全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(2): 360367 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项基金(CARS-07)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 郭二虎, E-mail: guoerhu2003@yahoo.com.cn; 刁现民, E-mail: xmdiao@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: zhaojf074@yahoo.com.cn **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-06-18; Accepted(接受日期): 2012-10-09; Published online(网络出版日期): 2013-01-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130109.1535.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00360
谷子 CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析
赵晋锋 1,** 余爱丽 1,** 田 岗 1 杜艳伟 1 郭二虎 1,* 刁现民 2,*
1 山西省农业科学院谷子研究所, 山西长治 046011; 2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: CBL/CIPK信号网络系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴
定出 7个候选 CBL基因, 命名为 SiCBL1~SiCBL7。分析表明谷子 CBL基因在蛋白质序列和结构上非常保守, 所有预
测 SiCBL 基因都含有 7~8 个内含子, 而且其外显子序列同源性很高并且大部分外显子含有相同的碱基数目。预测
SiCBL基因均含有 4个 EF-Hand功能域而且相邻 EF-Hand功能域之间的氨基酸数目非常保守。进化和聚类分析结果
表明, CBL基因在陆生植物早期的进化过程中就已经存在, 所有 CBL基因被分为 4个亚组。7个候选 SiCBL基因中, 4
个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3和 SiCBL5)受干旱胁迫诱导表达, 3个(SiCBL1、SiCBL3和 SiCBL7)受高盐胁迫诱导
表达。SiCBL3 基因在干旱胁迫下被强烈诱导可能意味着其在干旱应答中起重要作用。本文报道的谷子 CBL 基因丰
富和完善了植物 CBL成员, 为进一步研究 CBL/CIPK网络系统在抗逆作物谷子逆境响应中的功能、机制奠定了基础。
关键词: 谷子; CBL基因; 干旱; 盐
Identification of CBL Genes from Foxtail Millet (Setaria italica [L.] Beauv. )
and Its Expression under Drought and Salt Stresses
ZHAO Jin-Feng1,**, YU Ai-Li1,**, TIAN Gang1, DU Yan-Wei1, GUO Er-Hu1,*, and DIAO Xian-Min2,*
1 Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Science, Changzhi 046011, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: CBL/CIPK signal network system plays an important role in plant stress response. In this study, we identified seven
candidate CBL genes designated as SiCBL1–7 from foxtail millet (Setaria italica [L.] Beauv.) genome using bioinformatics meth-
ods. The distributions of the predicted foxtail millet CBL genes were uneven in the nine chromosomes. Sequence analysis showed
that the protein sequences and structure of foxtail millet CBL genes were very conservative. All the putative CBL genes contained
7–8 introns. Most exons of those SiCBL genes contained the same base number and shared highly similar sequence identity. All
foxtail millet CBL genes consisted of four EF-Hand functional domains and the distance between the EF-hand motifs was conser-
vative. Evolutionary analysis revealed that the CBL genes existed in the early evolutionary stage of terrestrial plants and all CBL
genes were divided into four subgroups. The expression patterns of those SiCBL genes under drought and salt stresses, were dis-
played by RT-PCR and the results showed that four SiCBL genes (SiCBL1, SiCBL2, SiCBL3, and SiCBL5) were strongly induced
by drought and three SiCBL genes (SiCBL1, SiCBL3, and SiCBL7) were induced by salt stress. SiCBL3 maybe takes an important
role in foxtail millet under drought because of its constitutive high level expression. Foxtail millet CBL genes reported in this
study would enrich CBL members in plant kingdom and lay a foundation for studying the function and mechanisms of the
CBL/CIPK network system response to stresses.
Keywords: Foxtail millet; Calcineurin B-Like proteins gene; Drought; Salt
植物在生长过程中经常会遇到干旱、洪涝、盐渍、
低温、高温以及病虫害侵染等非生物逆境胁迫, 其中干
旱、盐渍、低温对植物的影响尤为突出, 成为影响植物生
长发育和农作物产量的主要限制因子, 全球作物因此严
重减产[1]。随着全球气候变暖和水资源的日益匮乏, 国内
外有关逆境胁迫与抗逆性机制及其应用研究日益受到重
视。解析作物对逆境的适应调节机制, 培育高效抗逆的作
物新品种, 充分发挥抗逆作物的增产潜力是一条经济有
效的途径。
谷子[Setaria italica (L.) Beauv.]起源于中国, 是一些
第 2期 赵晋锋等: 谷子 CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析 361
温带、亚热带和热带的干旱和半干旱地区种植的重要区域
性粮食作物和饲草作物[2]。谷子是二倍体(2n=2x=18)、自
花授粉、C4光合途径的禾本科作物, 具有抗旱、耐瘠、适
应性广等特点。而且谷子基因组小(约 490 Mb), DNA重复
度低(30%), 高度保守稳定, 非常适合作为抗逆遗传和分
子生物学研究的模式作物[3-4]。近年来随着分子生物学的
飞速发展, 国内外已完成谷子全基因组测序并公布其序
列[5-6], 为充分了解谷子的逆境应答和分子调控机制提供
了更为广阔的平台。因此发掘谷子耐逆境相关基因, 从分
子水平上阐明谷子抗逆性的遗传基础及其生理机制, 对
通过基因工程技术重组抗逆基因, 培育谷子和其他作物
的抗逆新品种具有重要的理论意义和广泛的应用前景。
Ca2+是植物细胞信号转导的第二信使 , 几乎介导了植物
生长发育的所有生理生化过程[7]。在逆境胁迫条件下, 植
物细胞质内钙离子浓度会出现特异性时空变化, 而钙离
子感应蛋白可以感应细胞内 Ca2+浓度的时空变化, 把钙
信号以特定方式传递, 启动细胞内一系列生物化学反应
使植物适应或抵制各种逆境胁迫 [8]。CBL (calcineurin
B-like proteins)是植物中最近发现的一类 Ca2+感应蛋白[9],
CBL及其靶蛋白 CIPK (CBL-interacting protein kinase)构
成 CBL/CIPK 信号网络系统, 在植物对干旱、盐渍、低
温等逆境胁迫应答中起重要作用[10]。CBL 的功能研究主
要集中在模式作物拟南芥上, 在水稻、玉米、棉花以及杨
树等植物上也有少量报道[11-22]。拟南芥 AtSOS3/CBL4是
CBL 家族的一个成员 , 它的靶蛋白是 AtCIPK24/SOS2,
生化分析和遗传学研究表明这 2个蛋白结合后以复合
体的形式在同一个盐胁迫系统中起作用[11-12]。最近水稻
中的 SOS 信号途径也被揭示 , 并且证明 OsCBL4 和
OsCIPK24 具有与拟南芥中 SOS 途径相似的功能 [13]。
AtCBL1 和 AtCBL9 被证明在拟南芥响应低钾胁迫的一条
K+信号途径中起调节作用, 其靶蛋白 AtCIPK23 可以与
CBL1 或 CBL9 互作而被激活, CBL1/CIPK23 和 CBL9/
CIPK23复合体使钾离子转运蛋白 AKT1磷酸化从而调控
植物在低钾状态下 K+吸收和转运[14]。AtCBL1是逆境应答
基因的一个上游调控因子, 但 AtCBL1的表达并不受ABA
的诱导[15-16]。AtCBL9的表达不仅受干旱、低温和盐的诱
导, 也受 ABA 的强烈诱导, AtCBL9 在 ABA 信号途径和
ABA 合成途径中作为一个负调节因子和共有信号原件而
起作用, 而且主要在幼苗期参与拟南芥对逆境的胁迫应
答[17]。玉米 ZmCBL4 被证明在盐胁迫信号途径中具有调
节作用, 可以显著提高转基因拟南芥的耐盐性[18]。豌豆中
的一个 PsCIPK 基因和与之互作的 PsCBL 基因已被克隆,
盐、低温、机械损伤、Ca2+和水杨酸处理都可以使这 2个
基因转录水平提高, 但对于干旱和 ABA 处理其表达变化
却不明显[19]。夏新莉等研究不同非生物逆境下胡杨中的
CBL基因的转录水平表明, PeCBL1、PeCBL2、PeCBL3、
PeCBL4、PeCBL5、PeCBL9和 PeCBL10在相应的外界刺
激与胁迫应答中起很重要的作用[20]。陆地棉中的 GhCBL2
和 GhCBL3 在调节棉纤维的伸长方面起重要作用[21]; 水
稻OsCBL2与大麦HvCBL2特异地在籽粒糊粉细胞的糊粉
体中表达, 其表达受 GA诱导上调; 这 2个基因在大麦中
反义表达可以抑制糊粉细胞中糊粉体的形成, 表明其在
糊粉体的形成中具有正调节作用 [22]。截至目前, 虽然对
CBL 基因的功能研究并不多, 但却揭示了 CBL 基因在植
物信号转导, 尤其是逆境信号转导中起重要作用。
目前在双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水
稻以及玉米、拟南芥、高粱、棉花、杨树、豆类等植物基
因组中都发现了 CBL 多基因家族[23], 但在抗逆典型作物
谷子中尚无 CBL 相关报道。本文利用生物信息学方法从
谷子基因组中鉴定候选 CBL 基因, 并系统分析其结构、
分布、蛋白序列特征和进化关系, 及该基因家族在干旱、
高盐胁迫下不同时间点的表达情况, 旨在为进一步探讨
CBL基因在谷子逆境响应中的功能和机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以豫谷 1 号为材料, 在幼苗生长至三叶期时, 按照
Shinozaki 描述的方法[24]分别进行干旱、高盐(250 mmol
L–1 NaCl)胁迫处理, 分别在处理 0、1、3、6、12和 24 h
取样, 设 2 次生物学重复, 取样后立即在–80℃冰箱中速
冻所有材料, 准备提取 RNA。
试验所用 TRIzol 试剂购自生工生物工程(上海)有限
公司; 逆转录酶、LA Taq DNA聚合酶和 RNA酶抑制剂
购自宝生物工程有限公司; 引物由生工生物工程(上海)有限
公司合成; 其他试剂购自生工生物工程(上海)有限公司。
1.2 SiCBL基因鉴定和参数分析
利用水稻和高粱中已鉴定 CBL基因(从 NCBI蛋白数
据库中获得 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)序列, 在
JGI (joint genome institute)公布的谷子 8.3X Version2.1数
据库中比对 , 搜索可能的 CBL 同源基因 , 然后再利用
InterProScan搜索谷子中同源 CBL基因的结构特征域, 把
含有 Calcineurin B 结构域 (IPR015757)和 2 个或 3 个
EF-hand 典型特征序列(结构域 PF00036)的谷子同源 CBL
基因确定为谷子候选 CBL 基因。通过这种方法共确定了
7个候选谷子 CBL基因。利用 ClustalX1.83对候选基因序
列比对分析, 利用 Mega4.1 软件构建不同物种 CBL 基因
进化树并比较分析[25]。
1.3 植物总 RNA的提取和引物设计
参照 TRIzol 试剂盒使用说明用 TRIzol 试剂提取干
旱、高盐胁迫处理材料总 RNA, 参照《分子克隆》第 3
版配制其他所需试剂[26]。根据 SiCBL、GAPDH转录序列,
用软件 Primer Primer 5.0设计 SiCBL、SiGAPDH的半定量
PCR特异性引物。
1.4 半定量 RT-PCR分析
用半定量 RT-PCR 检测 SiCBL 基因在干旱、盐胁迫
下的表达。用分光光度计定量测定每个样品总 RNA的浓
362 作 物 学 报 第 39卷
度和质量。总 RNA经反转录后对 PCR条件进行预实验和
优化, 以谷子持家基因 3-磷酸甘油醛脱氢酶的(glycerol-
dehyde-3-phosphate dehydrogenase) GAPB 亚 基 基 因
(Si035707m)为 RT-PCR对照。反应产物(15 μL)经琼脂糖
凝胶电泳分离。
2 结果与分析
2.1 谷子 SiCBL基因鉴定及参数分析
按照方法 1.2 从谷子基因组中鉴定了 7 个候选 CBL
基因 , 根据与高粱 CBL 基因的同源性暂时命名为
SiCBL1~SiCBL7。由表 1 可知, 谷子 CBLs 基因在谷子基
因组内呈不均匀分布, SiCBL1和 SiCBL2分别位于第 9和
第 7染色体; SiCBL3、SiCBL5位于第 3染色体; SiCBL4、
SiCBL6、SiCBL7 在第 5 染色体上。基因组序列分析表明
谷子 CBL 基因非常保守, 它们的编码区序列大小差异在
211~319 氨基酸之间 ; 而基因组序列长度差异明显 , 在
1.84~8.67 kb 之间, 最大的 SiCBL1 达 8671 bp, 最小的
SiCBL5 只有 1842 bp。预测谷子 CBL 基因所编码的蛋白
质分子量大部分在 25 kD左右, SiCBL7较大, 为 36.58 kD,
SiCBL5较小, 为 23.70 kD; 预测谷子 CBL基因所编码的
蛋白质等电点大部分在 4.6左右, SiCBL6、SiCBL7较大,
分别为 5.09和 5.27。
表 1 预测谷子 CBL基因参数
Table 1 Parameters of predicted foxtail millet CBL genes
基因
Gene
基因 ID
Gene ID
PAC克隆 ID
PAC ID
染色体
Chr.
染色体位置
Chr. location
基因长度
Gene length
(bp)
内含子数
Intron
number
氨基酸数
No. of
amino acids
分子量
MW
(kD)
等电点
pI
SiCBL1 Si037393m 19685436 9 11050067–11058738 8671 7 225 25.83 4.55
SiCBL2 Si011012m 19695153 7 33686148–33691097 4949 8 222 25.61 4.57
SiCBL3 Si023163m 19702025 3 47858858–47863509 4651 7 225 25.88 4.61
SiCBL4 Si002829m 19678704 5 27353422–27356974 3552 8 222 25.25 4.61
SiCBL5 Si023239m 19697863 3 12252958–12254800 1842 7 211 23.70 4.55
SiCBL6 Si004544m 19674750 5 34928395–34931545 3150 7 246 27.85 5.09
SiCBL7 Si002269m 19678333 5 32189444–32192113 2669 8 319 36.58 5.27
2.2 谷子 SiCBL家族基因序列特征
SiCBL序列之间相似性在 26%~63%之间。在 ExPASy
网站对 SiCBL氨基酸功能域进行分析, 发现 SiCBL1~7都
含有 4 个 EF-Hand 功能域, 后 3 个为典型的 EF-Hand 功
能域(图 1), 而且 EF-hand 功能域之间的距离非常恒定,
EF1和 EF2之间有 23个氨基酸, EF2和 EF3之间有 25个
氨基酸, EF3和 EF4之间有 32个氨基酸。SiCBL编码序列
与基因组序列比较分析发现 SiCBL 候选基因含在 7~8 个
左右内含子, SiCBL1、SiCBL3、SiCBL5和 SiCBL6基因编
码区含有 7个内含子, SiCBL2、SiCBL4和 SiCBL7基因含
有 8个内含子, 其中 SiCBL2和 SiCBL4是在 N端 5-UTR
内增加了一个内含子, 而 SiCBL7 是在 N 端非保守的第 1
和第 2个外显子中间多了一个内含子。另外还发现大多数
SiCBL基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3、SiCBL4、SiCBL5
和 SiCBL7)内含子位置是非常保守的, 除了前面 1~2个外
显子和最后一个外显子外, 其他内含子之间的外显子碱
基数也是恒定不变的, 如图 2 所示, A、B、C、D、E、F
处外显子碱基数分别为 83、60、109、53、81和 113 bp。
而 SiCBL6中只有 C、D、E处外显子保持不变, 其他位置
的外显子已发生了变化。另外, SiCBL1、SiCBL14、SiCBL15
在 N 端含有在蛋白互作和蛋白与膜附着方面起重要作用
的豆蔻酰化位点(MGXXXS/T) [5], 其他 4个谷子CBL基因
蛋白序列中未发现豆蔻酰化位点。
2.3 谷子 SiCBL家族基因的聚类分析
为分析 CBL 基因家族的进化历史, 在 TIGR Plant
Transcript Assemblities 数据库中检索了火炬松 (Pinus
taeda)和苔藓(Physcomitrella patens)中的 CBL同源序列。
在代表被子植物的火炬松中检索到 5个 CBL同源序列,
在代表最早的陆生植物苔藓中检索到 3个 CBL同源序列。
基于拟南芥、水稻、玉米、高粱、谷子、火炬松和苔藓
CBL 序列构建进化树(图 3)表明, 所有 CBL 基因被分为 4
组。谷子的所有 CBL 基因被划分在 3 个不同的类群中, I
组中包含 SiCBL6和 SiCBL7; II组中包含 SiCBL1、SiCBL2、
SiCBL3; IV组中包含 SiCBL4和 SiCBL5。另外还发现在 4
组 CBL 中均存在明显的垂直同源基因对(I 组: ZmCBL10
和 SbCBL7, SiCBL6和 SbCBL6; II组: SiCBL2和 ZmCBL6;
SiCBL3和 ZmCBL2; OsCBL3和 ZmCBL3; III组: ZmCBL1
和 SbCBL1; IV组: SiCBL5和 SbCBL8, ZmCBL5和 SbCBL4);
在 II、III、IV组中还分别存在平行同源基因对(II组: Pp1
和 Pp3, Pt3和 Pt5, AtCBL2和 AtCBL3; III组: AtCBL1和
AtCBL9; IV组: OsCBL7和 OsCBL8; ZmCBL4和 ZmCBL8;
AtCBL4和 AtCBL8)。
2.4 谷子总 RNA提取和 RT-PCR预实验
豫谷 1 号幼苗生长至三叶一心期时对其进行干旱和
高盐(250 mmol L–1 NaCl)胁迫处理。取不同时间处理的谷
子材料用 TRIzol 方法提取总 RNA, 提取总 RNA 电泳结
第 2期 赵晋锋等: 谷子 CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析 363
图 1 SiCBL与其他已知 CBL基因氨基酸序列比对
Fig. 1 Sequences alignment of SiCBL and other known CBL genes amino acids
相同氨基酸残基用黑色表示, 相似氨基酸残基用灰色表示(≥60% similarity); MS 代表 N端豆蔻酰化序列。
The amino acids with an entire homology are shown by a black background, and those shared non-identical conserved identity by a gray background.
(≥ 60% similarity); MS represents the N-terminal myristoylation sequence.
图 2 SiCBLs基因内含子-外显子结构
Fig. 2 Intron-exon structure of the millet CBL genes
黑色方框代表保守外显子, 渐变黑色方框代表保守型较差外显子, 白色方框代表 5或 3端非翻译区, 黑色线条代表内含子。
A、B、C、D、E和 F分别代表 6个保守外显子。
The black boxes represent conservative exons, gradient black boxes represent exons in the less conservative, white boxes represent 5 or 3 untranslated
region, the black lines represent introns. A, B, C, D, E, and F represent six conserved exons.
果表明 RNA提取质量较好(图 4), 可以满足下步试验需
求。所有样品总 RNA经反转录后进行 PCR预实验, 根据
预实验中每个基因 PCR 产物的线性增长范围对反应体系
进行优化最终确定循环数 26, 反应体积 25 μL, 具体 PCR
反应程序为: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ (不同基因退火
温度不同), 30 s, 72℃ 30 s, 26个循环; 72℃ 5 min。
2.5 谷子 SiCBL家族基因在干旱胁迫下的表达
通过半定量 RT-PCR 对 7 个谷子候选 CBL 基因在干
旱胁迫下的表达情况分析表明, 在干旱胁迫处理条件下
表达量明显增加的有 4个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3
364 作 物 学 报 第 39卷
图 3 拟南芥、水稻、玉米、谷子、高粱、火炬松和苔藓 CBL基因亲缘关系
Fig. 3 Phylogenetic relationships of CBL genes in Arabidopsis, rice, maize, millet, sorghum, loblolly pine, and moss
图 4 豫谷 1号在干旱、盐(250 mmol L–1 NaCl)胁迫下不同时间点
总 RNA提取
Fig. 4 Total RNA extraction at different time points in Yugu 1
under drought and salt stresses(250 mmol L–1 NaCl)
和 SiCBL5), 如图 5-A 所示, SiCBL1、SiCBL2 和 SiCBL5
在干旱胁迫下, 表达量在 1 h就有明显增加, 在以后时间
点逐渐增加, 分别在 12、3和 3 h时间点达到最大值, 然
后表达量逐渐下降。SiCBL3在 1 h表达量明显增加, 在以
后时间点逐渐增加, 在 24 h 达到最大值, 且持续高表达,
意味着该基因可能在谷子抗旱方面有着重要作用。
2.6 谷子 SiCBL家族基因在盐胁迫下的表达
半定量 RT-PCR结果表明在 250 mmol L–1 NaCl处理
胁迫条件下, 7个候选谷子 SiCBL基因中有 3个(SiCBL1、
SiCBL3 和 SiCBL7)表达量被盐胁迫明显诱导。如图 5-B
所示, SiCBL1在 1 h表达量没有太大变化, 在 3 h明显增
加, 6 h 达到最大, 以后时间点逐渐下降。SiCBL3 在 1 h
表达量略有增加, 在 3 h达到最大, 6 h和 12 h逐渐下降,
24 h表达量较 12 h又有增加。SiCBL7在 1 h表达量略有
增加, 在 3 h达到最大, 6 h和 12 h逐渐下降, 24 h几乎看
不到条带。
3 讨论
3.1 谷子 CBL基因具有非常保守的序列和结构
干旱、高盐等逆境胁迫对粮食作物生产造成了严重
的影响 [1], 而由狗尾草经人工驯化和进化而来的谷子具
有抗旱、耐瘠、抗逆性强、适应性广等特点[27]。虽然我
国谷子地方品种以抗旱、耐脊、适应性广而著称, 但是对
于谷子抗旱、耐盐性研究报道较少[28]。本文表明 SiCBL
基因与其他物种中的 CBL基因一样[8,20,29], 在基因组内呈
不均匀分布。SiCBL基因的编码区序列在 211~319氨基酸
之间, 而内含子的大小差异造成了 SiCBL 基因在基因组
第 2期 赵晋锋等: 谷子 CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析 365
图 5 SiCBLs基因在干旱、高盐胁迫下的表达
Fig. 5 Electrophoretogram displaying the loading patterns for expression of SiCBL members under drought and salt stresses
A: 干旱胁迫; B: 250 mmol L–1 NaCl胁迫。A: drought stress; B: 250 mmol L–1 NaCl stress.
上的长度差异较大, 在 1.8~8.6 kb之间。SiCBL序列非常
保守, 其序列相似性为 26%~63%; SiCBL 基因内含子个
数、位置及外显子碱基数也非常保守。EF-hand结构域是
CBL 蛋白的典型结构, 也是 CBL 结合钙离子的基本结构
[30]。结构域分析表明 SiCBL1~ SiCBL7都含有 4个 EF-Hand
功能域 , 而且 EF-hand 功能域之间的距离非常恒定。
SiCBL基因的这些保守性在其他物种如拟南芥、杨树、玉
米 CBL 基因的研究中也有类似的报道[8,20,29]。谷子 CBL
基因的这些高度保守性可能意味着在功能上非常相近的
作用模式, 这与 CIPK 作为它们共同的靶蛋白是相吻合的,
也说明谷子 CBL基因在抗逆相关代谢中有着重要作用[31]。
3.2 谷子 SiCBLs基因的起源
分析 CBL基因系统进化树, 发现每组 CBL中都含有
单子叶(水稻、玉米)和双子叶(拟南芥)物种中相应的 CBL
成员, 表明在单双子叶植物分化以前至少有 4 个 CBL 基
因分别是 I、II、III 和 IV 的祖先。在双子叶模式作物拟
南芥中 CBL 基因含有 6~7 个内含子, 而谷子 SiCBL 基因
中含有 7~8 个内含子, 这个结果意味着单子叶植物谷子
中 CBL 基因内含子在进化过程中要比双子叶植物拟南芥
更为活跃 , 该结论与杨树中 CBL 的研究结果是一致的
[20]。进化树中松树的 5个 CBL序列聚在不同的亚族中, 说
明 CBL 基因起源要早于被子植物和裸子植物的分化; 在
苔藓植物中存在 CBL基因表明 CBL基因在陆生植物早期
的进化过程中就已经存在。大量研究表明一些禾本科植物
在进化的过程中经历了整个基因组的复制事件 (whole-
genome duplication, WGD) [32-34], 比较玉米基因组上相应
复制区和高粱和水稻上的 orthologous 区域也发现同样的
结论[35-36], 此外不断有证据表明约在 5000 万年前禾本科
作物中的一部分重要基因在基因组范围内移动到了别的
位置[37-38]。因此我们推测谷子 CBL 基因经历了整个基因
组复制事件、染色体区域内的大片段复制以及基因缺失、
局部重排、转座子跳跃、染色体倒置等事件后进化到目前
CBL的状态。
3.3 谷子 SiCBL基因可能参与干旱、盐渍等逆境应答
7个谷子 CBL基因中 4个(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3
和 SiCBL5)受干旱强烈诱导 , 3 个(SiCBL1、SiCBL3 和
SiCBL7)受高盐胁迫诱导。如图 5所示 SiCBL基因在干旱
和盐胁迫处理及相同胁迫处理中不同基因的具体表达模
式不尽相同, 可能是 SiCBL 基因参与逆境应答调控的信
号途径不同所致, 但它们的表达量在干旱、高盐胁迫条件
下均有不同程度的增加, 说明这些 CBL 基因可能参与了
谷子对干旱和高盐的逆境应答反应。其中 SiCBL3在旱胁
迫中持续高表达, 是否意味着它在谷子抗旱作用中的重
要性 , 值得更详细和深入的研究 , 包括转基因功能验证
等。已有研究表明植物 CBL 基因在植物逆境应答过程中
起重要作用[15-21], 例如玉米中的 ZmCBL4 基因在 PEG 模
拟干旱处理时其表达量在 2 h和 6 h上升, 12 h下降, 在
24 h达到最大, 约为对照的 15倍; 在 NaCl处理时其表达
量逐步上升, 在 24 h达到最大, 约为对照的 12倍。我们
进一步以拟南芥野野生型为背景超表达该基因 , 发现
ZmCBL4 可显著提高转基因拟南芥的抗盐性[18]。拟南芥
AtCBL1和 AtCBL9在干旱和 NaCl处理时其表达量均被强
烈诱导, 进一步实验证明 AtCBL1 是逆境应答基因的一个
上游调控因子[16]; AtCBL9在 ABA信号途径和 ABA合成
途径中起作用, 并且主要在幼苗期参与拟南芥对逆境的
胁迫应答[17]。我们的初步研究也表明谷子 CBL家族中部
分 CBL 基因受干旱和高盐的强烈诱导, 因此我们推测谷
子中一些 SiCBL 基因可能参与谷子对干旱、高盐等逆境
胁迫的应答过程。由于不同逆境之间存在信号交叉, 而且
某一逆境可能产生多种 Ca2+信号, 加之不同的 CBLs可能
存在功能上的冗余, 以及不同的 CIPK靶蛋白有可能结合
同一感受器, 使得整个 CBL/CIPK信号系统变得复杂化、
多样化[39]。因此要理解 CBL/CIPK 这样复杂的信号通路,
研究 SiCBL 基因在干旱和高盐胁迫下是如何与其靶蛋白
互作激活下游一系列反应对干旱等逆境做出应答以及聚
类图中的垂直同源、平行同源基因对中基因的具体功能与
366 作 物 学 报 第 39卷
CBL 基因的表达谱与功能之间的关联只能依赖于更多
CBL、CIPK基因功能解析。
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