/GENSCAN.html), 最终获得 5个 BnMET1基
因的全长 DNA序列, 长度分别为 5290、5289、7106、
1041 和 6389 bp。这 5 个 BnMET1 基因分别被命名
为 BnMET1-1、BnMET1-2、BnMET1-3、BnMET1-4
和 BnMET1-5。

图 1 扩增油菜 BnMET1基因
Fig. 1 Amplified BnMET1 gene sequences from B. napus
genomic DNA
M: DL2000 DNA marker, 左边数值为 DNA条带相应分子量; 1~6:
同源克隆引物对(见表 1)扩增产物 BnMET1-2、BnMET1-1、
BnMET1-4、BnMET1-3、BnMET1-6和 BnMET1-5。
M: DL2000 DNA marker, of which the molecular weight of each
DNA band is showed at the left of the gel, the lanes 1–6 on the gel
from left to right are PCR amplified products (BnMET1-2,
BnMET1-1, BnMET1-4, BnMET1-3, BnMET1-6, and BnMET1-5)
with primer pairs listed in Table 1.

2.2 BnMET1蛋白进化分析
为了解所获得的 BnMET1 基因是否源自白菜和
甘蓝基因组 MET1 基因, 克隆获得的 BnMET1 基因
DNA 序列通过基因在线预测 GENESCAN 获得
BnMET1 基因相应蛋白序列。将 5 个 BnMET1 蛋白
序列以及白菜和甘蓝 MET1 蛋白序列利用
MEGA6.06 软件进行分析, 获得 BnMET1、BrMET1
和 BoMET1蛋白与拟南芥 AtMET1蛋白进化树。
BnMET1 蛋白聚簇表明, 每个 BnMET1 蛋白由
相似性对比均能比对到与之相对应的 BrMET1 和
BoMET1 蛋白, 形成一对一的相似配对, 并聚成直
系同源蛋白簇(图 2): BoMET1-1 与 BnMET1-1 相似
配对, BrMET1-1与 BnMET1-2相似配对, 这 4个蛋
白聚成一簇形成直系同源蛋白簇(I); BoMET1-3 与
BnMET1-4相似配对, BrMET1-3与 BnMET1-5相似
配对 , 这 4 个蛋白聚成一簇 (III); BoMET1-3 与
BnMET1-4, 由于 BnMET1-6 未克隆到 , 缺少与
BrMET1-2对应的油菜直系同源基因, 因而该簇直系
同源蛋白仅有 3个(II)。上述结果表明本研究所克隆
的 BnMET1 为油菜真实 MET1 基因, 也表明油菜基
因组进化上是由白菜和甘蓝基因组杂交而来的。
蛋白序列进化树表明, 白菜、甘蓝和油菜 MET1
与拟南芥 MET1 处于不同的分支 , 分支节点表明
AtMET1与 BrME1T、BoMET1和 BnMET1分化发生
在大约 2000万年前。白菜、甘蓝和油菜 MET1明显
分为 3簇(图 2)。每簇均包含白菜、甘蓝和油菜 MET1
基因。然而分化时间比较, 第 III簇的直系同源基因
分化时间明显较第 I 簇和第 II 簇早, 大约发生在
1300万年前, 而 I和 II簇分化大约发生在 1000万年
前(图 2)。说明白菜和甘蓝基因组形成前, 该 3 个
MET1 直系同源基因已经存在于古老的十字花科植
物基因组。后续形成白菜和甘蓝物种基因组后, 3个
直系同源基因变异分化过程是独立进行的。图 2 端
支节点表明第 I 簇和第 Π 簇中 BrMET1 直系同源基
因变异分化较 BoMET1早, 然而第 III簇中 BoMET1-
3直系同源基因变异分化却比 BrMET1-3早。

图 2 白菜、甘蓝、油菜和拟南芥 MET1蛋白进化树
Fig. 2 Phylogenetic trees of BnMET1, BrMET1, BoMET1, and
AtMET1 based on the protein sequence
白菜 BrMET1、甘蓝 BoMET1、油菜 BnMET1 和拟南芥 AtMET1
蛋白进化树使用MEGA 6.06软件利用 NJ (Neighbor-Joining)建树
法构建, 标尺为进化时间, 单位 MY (million year)。
The phylogenetic tree were constructed using the protein sequences
by the Neighbor-Joining (NJ) implemented by MEGA software,
Version 6.06. The time ruler is showed at the bottom of the Figure,
and MY represents million year.

2.3 BnMET1基因结构分析
基因结构变异分析表明, 基因结构上白菜和甘
蓝 MET1 基因非常相似。每对白菜和甘蓝 MET1 直
系同源基因均含有相同数目的外显子和内含子。此
外, 除了 BrMET1-2和 BoMET1-3的基因长度具有明
显的差异外, 其余基因长度基本相同。然而, 与白菜
和甘蓝 MET1直系同源基因结构比较, BnMET1基因
结构已经发生明显的改变。BnMET1 基因外显子较
其两亲本 MET1 基因减少, 因而 BnMET1 蛋白较白
第 3期 谭河林等: 甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶 I基因的克隆及表达模式 409


菜和甘蓝 MET1分子量变小(图 3)。
根据前述蛋白进化聚类分析图 2, BrMET1-1 和
BoMET1-1基因与 BnMET1-1和 BnMET1-2相近, 为
直系同源蛋白。基因结构上, 与拟南芥 AtMET1基因
结构相近的 BrMET1-1和 BoMET1-1基因, 均具有 11
个外显子 , 10 个内含子。然而与其直系同源的
BnMET1-1 和 BnMET1-2 基因, 仅有 6 个外显子, 5
个内含子。基因结构图表明(图 3), BnMET1-1 和
BnMET1-2 基因外显子发生了突变 , 改变了基因的
mRNA拼接位点, 导致这 2个基因的外显子数目减少。

图 3 BnMET1、BrMET1、BoMET1和 AtMET1外显子和内含子结构
Fig. 3 Exon/intron structure of BnMET1, BrMET1, BoMET1, and AtMET1
结构图由在线 GSDS 2.0软件显示, 图中黑色柱状表示外显子, 黑线表示内含子, 每个基因的外显子和内含子按照序列长度比例绘制,
图底为序列长度标尺。
Black boxes denote exons within coding regions and the black lines connecting them represent introns. The length of boxes and lines
represents the size (bp) of the corresponding exon and intron, respectively, and the length ruler shows at the bottom of the figure.
The gene structures without the untranslated regions (UTRs) were constructed using the Gene Structure Display Serve tool 2.0
(GSDS, http://gsds.cbi.pku.edu.cn/).

此外, BnMET1-4和 BnMET1-5基因和与直系同
源的 BoMET1-3 和 BrMET1-3 基因之间变异较大。
BnMET1-5基因在第 2个外显子处发生了突变, 导致
相对应的 BrMET1-3 基因外显子区域变成了
BnMET1-5基因内含子区域。而 BnMET1-4基因仅具
有 BoMET1-3 基因后端 4 个外显子区段。因而 ,
BoMET1-3基因前端区段可能变成了BnMET1-4基因
的启动子区。这种改变可能导致 BnMET1-4 基因的
时空表达发生改变, 从而影响 BnMET1 基因作用的
时空模式。
上述结果表明, 油菜在进化过程中基因序列发
生了剧烈的改变, 导致源自双亲的 MET1 直系同源
基因序列及其结构发生明显的改变 , 可能影响
BnMET1基因的生物学功能及其作用方式。
2.4 MET1在组织中的差异表达
采用实时定量 PCR (qRT-PCR)检测了白菜 3 个
BrMET1旁系同源基因在白菜叶片、花蕾、7 d角果、
14 d角果和 21 d角果等器官中的表达水平。发现在
这些器官中, 3个 BrMET1旁系同源基因的相对表达
水平差异较大(图 4)。其中, BrMET1-1 是主要表达
者。BrMET1-1在叶片和 7 d角果器官中表达水平较
高 , BrMET1-2 在叶片和角果中低水平表达 , 而
BrMET1-3基本不表达。
在白菜 3个器官中, 3个 BrMET1旁系同源基因
在花蕾器官中均不表达。BrMET1在早期角果器官中
表达水平最高, 随着角果的发育, BrMET1表达水平
迅速降低, 到 14 d时, BrMET1-1表达水平降低约 10
倍, 至 21 d 时基本不表达。BrMET1 这种表达模式
与其功能相适应, 甲基化酶主要调控基因组DNA序
列的甲基化水平, 从而调控基因的表达。白菜受精
完成后, 从胚胎发育开始到胚胎逐渐形成各种组织
期间, 需要对控制胚胎早期发育相关基因进行调控,
通过 DNA 甲基化方式控制这类基因的表达是最快
速、最经济的调控方式之一。
与此相似, 3个 BoMET1旁系同源基因在叶片、
花蕾、7 d和 14 d角果等 3个器官中表达水平差异
明显(图 5), 这种差异模式与 BrMET1旁系同源基因
相似。3个 BoMET1旁系基因中, 仅有 BoMET1-2基
因在角果发育到 7 d时具高水平表达, 而 BoMET1-1
表达水平较低, BoMET1-3则不表达。在甘蓝 3个组
织中, 3个 BoMET1旁系同源基因在花蕾器官中基本
不表达, 与白菜的结果类似。BoMET1-2基因在角果
发育早期, 在 7 d 时表达水平最高, 随后迅速降低,
到角果发育 14 d时, BoMET1-2基因表达水平降低了
2 倍。在检测的 3个器官中 , 发育 7 d 的角果中
BoMET1 基因表达水平最高, 其次在叶片中, 然后
410 作 物 学 报 第 41卷


是发育 14 d 的种子, 最后是花蕾, 这种表达模式与
白菜类似。
qRT-PCR结果显示, 5个 BnMET1旁系同源基因
在不同器官的表达模式与白菜和甘蓝 MET1 直系同
源基因不同 (图 6)。 BnMET1-5 与其直系同源
BrMET1-3 基因在各自的植物器官中均不表达。与
BrMET1-3直系同源的 BoMET1-3基因在所检测的甘
蓝器官中也不表达。然而, 与 BoMET1-3直系同源的
BnMET1-4 在叶片和 14 d 角果中却被激活低水平表
达。说明 BnMET1 旁系同源基因的表达模式由于基
因组的加倍发生改变。所检测的 3个油菜器官中 ,
BnMET1-1和BnMET1-2基因在油菜叶片器官中的表
达水平最高 , 其直系同源基因 BoMET1-2 和
BrMET1-1基因, 在甘蓝和白菜叶片器官表达水平相
也对较高。另外, BnMET1-2在油菜叶片表达水平与
BrMET1-1 在白菜叶片中表达水平相近 , 但是
BoMET1-2在叶片器官表达水平较 BnMET1-1低, 说
明 BoMET1-2 基因融合到油菜基因组后其表达活性
被增强。然而在角果发育过程中 , BnMET1-1 和
BnMET1-2基因的表达水平明显较其 BoMET1-2和
BrMET1-1 基因的表达水平低。上述结果说明在油
菜生长发育过程中部分旁系同源基因被沉默或降
低表达水平 , 从而使器官中维持一定水平的基因
剂量。
在所检测的白菜和甘蓝各器官中, 角果发育 7 d
时MET1基因表达水平最高。随着角果的发育, MET1
基因表达水平急剧降低。然而在油菜角果发育过程
中, 角果发育到 7 d和 14 d时, BnMET1基因表达水
平较高, 随后表达水平才急剧降低, 说明 BnMET1
表达时间较白菜和甘蓝 MET1延长。

图 4 白菜 BrMET1器官表达谱
Fig. 4 Relative expression levels of BrMET1in diverse organs
at different developmental stages of Brassica rapa
图中数值为 3个技术重复的平均值和标准差, 内参为白菜
BrACTIN。
Each sample was analyzed by real-time PCR assay in triplicate.
Data presented are mean of three experiments. Error bars represent
standard deviations. The internal control is BrACTIN.

图 5 甘蓝 BoMET1器官表达谱
Fig. 5 Relative expression levels of BoMET1 in diverse organs
at different developmental stages of Brassica oleracea
图中数值为 3个技术重复的平均值和标准差, 内参为甘蓝
BoACTIN。
Each sample was analyzed by real-time PCR assay in triplicate.
Data presented are mean of three experiments. Error bars represent
standard deviations. The internal control is BrACTIN.

图 6 油菜 BnMET1器官表达谱
Fig. 6 Relative expression levels of BnMET1 in diverse organs
at different developmental stages of Brassica napus
图中数值为 3个技术重复的平均值和标准差, 内参为油菜
BnACTIN。
Each sample was analyzed by real-time PCR assay in triplicate.
Data presented are mean of three experiments. Error bars represent
standard deviations. The internal control is BnACTIN.
3 讨论
DNA 甲基化在植物生长和环境应激过程中起
重要作用[6], 尽管 DNA甲基化不改变基因的碱基序
列, 但能影响所修饰基因的表达, 从而改变基因行
使功能的模式[7-8]。油菜是异源多倍体油料作物, 由
白菜和甘蓝通过自然杂交加倍而成。克隆分析油菜
基因组甲基化基因对了解甲基化基因调控油菜生长
调控具有重要意义。本研究从油菜基因组中克隆到
5个 BnMET1基因, 生物信息分析发现 5个 BnMET1
基因在油菜基因组形成稳定、进化演变过程中较其
亲本白菜和甘蓝 MET1 基因已发生变异。表达模式
分析发现白菜、甘蓝和油菜的直系同源基因在相同
器官的表达模式已改变, 在所检测的器官中, 部分
同源基因在不同的器官中沉默。表明油菜 BnMET1
同源基因通过差异表达控制基因剂量, 进而影响油
菜的生长发育。
通过基因组比对和系统进化分析表明十字花科
第 3期 谭河林等: 甘蓝型油菜及其亲本物种甲基化酶 I基因的克隆及表达模式 411


植物的分化大约发生在 3800万年左右, 芸薹属植物
(包括白菜和甘蓝)大约在 1700 万年前从古老的十字
花科植物分化而来, 而白菜与甘蓝分化发生在大约
800万年前[25]。白菜和甘蓝物种分化前, 芸薹属植物
基因组已发生三倍化事件[20,23]。因而, 在白菜和甘蓝
基因组中分别具有 3 个 MET1 同源基因。白菜和甘
蓝基因组测序表明[20-21], 在白菜和甘蓝基因组中均
有 3 个 MET1 同源基因, 基因号分别是 Bra039939、
Bra030191和 Bra010026; Bol031719、Bol045816和
Bol016616。基于油菜为白菜和甘蓝杂交形成的四倍
体作物, 甘蓝型油菜基因组测序表明甘蓝型油菜基
因组中有 6 个 MET1 旁系同源基因, 即 BnaA04g
13310D、BnaC04g35390D、BnaA06g29420D、BnaC
07g27300D、BnaA09g42250D、和 BnaC08g34700D[22]。
本研究仅克隆到 5 个 BnMET1 同源基因, 未克隆到
的 BnMET1 同源基因是由于在油菜进化的过程中,
其DNA序列发生改变, 导致其不能匹配根据亲本白
菜 BrMET1 直系同源基因序列所设计的引物, 从而
无法扩增。甘蓝型油菜测序品种为欧洲栽培油菜
Darmor-bzh。中国甘蓝型油菜源自欧洲, 经国内育种
工作者转育成目前国内的栽培品种。通过 BnMET1
DNA 序列比对可以了解不同地域性的人工选育对
油菜 BnMET1选择效应。但目前 Darmor-bzh基因组
DNA 序列数据尚未释放, 不能获得 Darmor-bzh 基
因组 BnMET1 DNA序列, 无法与本研究所获得的中
双 11 BnMET1序列比较。
甘蓝型油菜演化历程较短, 约在 5000~10000年
前形成[19]。因而, 在油菜基因组其基因的变异应较
其亲本白菜和甘蓝变异小。本研究所克隆的 5个
BnMET1 基因, 蛋白序列分析表明油菜直系同源蛋
白与其亲本间的变异较小, 而白菜和甘蓝亲本基因
组中 3个旁系同源蛋白的变异却较大, 表明古老十
字花科植物基因组三倍化事件较油菜形成的时间
早。然而基因结构分析发现 BnMET1 基因结构较白
菜和甘蓝直系同源 MET1 变异大, 而白菜和甘蓝直
系同源 MET1 之间的变异却小。此外, MET1 蛋白
聚类分析也表明白菜和甘蓝 3 个 MET1 直系同源基
因间的基因结构变异较小, 由序列相似性可明显形
成同源配对关系 , 即 BoMET1-1 与 BnMET1-1,
BrMET1-1 与 BnMET1-2, BoMET1-2 与 BnMET1-3,
BoMET1-3与 BnMET1-4, BrMET1-3与 BnMET1-5。
说明油菜基因组在稳定的过程中 , 通过改变部分
BnMET1 同源基因的结构达到调控 BnMET1 同源基
因功能的作用, 从而维持油菜正常生长发育。然而,
改变后的 BnMET1 同源基因功能是否发生改变, 有
待进一步验证。本研究克隆的 BnMET1 同源基因为
后续深入分析其功能差异奠定序列基础。
拟南芥基因组中 AtMET1 仅有一个拷贝
(At5g49160), 而白菜和甘蓝基因组中均有 3 个
MET1基因, 油菜有 6个 BnMET1基因, 不难想象如
果油菜 6个 BnMET1基因同时表达, 且表达水平与
拟南芥 AtMET 相同, 那么油菜各器官中 BnMET1
基因剂量是拟南芥的 6 倍, 是白菜和甘蓝的 2 倍,
如此高剂量的 BnMET1, 必定影响油菜的正常生
长。研究表明, 多倍体植物部分同源基因以沉默或
活化的方式使同源基因差异表达, 以此方式控制组
织中同源基因的剂量水平 [24-25], 本研究利用实时
定量 PCR 结果也支持此结论。在白菜和甘蓝的组
织中 3 个 MET1 旁系同源基因, 仅有一个同源基因
在各组织器官中主要表达。在油菜中也发现同样的
现象, 所克隆的 5个油菜 BnMET1旁系同源基因中
仅有 2 个在油菜各组织中主要表达, 其余 3 个仅低
水平表达。说明油菜在基因组进化和稳定的过程中
通过改变 BnMET1 的基因结构以及旁系同源基因
的表达模式来维持油菜各组织中 BnMET1 的基因
剂量水平 , 从而保证油菜的正常生长发育。然而 ,
这种调控模式以及作用的机制及其普遍性有待进
一步研究。
4 结论
在油菜基因组中克隆到 5 个 BnMETI 旁系同源
基因。在油菜基因组进化和驯化过程中, 其基因结
构较其亲本白菜和甘蓝基因组中 MET1 直系同源基
因已发生明显的改变, 部分同源基因拼接位点突变
导致外显子数目减少, 阅读框变短, 使得蛋白分子
量相应变小。此外, BnMETI旁系同源基因在不同器
官的表达模式随着进化和驯化较亲本白菜和甘蓝发
生改变。由此可见, 油菜 BnMETI基因表达模式的改
变, 影响油菜各器官中BnMETI基因的剂量水平, 从
而影响油菜器官的形成与油菜的生长发育。
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