全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(11): 19141924 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A104, 2013AA102602), 国家自然科学基金项目(U1302266, 31401412),
111人才引智基地建设项目(B12006), 重庆市主要农作物良种创新工程项目(cstc2012ggB80008), 国家现代农业产业技术体系项目建设
专项(CARS-13), 国家科技支撑计划项目(2013BAD01B03-12)和西南大学博士基金(SWU112036)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68251950
第一作者联系方式: E-mail: lion4302@163.com; E-mail: drlukun@swu.edu.cn 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-04-14; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141008.0954.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01914
黄黑籽甘蓝型油菜类黄酮途径基因 SNP位点检测分析
曲存民 1, 卢 坤 1, 刘水燕 1 卜海东 1 付福友 2 王 瑞 1
徐新福 1 李加纳 1,*
1 西南大学重庆市油菜工程技术研究中心, 重庆 400716; 2 Agriculture and Agri-Food Canada, Saskatoon Research Centre, 107 Science
Place, S7N 02X, Saskatoon Saskatchewan, Canada
摘 要: 类黄酮物质在植物花、叶、果实和种子颜色变化的过程中起着至关重要的作用, 本研究以不同黄黑籽种皮
材料为研究对象, 采用基因同源克隆方法, 获得 17个类黄酮基因全长 ORF序列, 在核酸和蛋白水平上分别序列差异
比较表明, 这些基因在不同黄黑籽材料中共存在 41个不同拷贝成员。在核苷酸水平上 , 检测到 BnTT3、BnTT18、
BnTTG1和 BnTTG2的单核苷酸位点数目介于 16~52之间, 且 BnTTG2在 3个不同的位置上还存在多个碱基的连续性
缺失现象(119~121 bp、183~189 bp和 325~330 bp), 但在蛋白水平上仅存在 2~16个氨基酸位点差异, 说明 BnTT3、
BnTT18、BnTTG1和 BnTTG2在不同甘蓝型黄黑籽材料中存在单核苷酸位点差异, 而单核苷酸位点突变不一定导致氨
基酸位点的变异。在不同黄黑籽材料中仅 BnTT3 和 BnTT18 存在一致性的氨基酸突变位点(252 和 87), 推测 BnTT3
和 BnTT18可能在黄黑籽甘蓝型油菜种皮颜色差异形成过程中发挥至关重要的作用。通过这些位点的等位特异 PCR
可以区分材料间透明种皮基因, 为特异基因芯片的开发及阐明甘蓝型油菜种皮色泽性状的基因及其作用位点奠定
基础。
关键词: 甘蓝型油菜; 类黄酮途径; 单核苷酸位点多态性; 黄黑籽; 透明种皮基因
SNP Detection and Analysis of Genes for Flavonoid Pathway in Yellow- and
Black-Seeded Brassica napus L.
QU Cun-Min1,, LU Kun1,, LIU Shui-Yan1, BU Hai-Dong1, FU Fu-You2, WANG Rui1, XU Xin-Fu1, and LI
Jia-Na1,*
1 Chongqing Rapeseed Technology Research Center of Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Agriculture and Agri-Food Canada,
Saskatoon Research Centre, 107 Science Place, S7N 02X, Saskatoon Saskatchewan, Canada
Abstract: Flavonoids as the secondary metabolites play a crucial role in colour changing process of flower, leaf, fruit and seed. In
this research, primers for amplifying full-length ORF sequences of the genes involved in the favonoid biosynthesis pathways were
designed according to conserved nucleotide regions from the public databases. Using the homology-based cloning strategy, 41
gene copies were obtained from 13 genes using 17 pairs of specific primers in different yellow- and black-seeded seed coats of B.
napus. Each of full-length ORF sequences was sequenced and analyzed in the levels of both nucleic acid and protein. The results
showed that the SNPs in four flavonoid pathway genes (BnTT3, BnTT18, BnTTG1, and BnTTG2), ranged from 16 to 52, but there
were olny 2 to 16 amino acid mutations detected in the protein level, indicating that the mutation of SNPs may not be involved in
the mutation of amino acid. In addition, continuous bases deletion existed in different positions of sequence of BnTTG2 (119 to
121 bp, 183 to 189 bp, and 325 to 330 bp), and two consistent amino acid mutation sites were detected in BnTT3 and BnTT18
among different materials, inferring that BnTT3 and BnTT18 may play an important role in difference of seed coat colour forma-
tion in yellow- and black-seeded B. napus. Therefore, these genes involved in flavonoid pathway could be distinguished by the
allelic-specific PCR in yellow- and black-seeded B. napus. These results could help to develop specific seed coat gene chips and
第 11期 曲存民等: 黄黑籽甘蓝型油菜类黄酮途径基因 SNP位点检测分析 1915


elucidate the genes and their action sites for the seed coat colour in B. napus.
Keywords: Brassica napus L.; Flavonoid pathway; Single nucletide polymorphism (SNP); Yellow- and black-seeded; Transpa-
rent testa
油菜是世界四大油料作物(大豆、向日葵、油菜、
花生)之一, 在世界油料作物中占有重要地位[1]。国
内外大量研究表明, 在相同的遗传背景下, 黄籽油
菜具有种皮薄、木质素、纤维素和多酚含量低[2-4], 榨
取后饼粕中蛋白质含量高、纤维素和色素等有毒物
质含量低等优点[5-6]。近年来, 随着菜籽油逐渐被用
作生物柴油的原料油 [7], 且黄籽菜油比黑籽菜油更
易于合成高质量的生物柴油, 制作成本也比较低。
因此, 黄籽油菜品种的选育是油菜育种的一个重要
主攻方向。
甘蓝型油菜与其他芸薹属作物不同, 在自然界
中并不存在天然的黄籽种质资源, 其遗传模式也较
为复杂。随着分子标记技术的发展, 研究人员通过
构建遗传图谱和关联分析对甘蓝型油菜种皮色泽及
相关性状进行了 QTL定位分析, 先后报道了多个主
效 QTL 可控制性状 40%~60%变异, 并找到了一些
紧密连锁标记[3,8-13]。但由于其基因来源不同, 且存
在多基因遗传、异源四倍性、母性效应、受环境条
件等诸多因素影响[6,14]。因此, 这些连锁标记也缺乏
一定的通用性, 也就限制了在育种中的辅助选择。
目前, 高通量 SNP 芯片检测技术已在玉米、小麦、
高梁和大豆中应用[15-16], 由于油菜基因组来自于白菜
(AA)和甘蓝(CC), 含有大量的复等位基因, 油菜 SNP
分析仅针对于具体基因或转录组分析水平上[17-18]。目
前, 在拟南芥中, 已有 17个基因被克隆和验证功能,
包括 8个参与编码类黄酮途径中的一些酶类的合成
的结构基因(TT3-TT7、FLS1、LDOX 和 BAN)、6 个
在类黄酮途径中编码一些起调控作用酶类的调控基
因(TT1、TT2、TT8、TTG1、TTG2和 TT16); 3个参
与编码与色素转运和积累相关的蛋白的转录因子
(TT12、TT19 和 AHA10), 这些基因所编码的关键酶
及本身突变是造成突变体种皮颜色不同程度变异的
主要原因 [19-27]。尽管油菜与拟南芥同属十字花科 ,
亲缘关系比较近 , 其基因组编码序列的保守性达
86%[28], 但这些基因在甘蓝型油菜中具体的作用机
制尚不明确。因此, 本研究根据已知 GenBank 数据
库中类黄酮途径相关基因序列设计引物, 以不同来
源的甘蓝型油菜黄、黑籽种皮总 RNA为对象, 克隆
到类黄酮代谢途径重要相关基因的全长 ORF 序列,
比较这些基因在黄黑籽甘蓝型油菜中序列的差异 ,
寻找其单核苷酸多态性位点, 为探讨甘蓝型油菜中
苯丙烷-类黄酮途径基因的结构、功能、多态性及
与种皮色泽差异形成的关系奠定基础, 同时, 为分
析黄黑籽甘蓝型油菜控制类黄酮合成的表达差异
提供探针和引物, 可开发出能够识别透明种皮基因
来源的 SNP 标记, 并为特异基因芯片的开发及阐
明甘蓝型油菜种皮色泽性状的基因及其作用位点
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
(1)甘蓝型油菜(B. napus)重组自交系的 2个亲本,
黄籽品系 GH06 (Y1)和黑籽品系中油 821 (B1)分别具
有典型黄籽和黑籽遗传背景, GH06具有显性黄籽主
效基因[29-30], 黄籽度达到 90%, 而黑籽品系中油 821
为定向自交选择后代, 性状表现稳定; (2)选取重组
自交系中部分极端黄籽与黑籽表型材料混合分别构
成黄籽基因池 Y2与黑籽基因池 B2; (3)不同遗传来源
黄黑籽材料 L267(Y3)与 L257(B3); (4)黄黑籽近等基
因系材料 572(Y4)与 571(B4)。分别用 Y1、Y2、Y3和
Y4代表黄籽, B1、B2、B3和 B4代表黑籽。于 2012
年秋在西南大学北碚歇马试验基地种植上述材料 ,
按正常生产条件进行田间管理。在油菜盛花期从每
个株系随机选 6 株正常生长的植株标记主花序开花
时间, 青荚期分别取花后 30 d 的种皮, 用液氮冷冻
后, 置于–80℃超低温冰箱保存备用。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5α由本课题
组保存, 克隆载体 pMD19-T购自大连 TaKaRa公司。
1.2 核酸提取
用植物总 RNA 提取试剂盒(天根生化科技有限
公司, 北京)提取不同黄黑籽材料花后 30 d种皮的总
RNA, 用 DNaseI (宝生生物工程有限公司, 大连)消
化 RNA 样品中的基因组 DNA, 然后以 Oligo
dT-Adaptor Primer 反转录 [TaKaRa RNA PCR Kit
(AMV) Ver.3.0]成 cDNA后作为 PCR反应模板, 具体
操作说明见试剂盒说明书。
1.3 类黄酮途径关键基因同源克隆引物设计
从 NCBI数据库中下载公开发表的参与拟南芥、
白菜、甘蓝和甘蓝型油菜类黄酮途径相关基因的序
列, 用 Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)软件
1916 作 物 学 报 第 40卷

进行序列多重比对, 用引物设计软件 Primer Primer
5 设计特异性扩增引物, 以甘蓝型油菜(Bn)加基因
名称对引物命名(表 1), 引物均由上海英骏生物技术
有限公司合成。

表 1 基因同源克隆的引物
Table 1 Primers used in homology-based gene cloning
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5–3)
AGI登录号
AGI number
GenBank登录号
GenBank number
BnTT1
F: ATGGATTGCGGGATCTACTCAAGCT
R: TTAAAAGAGCGTTTCAGAGACAGAAGAGTATG
AT1G34790 AF190299
BnTT2
F: ATGAGAAAGAGAGAAAGTAGTAAGGTGAAG
R: CTAACAATTAAAGTCCCAGAGACAATCTTC
AT5G35550 DQ778646
BnTT3
F: ATGGTAGCTCACAAAGAGACCGTG
R: CTAAGCACAGATCTGCTGTGCC
AT5G42800 DQ767950
BnCHSA1
F: ATGGTGATGAGTAGGCCGTCATCA
R: TCAAACAGGAACGCTGTGCAAGACA
AT5G13930 DQ767948
BnCHSA2
F: ATGGTGATGTGTACACCGTCTTCG
R: TCAAACAGGAACGCTGTGCAAGACA
AT5G13930 AF076334
BnCHI-1
F: ATGTCTTCTTCCCACTGTCCAACAC
R: TCAGTTCTCTTTGGCCAACTTATCTC
AT3G55120 EU402416
BnCHI-2
F: ATGTTTTCTTCCGGCTCTCAGTTACC
R: TCATGTCTTTGTTGCATCTTCTTCGACC
AT3G55120 EU402417
BnTT6
F: ATGGCTCCAGGAACTCTAACTGAG
R: CTAAGCGATGATTTGGTCTAGAGGC
AT3G51240 DQ513329
BnTT7
F: ATGACTAATCTTTACCTCACAATCCTTCTCC
R: TTAAGCCGATCCGAGTCCGTAAG
AT5G07990 DQ324379
BnTT8
F: ATGGATGAATTAAGTATTATACCGTTATGGAAAGTG
R: CTAGAGTTTATTATTATATATGATTTGATGGATGGC
AT4G09820 EU192027
BnTT10
F: ATGTCACATCCTTTGTTCATTTACTTTCTAATCTCTC
R: TTAGTAACAAGGAGGCAAGTCAGGAG
AT5G48100 HM805059
BnTT12
F: ATGAGCTCCACAGAGACATACGAG
R: TTAGACTCCTTCGGTAGCCATCTC
AT3G59030 EU818785
BnTT15
F: ATGGCGAGTGATGTAGCTACTCATC
R: TCACACGCCCCCACATGGA
AT1G43620 BT005834
BnTT16
F: ATGGGAAGAGGGAAGAT(A/C)GAGATAAAG
R: TTAATCAACCTTGGTGATCGTTGGATCGT
AT5G23260 HM449989
BnTT18
F: ATGGTTGAAGTGGAAAGAGTCGAGAATTT
R: TCAGACTTCATCCTTTTTCTCAGTTACCAAC
AT4G22880 GQ120562
BnTT19
F: ATGGTTGTGAAACTATACGGACAGGT
R: TCAGAAACCAGCCATCTTCATAAGCTT
AT5G17220 AB117793
BnTTG1
F: ATGGACAACTCAGCTCCGGAC
R: TCAAACTCTGAGGAGCTGCATTTTG
AT5G24520 EF175930
BnTTG2
F: ATGGAGGTGAAAGAGAGTAAGAGAGTG
R: T(C/T)AAATGGCTTGATTAGAATGTTGTGGGGAGC
AT2G37260 FJ012168
BnBAN
F: ATGGCAACCGTTGATCAGACCG
R: TTAAGGTTTGATCAATCCTTTTGACTCGAAGTAC
AT1G61720 FJ938339

同源克隆的 PCR 反应体系含模板 cDNA
0.5 μL、10×TransStart Taq缓冲液 2.5 μL、2.5 mmol
L–1 dNTPs 2 μL、10 μmol L–1上下游引物各 0.5 μL、
5 U μL–1 TransStart Taq DNA 聚合酶 0.5 μL, 加
ddH2O 至 25 μL。PCR 扩增反应程序为 94℃预变性
4 min; 94℃变性 30 s, 57℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min,
35个循环; 最后 72℃延伸 10 min, 16℃保存。
1.4 基因扩增片段与 pMD19-T克隆载体连接
利用胶回收试剂盒(北京全式金生物技术有限
公司)电泳回收上述 PCR 产物, 并与 TA 克隆载体
pMD19-T (TaKaRa, 大连)连接。连接产物转化 E.
coli DH5α感受态细胞, 加 900 μL LB, 37℃复苏培养
第 11期 曲存民等: 黄黑籽甘蓝型油菜类黄酮途径基因 SNP位点检测分析 1917


90 min 后, 取 100 μL 转化产物涂布于 LB [80 μg
mL–1氨苄青霉素(AMP), 涂布 X-gal, ITPG]平板上,
37℃倒置恒温培养 12~16 h, 挑取白色单菌落, 接种
于AMP的LB液体培养基中, 37℃振荡培养 12~16 h,
PCR检测为阳性单克隆者送华大基因测序。
1.5 序列结果拼接与比对分析
序列测定由华大基因完成 , 采用 M13F/M13R
引物双向测定, 结果使用Geneious 4.8.5软件进行序
列拼接。拼接后的序列用 Clustal W (http://www.ebi.
ac.uk/clustalw/)软件在 DNA 和蛋白质水平上进行同
源性比较。
2 结果与分析
2.1 黄黑籽甘蓝型油菜中类黄酮途径基因的
SNP位点分析
分别以甘蓝型油菜黄籽 Y1~Y4与黑籽 B1~B4种
皮为材料, 采用同源克隆分析了 17个类黄酮代谢途
径基因, 并获得了其完整的 ORF序列。从每个材料
样品随机选取 5~10个阳性克隆子菌液, 经序列拼接
获得目的基因全长 ORF的序列, 同源性比较结果表
明, 大部分基因在甘蓝型油菜中均存在多个拷贝序
列 , 各基因家族成员之间也具有较高的同源性(表
2)。另外, 序列比对结果显示, 在不同材料中部分基
因家族各成员之间存在多个单核苷酸多态性位点 ,
但它们之间的特异性差异位点较少。在 4 对不同黄
黑籽材料中, 仅 BnTT3、BnTT18、BnTTG1和 BnTTG2
基因在核苷酸水平上呈现一定的规律性差异, 但部
分单核苷酸位点在不同材料间同一位点上也存在差
异性。统计结果表明, 4个基因产生的单核苷酸位点
数目介于 16~52之间, BnTT3产生单核苷酸突变位点
数目最少, 在 16个不同位置上被检测到, BnTTG2还
在 3个不同的位置上存在碱基的连续性缺失现象
(119~121 bp、183~189 bp和 325~330 bp, 表 3), 说
明在不同材料间同一基因在核苷酸水平上存在差异,
这些突变位点的存在可能会导致基因功能的变化 ,
从而影响种皮色泽, 还需要进一步的研究证实。

表 2 甘蓝型油菜类黄酮途径基因的同源克隆分析
Table 2 Analysis of gene characteristics for flavonoid biosynthesis pathway in Brassica napus
基因
Gene
序列长度
Length
同源性
Homology (%)
拷贝数
Copy number
SNP个数
Number of SNPs
氨基酸长度
Length
同源性
Homology (%)
BnBAN 1029 99.6 2 0 343 99.1
BnTT1 864 100.0 1 0 288 100.0
BnTT2 786 100.0 1 0 259 100.0
BnTT3 1158 97.7 3 16 386 99.0
BnCHSA1 1191 96.1 3 0 397 99.5
BnCHSA2 1188 96.7 3 0 396 99.2
BnCHI-1 759 98.6 2 0 253 99.0
BnCHI-2 705 99.7 2 0 235 99.6
BnTT6 1077 97.8 2 0 359 99.3
BnTT7 1536 99.1 1 0 512 100.0
BnTT8 1566 96.7 2 0 522 95.4
BnTT15 412 100.0 1 0 137 100.0
BnTT16 738 99.4 2 0 246 99.5
BnTT18 1077 98.0 3 48 359 99.2
BnTT19 642 89.5 2 0 214 89.6
BnTTG1 1014 98.2 3 35 338 99.2
BnTTG2 1263–1269 93.8 3 52 421–445 69.3
BnTT10 1692 99.1 3 0 364 99.7
BnTT12 1431 99.4 2 0 477 97.1

1918 作 物 学 报 第 40卷

表 3 黄黑籽甘蓝型油菜中类黄酮途径基因的 SNP位点
Table 3 Sites of SNPs identified between the yellow- and black-seeded B. napus in the exon region of the flavonoid gene
基因
Gene
编号
Code
SNP位点及位置 Sites of single nucletide polymorphism (bp)
90 246 255 276 282 306 332 687 699 711 726 754 774 813 928 1013 1032 1098 1109
B1 C T T A T A C G C T T A G C A G C G T
Y1 T C A T C G T C T C C G A T G A T A C
B2 C C/T T A T A C G/C T/C T/C T/C A A/G C A G – G T/C
Y2 T T/C A T C G T G C C T A/G G T G A – A C
B3 – – – – – – – – – – T A G C G/A A/G C G T/C
Y3 – – – – – – – – – – C G A T A/G G/A T A C/T
B4 C T T A T A – G T C T A G C A G C G T
BnTT3
Y4 T C A T C G – C C T C G A T G A T A C
33 42 47 51 59 120 153 259 264 315 321 356 357 381 393 408
B1 G G – T A A C G G A – – – C T G
Y1 A A – A G G T A T G – – – T C A
B2 G G – T A A C G G A – – – C T G
Y2 A A – A G G T A T G – – – T C A
B3 – – G T – – – G T/G – G G C – – A
Y3 – – A C – – – A G – T A G – – G
B4 – – G T – – – G T – G G C – T A
Y4 – – A C – – – A G – T A G – C G
432 441 465 504 600 606 609 613 627 642 645 648 654 684 699 712
B1 C T A T A T T – C A – T G C A –
Y1 T G C A T G C – T C – C A G C –
B2 C T A T A T T – C A – T G C A –
Y2 T G C A T G C – T C – C A G C –
B3 T/C – – – – – – T T A C – – – – –
Y3 C – – – – – – A G C T – – – – –
B4 T – – – – – – T – A C T G – – C
Y4 C – – – – – – A – C T C A – – T
744 753 756 772 810 825 837 840 845 879 930 948 954 1029 1035 1036
B1 C – – – – – – – – T – – G – – –
Y1 T – – – – – – – – C – – T – – –
B2 C – – – – – – – – T – – G – – –
Y2 T – – – – – – – – C – – T – – –
B3 – – – – – – T C G T T G – T C A
Y3 – – – – – – C T A C A A – C T G
B4 – G C A T A T C G T T G – T C A
BnTT18
Y4 – T T G C G C T A C A A – C T G
24 63 69 78 129 195 243 270 348 354 417 558 685 696 726 735 756 762
B1 T G – G – A – G A C G G – – – C – –
Y1 C T – C – G – C C T C C – – – T – –
B2 – – C – – – C – – – – G A G G – T G
Y2 – – G – – – T – – – – C C C C – G C
B3 T G G G G A – G A C G – – – C C G C
BnTTG1
Y3 C T C C A G – C C T C – – – G T T G
第 11期 曲存民等: 黄黑籽甘蓝型油菜类黄酮途径基因 SNP位点检测分析 1919


(续表 3)
基因
Gene
编号
Code
SNP位点及位置 Sites of single nucletide polymorphism (bp)
24 63 69 78 129 195 243 270 348 354 417 558 685 696 726 735 756 762
B4 T G G G G A T G A C G G – – – C – –
Y4 C T C C A G C C C T C C – – – T – –
768 771 772 792 801 807 840 885 903 904 905 906 940 951 952 957 958
B1 T A A C G G – – G T C A T G G T C
Y1 G G C T T C – – T A T G C T T G T
B2 – – – – – – – A G T – A – – – – –
Y2 – – – – – – – G C A – G – – – – –
B3 T A A C G G – – – – – – – – – – –
Y3 G G C T T C – – – – – – – – – – –
B4 T A A C G G G – G T – A T G G T C
BnTTG1
Y4 C G C T T C T – T A – G C T T G T
68 85 112 119–121 135 168 171 177 183–189 237 239 261 264 291 303 309 325–330
B1 A/G G/A T CCC T/C A G G ------ T A T A C C/T C CTTCAG
Y1 G A C --- C G A A GGCAGC C T C T T T T
------/CTTC
AG
B2 A G – – T – – – – – – – – C –
Y2 G A – – C – – – GGCAGC – – – – T –
B3 – – – CCC – – – – – – – – – – – CTTCAG
Y3 – – – ---/CCC – – – – – – – – – – –
------/CTTC
AG
B4 – – T CCC – A G G – T A T A C – C CTTCAG
Y4 – – C --- – G A A – C T C T T – T
------/CTTC
AG
339 377 414 471 537 609 624 639 672 681 706 718 742 755 758 777 807
B1 C C/G T/C A/G C A/G C/T T A T/C C C/T T A/G T C/T G/A
Y1 T G C G T G T C G C G T C A A T A
B2 – C T G – A – – – T – – – A – C –
Y2 – G C A – G – – – C – – – G – T –
B3 – – – – – – – – A T C – T – T C –
Y3 – – – – – – – – G C A – C – A T –
B4 C – – A C – – T A – C – T G T – –
Y4 T – – G T – – C G – A – C A A – –
822 840 853 860 864 867 873 1044 1059 1062 1077 1083 1122 1143 1203 1239 1242 1243
B1 G T/A A/G A/G G A/G G G G/A C/G G A/G T/A G/T G C/G T/C A/C
Y1 C A G G A G T A A G A A T G A C C C
B2 – A A A – A – – G C – A T G – C C C
Y2 – T G G – G – – A G – G A T – G T A
B3 G T A A G A G G G C G – – – – – – –
Y3 C A G G A G T A A G G/A – – – – – – –
B4 G – – – G – G G – – G G A T – G T A
BnTTG2
Y4 C – – – A – T A – – A A T G – C C C
–: 碱基无差异; ---: 3个碱基缺失; ------: 6个碱基缺失。
–: no base differences; ---: three consecutive bases deletion; ------: six consecutive bases deletion.
1920 作 物 学 报 第 40卷

2.2 甘蓝型油菜中类黄酮途径基因的氨基酸位
点分析
将获得的目的基因全长 ORF 序列用 Geneious
4.8.5软件翻译为氨基酸序列, 同源性比较结果表明,
在不同材料间, 4 个基因仅存在 2~16 个氨基酸位点
的差异(表 4), 其蛋白水平上差异远小于其对应的核
苷酸水平上的差异, 说明基因中单核苷酸位点突变
并不一定导致氨基酸位点的差异, 即对基因的功能
不起决定性作用。另外, 在不同材料间, 2个结构基
因 BnTT3 和 BnTT18 在同一位置上还存在一致性的
突变位点(252 和 87, 表 4), 在黑籽材料中氨基酸为
缬氨酸(V), 黄籽中为异亮氨酸(I), 而剩余的所有位
点在 4 组材料中均未能同时被检测到, 说明在不同
材料中同一基因在蛋白水平上也存在一定的差异性,
而 2 个结构基因 BnTT3 和 BnTT18 可能直接参与调
控甘蓝型油菜种皮色泽的变化, 且受材料遗传背景
的影响较小, 但具体功能及作用机制仍需要进一步
深入研究。

表 4 黄黑籽甘蓝型油菜中类黄酮途径基因的氨基酸突变位点
Table 4 Sites of amino acid identified between the yellow- and black-seeded B. napus in the exon region of the flavonoid gene
BnTT3 BnTT18 BnTTG1 编号
Code 111 252 310 338 370 16 20 87 104 119 200 258 282 310 346 302 318
B1 M V D K A – K V – – K – – – – S A
Y1 T I N R V – R I – – N – – – – M S
B2 M V D K A/V – K V – – K – – – – L –
Y2 T I/V N R V – R I – – N – – – – M –
B3 M V – – – S – V – S – – R D K – –
Y3 T I – – – N – I – K – – K E E – –
B4 – V – – A S – V S S K I R D K L A
Y4 – I – – V N – I G K N V K E E M S
BnTTG2 编号
Code 23 29 38 59–60 80 108–109 126 236 240 248 252 253 274 285 287 416
B1 N/S D/N S --/AA D ML A/G R P/S S Y/C F E I/V K/R T/P
Y1 S N – AA V --/ML G G S P Y Y D V R P
B2 N D – -- – --/ML A – – – Y – – I K P
Y2 S N – AA – ML G – – – C – – V R T/P
B3 N D S – – ML – – – S - F E I K –
Y3 N/S D/N -/S – – --/ML – – – S/P - Y/F D/E I/V K/R –
B4 – – S – D – – – – S C F E – – T
Y4 – – – – V – – – – P Y Y D – – T/P
–: 氨基酸位点无差异; –/: 缺失 1个氨基酸位点; --/: 缺失 2个氨基酸位点。
–: no differences among the sites of amino acid; –/: one site of amino acid deletion; --/: two sites of amino acid deletion.

3 讨论
利用近缘种基因序列进行同源基因克隆是基因
克隆的一条重要有效途径。拟南芥作为模式植物 ,
与芸薹属作物同属于十字花科, 亲缘关系较为接近,
因此其完整的基因组信息、较短的生育周期和成熟
的遗传转化体系, 对芸薹属作物复杂的多倍化、基
因组特征结构及可能的遗传进化过程的研究具有重
要理论指导意义。另外, 根据 GenBank 数据库检索
结果发现在模式植物拟南芥中参与类黄酮途径的基
因仅存在1个拷贝 , 而由于甘蓝型油菜是由白菜和
甘蓝杂交、加倍形成的异源四倍体, 含有 A 和 C 染
色体组 , 推断每个同源基因至少应存在2个或更多
个拷贝, 且已有的研究结果表明, 在甘蓝型油菜中
BAN 基因存在4个拷贝[31], TT2基因只有3个拷贝[32],
而 TT3与 TT12只有2个拷贝[33-34], TT1、TT4和 TT5至
少存在4个以上拷贝等[35], 因此, 试验中根据数据库
中已知基因的序列信息分别设计了1~2对引物对其
进行同源克隆分析, 通过比对结果分析发现所克隆
的17个基因至少存在1~3个拷贝(表2), 本研究尽管
未能获得所有基因整个基因家族成员, 但在一定程
度上反映出甘蓝型油菜基因组中基因及其家族成员
第 11期 曲存民等: 黄黑籽甘蓝型油菜类黄酮途径基因 SNP位点检测分析 1921


的复杂性。另外, 本研究所检测到的 SNP 位点在不
同黄黑籽材料中存在一些差异, 在一定程度上反映
出拟南芥透明种皮基因在甘蓝型油菜不同材料间会
存在特异性差异位点。严明理等[36]以黄黑籽芥菜型
油菜为材料, 在 TT1基因中发现8个单核苷酸位点,
而本研究在不同黄黑籽甘蓝型油菜中并未重复检测
到 TT1基因单核苷酸突变位点, 说明这些基因在不
同物种间存在核苷酸序列的差异, 这些差异可能在
一定程度上影响了甘蓝型油菜种皮颜色。本研究获
得的 SNP位点可以通过等位特异 PCR来区分不同材
料及种群中的透明种皮基因, 对深入研究揭示其分
子机制也具有重要意义。
在模式植物拟南芥中, 研究学者对种皮发育解
剖结构及色素生物合成的代谢途径研究表明, 一些
编码类黄酮生物合成的关键酶和蛋白质基因的突变
致使植物体内类黄酮次生代谢物质或终产物的积累
量发生变化, 从而引起种皮颜色不同程度的变异。
现已经鉴定出 23个 TT位点, 其中包括 12个编码参
与类黄酮生物合成的酶的结构基因位点, 6个编码控
制类黄酮生物合成的调控基因位点以及 5 个未知的
基因位点[37]。在甘蓝型油菜中, 很多苯丙烷-类黄酮
途径基因也陆续被克隆并进行了相关研究[31-33,38-40]。
付福友等[12]通过对主效 QTL 侧翼引物的 BLASTn
序列比对, 认为该 QTL主效区间与拟南芥第 5染色
体的部分区段同源, 该区域包含 TT10 基因, 推测是
该 QTL的重要候选基因。Zhang等[41]通过反义抑制
对BnTT10基因的功能鉴定证明, TT10基因影响甘蓝
型油菜的种皮着色 , 与种皮色素的形成有关 , Chai
等[34]研究认为黄籽性状的形成可能与 TT12 基因相
关。最近研究分析认为在白菜型油菜中, TTG1基因
与多毛和粒色性状的形成有关[42], 而 BrTT8 则主要
调控种皮中原花青素的累积, 参与调控类黄酮途径
后期基因的表达, 自身转座子导致 BrTT8 功能缺失
可能是引起黄籽的主要原因[43]; 而在芥菜型油菜中,
TT8基因 2个成员(BjuA.TT8和 BjuB.TT8)与种皮颜色
呈高度共分离, 在黄籽中能够抑制后期合成基因的
转录[44]; 而在甘蓝型油菜中, 通过标记连锁分析发
现透明种皮基因 AHA10位于主效QTL区间, 对种皮
颜色和木质素合成可能有重要作用[45], 但上述研究
尚未确定这些基因在甘蓝型油菜主要网络调控代谢
途径中作用节点与调控机制, 也不能揭示种皮色泽
与基因间具体的调控关系。本研究同时对类黄酮途
径中 17个基因同源克隆及比较分析表明, 在获得的
BnTT8、BnTT10 和 BnTT12 基因的 2~3 个成员中并
没有检测到核苷酸序列与对应的氨基酸序列特异性
差异位点的存在, 说明这些基因可能不是引起黄黑
籽差异的源头基因。然而在 2个结构基因(BnTT3和
BnTT18)与 2个调控基因(BnTTG1和 BnTTG2)的拷贝
中普遍存在单核苷酸位点的突变现象, 且在拟南芥
中, TT3主要编码 DFR, 其突变体主要阻断种皮中花
青素和原花色素的合成, 从而形成透明种皮。另外,
在埃塞俄比亚芥的叶片和种皮[46]、番茄种子[47]和水稻
胚乳[48]中, TT3基因均为颜色形成的关键基因, 且在
芥菜型油菜中, TT3和 TT18是参与种皮色泽性状遗
传调控网络中的关键基因[36], 另外, 在类黄酮-原花
青素途径中, TTG1 和 TTG2 基因不仅参与调控种皮
颜色的转变, 还与植株表面毛状体的发育有关[42,49];
且 TTG2 基因是 WRKY 类型的转录因子, 唯一一个
参与类黄酮途径调控的WRKY家族成员, 能够影响
下游的 TTG1 基因[49-50]; 而 TTG2 在类黄酮-原花青
素途径中也要受到 TTG1-TT2-TT8的调控[51-52]。在甘
蓝型油菜中, 最初的研究结果认为色素化合物及相
关酶类是影响甘蓝型油菜种子发育过程中色泽变化
重要的影响因子, 原花色素、多酚和木质素等也是影
响种皮颜色的重要物质组分[33,53-55]。本研究重点讨论
的 4个基因中所有 SNP突变并未全部导致氨基酸水
平上的差异 , 且在不同材料间也存在一定的差异 ,
在不同材料间, 同一位置上仅BnTT3和BnTT18存在
一致性的突变位点(252 和 87, 表 4), 在黑籽材料中
的氨基酸为缬氨酸(V), 而黄籽中为异亮氨酸(I), 而
剩余位点在 4 组材料中均未能同时被检测到差异,
说明同一基因编码的氨基酸在不同材料中也存在差
异性, 从而导致材料的差异性。本研究获得的单核
苷酸多态性位点有助于透明种皮基因来源的 SNP标
记的开发, 为甘蓝型油菜特异基因芯片的开发及研
究类黄酮途径基因在种皮色泽差异形成中的结构、
功能奠定了基础。
4 结论
甘蓝型油菜与芸薹属其他油菜中透明种皮基因
位点存在差异 , 且不同来源黄黑籽甘蓝型油菜的
BnTT3、BnTT18、BnTTG1和 BnTTG2基因中检测到
多个单核苷酸差异位点 , 在同一位置上 BnTT3和
BnTT18还存在一致性的氨基酸差异位点, 可能导致
这2个基因在黄黑籽甘蓝型油菜种皮差异形成过程
中发挥至关重要的作用。
1922 作 物 学 报 第 40卷

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