全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(2): 308317 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB126309), 国家自然基金联合基金项目(U1205021), 国家自然科学基金项
目(81303170)和福建农林大学优秀博士学位论文基金(324-1122yb005)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林文雄, E-mail: wenxiong181@163.com
第一作者联系方式: E-mail: wulinkun619@163.com **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-04-18; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2014-12-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141229.1004.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00308
不同连作年限野生地黄根际土壤微生物群落多样性分析
吴林坤 1,2 黄伟民 1,2,** 王娟英 1,2,** 吴红淼 1,2 陈 军 1,2 秦贤金 1,2
张重义 2 林文雄 1,2,*
1 福建农林大学生命科学学院, 福建福州 350002; 2 福建农林大学农业生态研究所, 福建福州 350002
摘 要: 以野生地黄为试验材料, 设置野生地黄头茬土壤、重茬土壤和原茬土壤处理, 未种植任何作物为对照, 于块
根膨大中期采集土样, 通过磷脂脂肪酸法(PLFA)和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术, 分析不同连作年限野
生地黄的根际微生物生物量和群落结构变化。PLFA分析结果表明, 不同处理情况下地黄根际土壤微生物群落结构存
在明显差异, 与头茬地黄根际土壤相比, 重茬地黄土壤微生物总量显著下降, 并且细菌/真菌比例下降。T-RFLP分析
结果表明, 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落结构存在一定差异, 野生状态地黄土壤和头茬土壤菌群较为相似,
变形菌门和厚壁菌门占据优势地位。野生状态地黄和头茬地黄根际富含 Bacillus、Pseudomonas等有益生防菌, 而重
茬地黄根际土壤滋生大量病原菌如 Clostridium sp.、Flexibacter polymorphus和 Clostridium ghoni, 有益菌群和纤维素
降解菌群减少, qRT-PCR定量分析也显示, 野生状态地黄和头茬地黄土壤中假单胞菌数量都显著高于重茬地黄土壤。
总之, 野生地黄存在连作障碍问题, 导致野生地黄根际有益菌数量减少而病原菌大量滋生, 从而降低了野生地黄抵
御病害的能力, 使重茬野生地黄生长发育差, 产量大幅降低。
关键词: 地黄; 磷脂脂肪酸; 末端限制性片段长度多态性; 微生物多样性; 植物根际
Diversity Analysis of Rhizosphere Microflora of Wild R. glutinosa Grown in
Monocropping for Different Years
WU Lin-Kun1,2, HUANG Wei-Min1,2,**, WANG Juan-Ying1,2,**, WU Hong-Miao1,2, CHEN Jun1,2, QIN
Xian-Jin1,2, ZHANG Zhong-Yi2, and LIN Wen-Xiong1,2,*
1 College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2 Agricultural Agroecological Institute, Fujian Agricul-
ture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: The soils sampled from the four different plots, including the newly planted, the two-year monocultured, the wild R.
glutinosa and the control without growing R. glutinosa, were used to study the changes in microbial biomass and community
composition using phospholipid fatty acid (PLFA) and terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analyses.
PLFA analysis indicated that the soil microbial community composition was significantly different among the R. glutinosa with
different years of monoculture. Compared with the newly planted soil, the total PLFA content and the ratio of bacteria/fungi in
two-year monocultured soil greatly declined. Further analysis by T-RFLP also displayed the distinct differences in rhizospheric
bacterial community structure of R. glutinosa. The microbial compositions from the wild and the newly planted R. glutinosa soils
tended to be more similar. It was found that the bacteria including Proteobacteria and Firmicutes were predominant in the wild
and newly planted R. glutinosa soils. Some beneficial biocontrol bacteria (such as Bacillus, Pseudomonas, etc.) gathered in the
rhizosphere of the wild and newly planted R. glutinosa. However, a large number of pathogenic bacteria bred in the rhizosphere of
the two-year monocultured R. glutinosa, such as Clostridium sp., Flexibacter polymorphus, and Clostridium ghoni, and the num-
ber of beneficial bacteria and cellulose degradation bacteria decreased. Furthermore, qRT-PCR analysis verified that the total
number of Pseudomonas was much higher in the wild and newly planted R. glutinosa soils than in the two-year monocultured soil.
In conclusion, the pathogenic microbes breed seriously in the rhizospheric soil of wild R. glutinosa under the monoculture regime,
第 2期 吴林坤等: 不同连作年限野生地黄根际土壤微生物群落多样性分析 309


and yet the number of beneficial bacteria decline, resulting in weakened ability of wild R. glutinosa to resist the diseases so that
the two-year monocultured wild R. glutinosa grows abnormally and its yield is decreased drastically.
Keywords: Rehmannia glutinosa; PLFA; T-RFLP; Microbial diversity; Plant rhizosphere
地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)是一种重要
的常用传统补益中药, 始载于《神农本草经》, 其块
根经各种炮制过程后即可入药, 具有多种功效, 如
滋阴补血、清热生津、益精填髓等, 是我国常用的
大宗药材之一。但是, 地黄在栽培过程中存在明显
的连作障碍问题, 造成产量品质严重下降, 甚至绝
收 , 每茬种植后需间隔8~10年方可再种 [1], 这限制
了中药资源的可持续生产以及地黄产区区域经济的
快速发展。
微生物与土壤生态功能是相辅相成、息息相关
的 , 并且跟植物之间有着紧密的联系 , 因此 , 微生
物群落的组成及其多样性是衡量土壤性质和功能的
一个重要指标。连作障碍形成及加重的原因极其复
杂, 根际作为植物-土壤生态系统物质交换的一个界
面, 是根系-土壤-微生物三者紧密结合、相互交流的
场所[2]。植物可以通过根系分泌某些化合物来吸引
某些特定微生物类群, 也能选择性抑制某些微生物
类群[3]。反之, 微生物类群的数量和多样性的改变,
也会影响土壤的微生态功能[4]。Mendes等[5]分析抑病
型土壤(disease-suppressive soil)与利病型土壤(disease-
conducive soil)的微生物群落结构发现, 种植于抑病
型土壤中的甜菜其根际优势群落主要为一些有益拮
抗菌(如β-变形菌门、γ-变形菌门、放线菌门等), 尤
其发现抑病型土壤中的假单胞菌数量极显著高于
利病型土壤。王明道等[6]运用变性梯度凝胶电泳和
传统的平板培养法检测地黄连作过程中土壤微生
物类群的变化, 发现连作导致细菌数量减少, 木霉
和黄曲霉数量增加 , 土壤生态系统失调。Van
Bruggen等 [7]研究发现根际微生物的分布状态与沿
根尖的分泌物含量有密切关系, 微生物生物量的积
累在一定程度上依赖于根系分泌物的释放。因此 ,
分析土壤微生物群落结构及其多样性和动态性等
信息, 对深入系统地揭示植物连作障碍的机制具有
重要意义。
众所周知, 传统的微生物培养方法受诸多因素
制约, 这不仅是由于自然界中可培养的微生物只有
约0.01%~10.00%, 而且通过分离得到的微生物不能
准确地反映自然环境中此物种的原位信息。因此 ,
通过分子生物学技术研究土壤微生物的群落和功能
多样性成为一种必然的趋势。近年来, 随着生物学
的发展, 相继出现了许多用于土壤微生物群落结构
分析的研究技术 , 如限制性片段长度多态性
(RFLP)、磷脂脂肪酸 (PLFA)、变性梯度凝胶电泳
(DGGE)和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技
术等[8]。目前, T-RFLP技术在分析比较不同土壤样品
中微生物群落的多样性以及探讨不同土壤微生物间
的系统发育和亲缘关系方面发挥着重要作用[9-11]。
本研究结合运用磷脂脂肪酸法(PLFA)和末端限
制性片段长度多态性(T-RFLP)技术分析和比较不同
连作年限的野生地黄及野生状态地黄根际微生物群
落结构和多样性变化, 以期为深入揭示药用植物连
作障碍形成的分子生态机制和探索合理有效的消减
策略提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 田间试验及取样方法
将野生地黄人工移栽至河南农业大学试验农场
大田连续种植 2年, 共设置以下 4个试验, 即头茬土
壤(ZC, 移栽至大田种植 1 年)、重茬土壤(CC, 移栽
至大田连续种植 2年)、野生状态地黄土壤(WR)以及
对照土壤(CK, 空白土壤即整个试验过程中未种植
任何作物)。其中, 野生状态地黄土壤采用 5 点取样
法(WR), 取样地点土壤质地、气候等条件与田间试
验基本相同, 野生状态地黄周围其他植被多样性丰
富(野生地黄占总植被比例平均为 26.2%)。本试验所
用地块(正茬、重茬、对照)均为新开垦的山地土壤,
在同一地块上, 肥力水平一致。整地种植前, 基施三
元复合肥 750 kg hm–2, 磷酸二胺 550 kg hm–2, 过磷
酸钙 750 kg hm–2, 硫酸钾复合肥 375 kg hm–2; 地黄
块茎膨大时追施三元复合肥 225 kg hm–2。整个试验
过程中, 头茬、重茬以及对照地块的田间管理措施
(如施肥和水分管理等)均保持一致, 野生状态地黄
未进行施肥除草等农艺措施, 保持自然野生状态。
于块根膨大中期采用抖根法采集土样, 即用铲
子挖出完整地黄块根, 用力抖动去除块根表面疏松
土壤, 再用刷子刷取紧贴地黄块根表面的土壤(50 g
株–1)作为根际土壤。过筛后将土壤样品分成 2份, 一
份自然风干后用于土壤理化性质测定; 一份迅速置
–80℃冰箱或立即用于土壤微生物磷脂脂肪酸和土
壤总 DNA提取。
310 作 物 学 报 第 41卷

1.2 土壤有机质及速效养分测定
参照文献[12], 采用重铬酸钾氧化法测定有机
质; 采用碱解扩散法测定碱解氮; 采用 0.5 mol L–1
NaHCO3 浸提-钼锑抗比色法测定速效磷; 采用 0.5
mol L–1 NH4OAc浸提-火焰光度法测定速效钾; 采用
pH酸度计(Sartorius PB-10)测定 pH值。
1.3 磷脂脂肪酸的提取、测定和分析
采用磷脂脂肪酸(PLFA)法测定不同连作年限地
黄根际土壤微生物量。以 KOH-甲醇溶液甲酯化法提
取磷脂脂肪酸[13-14], 以十九烷酸甲酯(19:0)为内标。
微生物特征性脂肪酸分析中, 细菌标记性脂肪酸为
15:0、16:1w7c、a17:0、cy19:0等[15-16]; 真菌标记性
脂肪酸为 18:1w9c、18:2w6t[13,17]; 放线菌标记性脂
肪酸为 10Me17:0、10Me18:0 [13,18]; 原生动物标记性
脂肪酸为 20:4w6c(6,9,12,15)[19]。其中, i、a、cy 和
Me分别表示同型(甲基在 C末端第 2位碳原子上)、
异型(甲基在 C 末端第 3 位碳原子上)、环丙基和甲
基分支脂肪酸; w 后的数字表示双键的位置(甲基端
起); c、t 分别表示顺式(双键两侧-H 在同侧)及反式
(双键两侧-H在异侧)脂肪酸。
1.4 土壤微生物总 DNA的提取和纯化
参照文献 [20]并稍作修改提取土壤微生物总
DNA。用 1%琼脂糖凝胶检测 DNA, 用胶回收试剂
盒(TianGen Biotech Co., Ltd)纯化 DNA, 纯化后置
–20℃冰箱保存, 每个土样均 3个重复。
1.5 细菌基因组的 PCR扩增及酶切
采用细菌通用引物扩增细菌 16S rRNA 特异片
段, 引物为 8-27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA
G-3)和 1492R (5-TACGGTACCTTGTTACGACTT-
3), 其中 8-27F引物的 5端用 FAM标记荧光[21]。PCR
反应体系(25 μL)为 12.5 μL 2×Taq 混合物(Sangon
Biotech Co., Ltd.), 1.0 μL 8-27F引物, 1.0 μL 1492R
引物, 1.0 μL DNA模板, 加 9.5 μL ddH2O。PCR反应
扩增程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min,
55℃退火 50 s, 72℃延伸 100 s, 35个循环, 最后 72℃
延伸 10 min, 4℃保存。扩增产物经胶回收试剂盒
(TianGen Biotech Co., Ltd.)回收后用 1%琼脂糖凝胶
电泳检测。纯化的 PCR产物用 Hae III、Msp I、Afa
I和 Alu I限制性内切酶进行酶切[22]。
1.6 PCR产物测序及比库分析
酶切产物脱盐后与上样缓冲液及标准Marker
(GeneScan-500, Applied Biosystems)混合均匀, 96℃
变性4 min, 迅速置冰上, 然后在ABI 3730xl DNA
sequencer测序分析仪(Applied Biosystems)上进行毛
细管电泳检测。
测序结果采用GeneMarker V1.2进行图谱分析,
进一步, 将4个限制性内切酶(Msp I、Hae III、Afa I
和Alu I)酶切产生的T-RF片段与RDP数据库进行比
对 , 找出各样品中每个T-RF片段所对应的微生物
种属。
1.7 假单胞菌 qRT-PCR定量分析
假单胞菌 (Pseudomonas)定量分析所用引物为
Ps-for (5-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3)和 Ps-rev
(5-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3)[23]。PCR 反应体
系含 12.5 μL 2×Taq 混合物 (Sangon Biotech Co.,
Ltd.)、引物各 1.0 μL、1.0 μL DNA模板, 加 9.5 μL
ddH2O, 总体积为 25 μL。PCR扩增程序为 94℃预变
性 5 min, 95℃变性 1 min, 64℃退火 1 min, 72℃扩增
1 min, 35个循环, 最后 72℃再继续延伸 10 min, 4℃
保存。
1.8 数据分析
采用Microsoft Excel 2003分析数据, 方差分析
和聚类分析采用DPS7.0软件, 主成分分析(Principal
Component Analysis)采用SPSS11.0软件。
2 结果与分析
2.1 地黄田间生长情况比较
头茬野生地黄和重茬野生地黄在长势上存在显
著差异, 头茬野生地黄长势旺盛, 地上部植株健壮、
叶片宽大, 地下部块根膨大正常(图 1-A、图 1-E 左
侧), 与林子中野生状态地黄长势相近(图 1-C), 且无
病害症状 ; 而重茬野生地黄植株矮小 , 叶片小 , 地
下部块根无法伸长生长和膨大, 并出现明显的枯萎
死亡现象(图 1-B、图 1-E右侧); 野生状态地黄地上部
植株长势良好, 块根也能正常膨大(图 1-C、图 1-D)。
2.2 不同连作年限地黄根际土壤化学性质
从表 1 可以看出, 不同连作年限地黄根际土壤
中速效养分存在显著性差异, 野生状态地黄根际土
壤的速效养分均最低, 这可能与野生状态下未施肥
以及周围其他植被共同吸收利用有关, 而重茬土壤
样品中碱解氮、速效磷、速效钾的含量分别为 54.36,
59.75和 21.28 mg kg–1, 都显著高于头茬和野生状态
地黄根际土壤, 可见地黄连作并未导致土壤速效养
分下降, 反而有积累效应。同时, 发现重茬野生地
黄土壤的 pH 值显著低于头茬和野生状态地黄根际
土壤。
第 2期 吴林坤等: 不同连作年限野生地黄根际土壤微生物群落多样性分析 311



图 1 地黄田间生长情况
Fig. 1 Growth status of R. glutinosa in the field
A: 正茬野生地黄; B: 重茬野生地黄; C: 野生状态地黄; D: 野生状态地黄地下部; E: 正茬(左)、重茬(右)野生地黄地下部。
A: newly planted R. glutinosa; B: two-year monocultured R. glutinosa; C: wild R. glutinosa; D: tuber roots of the wild R. glutinosa;
E: tuber roots of the newly planted (left) and two-year monocultured (right) R. glutinosa.

表 1 不同连作年限地黄根际土壤化学性质比较
Table 1 Chemical properties of R. glutinosa rhizospheric soils with different year monocultures
样品
Sample
pH值
pH value
碱解氮
Available nitrogen
(mg kg–1)
速效磷
Available phosphorus
(mg kg–1)
速效钾
Available potassium
(mg kg–1)
有机质
Organic material
(g kg–1)
野生状态地黄土壤 WR 8.26±0.01 b 25.66±1.7616 c 6.89±0.29 d 13.40±0.04 c 7.28±0.12 c
头茬地黄土壤 ZC 8.23±0.01 b 47.60±3.4372 b 20.02±0.23 c 18.13±0.08 b 12.80±0.07 a
重茬地黄土壤 CC 8.09±0.01 c 54.36±2.4583 ab 59.75±0.49 a 21.28±0.47 a 11.20±0.09 b
对照土壤 CK 8.32±0.02 a 67.66±5.5561 a 27.96±0.11 b 12.09±0.26 d 12.44±0.07 a
同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil. CC: two-year monocultured soil. Values followed by different
letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.

2.3 不同连作年限地黄根际土壤微生物磷脂脂
肪酸含量及微生物量变化
经GC-MS测定, 共鉴定出19种微生物标记性脂
肪酸(表2)。野生状态地黄、头茬地黄、重茬地黄根
际土壤以及空白对照土壤的微生物总量分别为
62.255、54.848、48.398和51.565 nmol g–1 (表3), 可
见重茬地黄根际土壤微生物总量与头茬相比显著
下降。
4 种不同连作年限地黄其根际土壤微生物群落
特征差异显著(表 2)。其中, 15:0、16:1w7c、a17:0、
cy19:0 等表示细菌 ; 18:1w9c、18:2w6t 表示真菌 ;
10Me17:0、10Me18:0表示放线菌; 20:4w6c (6, 9, 12,
15)表示原生动物。由表 3 可以看出, 野生状态地黄
根际土壤中真菌和细菌的含量都较高, 这可能与野
外生态系统地黄周围植被较为丰富有关, 微生物群
落达到一个相对的平衡。比较发现, 重茬土壤微生
物群落中细菌含量下降, 而真菌含量却上升, 即细
菌/真菌比例下降。
2.4 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落多样
性的变化
2.4.1 不同连作年限地黄根际土壤微生物 DNA 提
取及 PCR 扩增 由图 2-A 可以看出, 以 CTAB
法提取的土壤总 DNA 条带较为清晰, 纯度较高。
以 Universal DNA Purification Kit 胶回收试剂盒
(TianGen Biotech Co., Ltd)回收后的 DNA 作为模
板进行细菌 16S rRNA 扩增 , 回收后检测发现 ,
PCR 扩增产物为 1500 bp 左右 , 且片段特异性良
好(图 2-B)。
2.4.2 不同连作年限地黄根际土壤细菌 T-RFLP 图
谱分析 将扩增的 16S rRNA 产物分别用 4 种限
制性内切酶(Msp I、Hae III、Afa I和 Alu I)进行酶切,
在野生状态地黄土壤中分别检测到 T-RF片段 155、
141、80 和 140 个; 在头茬地黄土壤中分别检测到
T-RF 片段 137、128、152和 109 个; 在重茬地黄土
壤中分别检测到 T-RF片段 114、122、144和 129个;
在对照土壤中分别检测到 T-RF 片段 127、123、86
312 作 物 学 报 第 41卷

表 2 不同连作年限地黄根际土壤中各种磷脂脂肪酸含量
Table 2 Concentrations of phospholipid fatty acids in R. glutinosa rhizospheric soils with different year monocultures (nmol g–1 soil)
PLFA生物标记
PLFA marker
WR ZC CC CK
12:0 0.148±0.021 b 0.000±0.000 c 0.231±0.005 a 0.162±0.002 ab
10Me17:0 0.529±0.025 c 1.021±0.024 b 0.895±0.048 b 1.868±0.026 a
10Me18:0 1.051±0.022 a 0.698±0.039 c 0.874±0.029 b 0.000±0.000 d
15:0 0.576±0.060 b 2.255±0.170 b 2.318±0.101 b 2.516±0.027 a
16:00 0.000±0.000 c 5.522±0.046 a 0.000±0.000 c 0.448±0.010 b
16:1w7c 6.168±0.060 a 5.700±0.136 a 4.353±0.388 b 5.479±0.056 a
16:1w9t 3.396±0.036 a 1.936±0.062 c 2.432±0.067 b 0.680±0.027 d
18:0 1.822±0.023 d 2.919±0.011 c 3.465±0.016 b 4.417±0.047 a
18:1w9c 10.406±0.077 a 10.115±0.098 ab 9.870±0.051 b 10.070±0.046 b
18:2w6t(6,9) 5.802±0.043 a 2.732±0.078 c 3.348±0.054 b 3.277±0.031 b
20:0 1.421±0.018 a 0.671±0.041 c 1.054±0.011 b 1.131±0.007 b
20:1w9t 0.505±0.015 b 0.252±0.041 c 1.000±0.043 b 0.000±0.000 d
20:4w6c(6,9,12,15) 0.767±0.044 a 0.000±0.000 c 0.573±0.023 b 0.448±0.025 b
a15:0 3.211±0.212 a 3.177±0.151 a 1.124±0.050 c 1.794±0.045 b
a17:0 5.441±0.515 a 4.316±0.120 ab 3.066±0.044 c 3.740±0.073 bc
cy17:0 3.498±0.077 a 0.799±0.028 b 0.813±0.048 b 0.967±0.061 b
cy19:0 2.183±0.131 b 2.331±0.084 b 2.031±0.093 b 3.073±0.089 a
i14:0 1.494±0.028 a 1.297±0.024 b 1.312±0.025 b 1.219±0.023 b
i16:0 13.831±0.266 a 9.101±0.094 c 9.651±0.061 bc 10.271±0.122 b
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤. i、a、cy和 Me分别表示同型、异型、环丙基和甲基分支脂肪酸; w
后的数字表示双键的位置(甲基端起); c、t分别表示顺式及反式脂肪酸。同一列数据中不同字母表示差异显著(P<0.05)。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monocultured soil. i, a, cy, and Me refer to iso, an-
teiso-, cyclopropyl and methyl branching fatty acids, respectively; w refers to the position of double bonds (from the methyl end); c and t
refer to the cis-configuration and trans-configuration, respectively. Values followed by different letters within the same column are signifi-
cantly different at the 0.05 probability level.

表 3 不同连作年限地黄根际土壤微生物量
Table 3 Microbial biomass in R. glutinosa rhizospheric soils with different year monocultures (nmol g–1)
微生物类型 Microbial group WR ZC CC CK
细菌 Bacterial 43.193±0.945 a 40.027±0.506 b 31.836±0.716 d 35.901±0.300 c
真菌 Fungi 16.209±0.072 a 12.848±0.135 c 13.218±0.004 b 13.348±0.056 b
细菌/真菌比例 Bacteria/fungi ratio 2.665±0.057 b 3.115±0.007 a 2.408±0.054 c 2.690±0.025 b
放线菌 Actinomycetes 1.580±0.045 b 1.720±0.045 ab 1.770±0.076 ab 1.869±0.027 a
原生生物 Protozoa 0.767±0.044 a 0.000±0.000 c 0.573±0.023 b 0.448±0.025 b
标记性 PLFA总量 Total PLFA 62.255±0.940 a 54.848±0.663 b 48.398±0.783 c 51.565±0.333 c
革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌 G+/G– 1.572±0.034 a 1.661±0.007 a 1.581±0.071 a 1.670±0.031 a
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。同一列数据中不同字母表示差异显著(P<0.05)。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monocultured soil. Values followed by different
letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level.

和 165个(图 3)。可见, 不同连作年限的地黄根际土
壤中细菌群落结构存在一定差异。
2.4.3 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落结构分
析 根据 Msp I 酶切片段的相对含量, 对不同连
作年限地黄根际土壤细菌群落结构进行主成分分析,
主成分 1、主成分 2、主成分 3分别解释变量方差的
42.4%、32.2%、25.4%, 三者共解释了变量方差的
100.0%。由图 4可见, 主成分 1、主成分 2、主成分
3 能够有效区分不同连作年限地黄根际土壤的细菌
群落, 其中野生状态地黄和头茬地黄均处于主成分
第 2期 吴林坤等: 不同连作年限野生地黄根际土壤微生物群落多样性分析 313



图 2 地黄根际土壤微生物总 DNA(A)及 16S rRNA扩增产物(B)
Fig. 2 Electrophoresis results of soil DNA (A) and the PCR products of 16S rRNA (B)
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monocultured soil.

图 3 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落的酶切图谱
Fig. 3 T-RFLP profiles of bacterial community in rhizospheric soils of R. glutinosa with different year monocultures
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monocultured soil.

图 4 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落结构的主成分分析
Fig. 4 Principal component analysis of rhizospheric bacterial community of R. glutinosa with different year monocultures
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monoculture soil.

1 的正半轴, 说明野生状态地黄和头茬地黄根际土
壤的细菌群落结构较为接近, 而重茬地黄土壤与其
他 3个样品相比, 区别较为明显, 处于主成分 1负半
轴的远端, 说明地黄连作明显改变了根际土壤细菌
的群落结构。聚类分析也表明, 重茬地黄根际土壤
细菌群落结构与对照土壤最为接近, 而明显区别于
头茬地黄和野生状态地黄(图 5)。
通过对不同连作年限地黄根际微生物进行门纲
314 作 物 学 报 第 41卷


图 5 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落结构的聚类分析
Fig. 5 Clustering analysis of rhizospheric bacterial community
of R. glutinosa with different year monocultures
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil;
CC: two-year monocultured soil.

分类分析后发现, 变形菌门的细菌种类在野生状态地
黄和头茬地黄根际土壤中所占比例分别为 25.08%和
25.42%, 均高于重茬地黄的 18.16%, 厚壁菌门在野生
状态地黄(12.54%)和头茬地黄(12.71%)根际土壤中所
占的比例也大于重茬地黄的 9.20%。然而, 放线菌菌门
在野生状态地黄、头茬地黄、重茬地黄根际土壤中的比
例分别为 9.48%、16.72%和 19.34%, 即呈递增的趋势。
2.4.4 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落的功能
分析 将 4种限制性内切酶酶切产生的 T-RF片段
与 RDP数据库比对, 并对各处理的一些优势菌群进
行功能归类分析, 共分为 5 大类, 即碳循环、硫循
环、纤维降解菌、有益菌以及病原菌(表 4)。其中, 碳
循环功能菌有拟杆菌属、醋杆菌属、嗜甲基菌属 3
种; 硫循环功能菌有硫化杆菌属 2 种; 纤维降解菌
有噬纤维菌属 2 种。整体来看, 多数碳循环、硫循
环或纤维素降解相关的细菌菌群, 在野生状态地黄
和头茬地黄根际土壤中的相对含量都明显高于重茬
地黄土壤。可见, 地黄连作导致一些参与土壤营养
循环的微生物数量下降。有益菌有芽孢杆菌属、类
芽孢杆菌属、假单胞菌属 3 种。其中芽孢杆菌属在
野生状态地黄、头茬地黄、重茬地黄、对照土壤中
的相对含量分别为 4.56%、4.89%、1.17%和 1.62%;
假单胞菌属在野生状态地黄、头茬地黄、重茬地黄、
对照土壤中的相对含量分别为 1.03%、1.13%、0 和
0。病原菌主要有梭菌属 2种和屈挠杆菌属 1种。其
中 Clostridium sp.在野生状态地黄、头茬地黄、重茬
地黄、对照土壤中的相对含量分别为 0.79%、0.76%、
2.00%和 0.42%; Flexibacter polymorphus在野生状态
地黄、头茬地黄、重茬地黄、对照土壤中的相对含
量分别为 1.57%、1.71%、2.92%和 1.64%; Clostridium
ghoni在野生状态地黄、头茬地黄、重茬地黄、对照
土壤中的相对含量分别为 0.67%、0.94%、1.94%和
1.17%。几类有益菌含量变化都呈现重茬地黄土壤低
于野生状态地黄和头茬地黄土壤的趋势, 而几类潜
在病原菌的含量变化都呈现出重茬地黄土壤高于野
生状态地黄和头茬地黄土壤的趋势。
2.4.5 不同连作年限地黄根际土壤中假单胞菌
qRT-PCR 定量分析 基于 T-RFLP 的分析结果,
确定了一类潜在的有益菌群即假单胞菌。进一步采
用 qRT-PCR技术对不同连作年限地黄根际土壤中假
单胞菌含量进行绝对定量分析, 发现野生状态地黄
和头茬地黄根际土壤中假单胞菌含量显著高于重茬
地黄土壤, 这与 T-RFLP 分析结果相一致, 验证了
T-RFLP结果的准确性。

图 6 不同连作年限地黄根际土壤细菌群落结构分析
Fig. 6 Bacterial community structure in rhizospheric soils of R. glutinosa with different year monocultures
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monocultured soil.
第 2期 吴林坤等: 不同连作年限野生地黄根际土壤微生物群落多样性分析 315


表 4 不同连作年限地黄根际土壤特异菌群相对含量分析
Table 4 Changes in the relative abundance of specific bacteria in rhizospheric soils of R. glutinosa with different monoculture
样品名称 Sample name (%) 功能分类
Functions
种名
Species
属名
Genus
Msp I酶切片段
T-RF fragment
(Msp I) WR ZC CC CK
Bacteroides splanchnicus 拟杆菌属 Bacteroides 93 0.48 0.60 1.16 0.77
Acetobacter sp. 醋杆菌属 Acetobacter 441 0.88 0.58 0 0
碳循环
Carbon cycling
Methylophilus methylotrophus 嗜甲基菌属 Methylophilus 482 7.46 4.61 3.40 0.00
Sulfobacillus thermosulfidooxidans 硫化杆菌属 Sulfobacillus 160 4.47 2.72 1.28 2.27 硫循环
Sulfur cycling Sulfobacillus disulfidooxidans 硫化杆菌属 Sulfobacillus 473 0.41 0.43 1.06 0.00
Cytophaga sp. 噬纤维菌属 Cytophaga 91 1.57 1.71 2.92 1.64 纤维降解
Cellulose degradation Cytophaga sp. 噬纤维菌属 Cytophaga 143 4.56 4.89 1.17 1.62
Bacillus sp. 芽孢杆菌属 Bacillus 143 4.56 4.89 1.17 1.62
Paenibacillus macquariensis 类芽孢杆菌属 Paenibacillus 152 2.79 2.51 0.66 3.38
有益菌
Probiotics
Pseudomonas sp. 假单胞菌属 Pseudomonas 490 1.03 1.13 0 0
Clostridium sp. 梭菌属 Clostridium 64 0.79 0.76 2.00 0.42
Flexibacter polymorphus 屈挠杆菌属 Flexibacter 91 1.57 1.71 2.92 1.64
病原菌
Pathogens
Clostridium ghoni 梭菌属 Clostridium 459 0.67 0.94 1.94 1.17
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤.
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil; CC: two-year monocultured soil.


图 7 不同连作年限地黄根际土壤假单胞菌属 qRT-PCR定量分析
Fig. 7 qRT-PCR quantification of Pseudomonas in
rhizospheric soils of R. glutinosa with different year
monocultures
CK: 对照土; ZC: 头茬土壤; WR: 野生土壤; CC: 重茬土壤。
CK: control soil; ZC: newly planted soil; WR: wild R. glutinosa soil;
CC: two-year monocultured soil.
3 讨论
植物连作障碍形成及加重的原因极其复杂, 涉
及土壤、植物、微生物等多个方面, 一些研究表明
土壤理化性状的改变和土壤肥力缺乏是导致作物连
作障碍发生的主要原因[24]。而本研究发现重茬土壤
样品中碱解氮、速效磷、速效钾的含量都显著高于
头茬和野生状态地黄根际土壤, 表明地黄连作并未
导致土壤速效养分下降, 反而出现积累效应。王茂
胜等 [25]研究发现, 随着种植年限的增加, 植烟的品
质和产量随之下降, 而土壤中全氮、全磷、有机质
的含量逐渐增加。郭红伟等 [26]也发现辣椒连作下 ,
土壤全磷、全钾、速效养分和大量元素都有不同程
度的积累。鉴于此 , 本研究进一步采用PLFA和
T-RFLP 2种技术深入分析不同连作年限野生地黄以
及野生状态地黄根际土壤微生物群落结构的变化。
运用PLFA法分析地黄根际土壤微生物量变化
表明, 重茬地黄根际土壤总微生物量与头茬相比显
著下降, 并且细菌/真菌比例下降。进一步, T-RFLP
分析发现野生地黄连作导致土壤微生物群落结构逐
渐发生偏移 , 并且某些潜在病原菌(如Clostridium
sp.、Flexibacter polymorphus和Clostridium ghoni)在
重茬地黄根际土壤中大量滋生。不同连作年限处理
下, 地黄根际土壤微生物群落结构存在较大差异可
能与地黄根系分泌物介导有密切关系。有报道发现,
将黄瓜自毒物质—香豆酸外源添加至土壤中, 会对
土壤微生物群落结构产生显著影响, 而且导致厚壁
菌门、-变形菌门等细菌大量增加及某些病原菌大
量繁殖增长[27]。同时, 本研究发现, 野生状态地黄和
头茬地黄根际土壤中聚集了大量有益菌群, 如芽孢
杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假
单胞菌属(Pseudomonas)等。芽孢杆菌属和假单胞菌
属作为PGPR菌株(植物根际促生菌)已被广泛运用到
农业生产中以提高作物的产、质量和防治病虫害[28]。
尤其是假单胞菌属, 作为一种重要的生物防治菌株,
316 作 物 学 报 第 41卷

具有较好的生物防治效果, 能够有效抑制土传病害
的发生 [29-30]。 Jetiyanon等 [31]报道 , 通过混合使用
PGPR菌株能够诱导植物产生系统抗性进而抵御多
种植物病害。进一步, qRT-PCR绝对定量分析也证实
了在野生状态地黄和头茬地黄根际土壤中假单胞菌
的数量显著高于重茬根际土壤, 即野生地黄连作下
根际微生态结构恶化, 有益菌含量下降, 导致连作
植株易受病害侵染。分析还发现, Cytophaga在野生
状态地黄和头茬地黄根际土壤中相对含量较高 ,
Cytophaga对植物根系分泌物、纤维素、土壤有机质
等降解有重要作用[32]。重茬地黄根际土壤中纤维素
降解菌含量下降可能影响土壤微生态环境的营养循
环, 从而降低地黄抵御病害的能力, 最终导致地黄
产、质量下降。
与传统的分离培养方法相比, 新兴的分子生物
学技术能够更加准确全面地反映微生物群落结构的
组成和结构。本研究将 PLFA与 T-RFLP分析相结合,
系统分析不同连作年限地黄根际土壤微生物群落结
构的差异, 并加以 qRT-PCR 定量验证, 结果更加全
面准确。本研究结果对深入阐明药用植物连作障碍
形成的分子机制及探索科学有效的缓解措施具有一
定的理论与指导意义。
4 结论
野生地黄在连作情况下仍然长势较差, 初步证
实这与其根际土壤总微生物量下降, 细菌/真菌比例
降低有一定相关性。野生地黄连作对其根际土壤细
菌群落结构的组成及分布有很大影响, 有益菌数量
较少, 病原菌大量滋生, 而野生状态地黄土壤和头
茬地黄土壤中却聚集较多的有益生防菌, 以假单胞
菌属、芽孢杆菌属最为显著, 不同栽培情况下野生
地黄根际土壤假单胞菌属数量变化趋势显著。
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