全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(7): 1206−1213 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由广东省自然科学基金重点项目(06200585)和宁波水稻育种创新团队项目(2009B21001)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 李晓方, E-mail: lixiaofang@163.com; 唐志明,E-mail: tzm2004@163.com
Received(收稿日期): 2012-10-22; Accepted(接受日期): 2013-03-19; Published online(网络出版日期): 2013-04-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130423.1327.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01206
广东不同时期水稻主栽品种抗病基因同源序列多态性分析
唐志明 1,* 陈建酉 2 陆永法 1 周华成 1 莫雪娇 2 毛兴学 2 李晓方 3,*
1宁波市农业科学研究院作物研究所, 浙江宁波 315040; 2广东省农业科学院水稻研究所, 广东广州 510640; 3长江大学农学院, 湖北
荆州 434025
摘 要: 为掌握广东不同时期水稻主栽品种抗病基因同源序列(RGA)多态性变化, 利用 3对 RGA标记分析了广东 20
世纪 50年代初地方品种及 1972、1980、1994和 2008年主栽品种。按供试品种 RGA-PCR指纹聚类, 以相似系数 0.81
为标准, 将 171份品种分为 20个类群。这五类品种分别分布于 11、7、4、8和 11个类群中, 它们的 Nei遗传多样性
指数分别是 0.801、0.682、0.493、0.603和 0.527。相对于地方品种, 1972、1980和 1994年品种 RGA多态性低是由
于品种类群少及品种在各类群中分布均衡性差, 2008年品种 RGA多态性低是由于该年大多数品种属于同一类群, 品
种在各类群中分布均衡性差。因此保持品种抗性多样性, 既要保证丰富类群, 又要确保品种在各类群中分布均衡。近
年来品种抗性背景趋同化是广东抗性多样性降低的主要原因, 今后在新品种的选育上应均衡利用不同抗源。
关键词: 水稻品种; 抗病基因同源序列; 多态性
Temporal Changes in Resistance Gene Analog Polymorphism of Major Rice
Varieties in Guangdong Province
TANG Zhi-Ming1,*, CHEN Jian-You2, LU Yong-Fa1, ZHOU Hua-Cheng1, MO Xue-Jiao2, MAO Xing-Xue2,
and LI Xiao-Fang3,*
1 Crop Research Institute, Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Ningbo 315040, China; 2 Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agri-
cultural Sciences, Guangzhou 510640, China; 3 Agricultural College, Yangtze University, Jingzhou 434025, China
Abstract: In order to investigate the temporal diversity of resistance gene analogs (RGA) from major rice varieties in Guangdong,
landraces from early 1950s and major varieties from 1972, 1980, 1994, and 2008 in Guangdong Province were selected and ana-
lyzed using three RGA primers. One hundred and seventy-one varieties were divided into twenty groups according to the DNA
band data at the similarity index of 0.81. Landraces from early 1950s and varieties from 1972, 1980, 1994, and 2008 were distrib-
uted into eleven, seven, four, eight and eleven groups, with their Nei’s polymorphism index of 0.801, 0.682, 0.493, 0.603, and
0.527, respectively. The RGA polymorphism of landraces was the highest. Having a few group types and unevenly distributing in
different groups were the reasons of low diversity for the varieties of 1972, 1980, and 1994, while the low diversity for varieties of
2008 resulted from that major varieties distributed in one group and unevenly distributed among different groups. Thus, having
various groups and evenly distribution is necessary for maintaining the resistance diversity of varieties. In recent years, the resis-
tance diversity of rice varieties in Guangdong decreased as major varieties had similar genetic background in resistance. Thus,
different resistant resources should be utilized equally in future rice breeding.
Keywords: Rice varieties; Resistance gene analog; Polymorphism
水稻抗性多样性是影响病害发生的重要因素之
一, 也是水稻适应的基础, 它间接影响水稻高产稳
产。自 20 世纪 50 年代初以来广东水稻病害逐渐加
剧[1-2], 导致病害加剧的因素很多, 如水稻种植结构
改变、气候变化、病原菌迅速传播等, 其中水稻抗
性多样性降低也会导致病害加剧。因此, 分析广东
水稻品种抗性多样性演变对于病害防治将有积极意
义。部分学者通过抗性鉴定分析抗性多样性[3-4], 部
分学者分析某个抗病基因多样性[5-6], 还有的学者利
用抗性基因享有共同的保守区域来设计简并引物扩
第 7期 唐志明等: 广东不同时期水稻主栽品种抗病基因同源序列多态性分析 1207
增和分离不同品种中具有相似序列的DNA片段, 来
分析作物品种抗病基因同源序列 (resistance gene
analogs, RGA)的多态性[7-11]。通常通过抗性鉴定和分
析某个抗病基因多样性, 分析作物品种在某个病害
上的抗性多样性。RGA是潜在多种病害的抗病基因,
可用以较全面分析品种的抗性多样性。由于并非所
有 RGA都是抗病基因[12-13], 及抗性鉴定是针对某个
病害而 RGA 包含多种病害抗性基因, 导致 RGA 分
析结果与抗性鉴定结果不完全一致, 因此部分学者
对 RGA分析存在质疑。虽然抗病基因同源序列的多
态性不能精准反映作物品种抗性状况, 但很多报道
证实 RGA 分析结果与抗性鉴定结果基本吻合[14-17],
另外抗病基因同源序列中有潜在的多种病害的抗病
基因[13], 它们的多态性在一定程度上能够反映作物
品种抗性背景[7,16]及用于作物品种抗性多样性预测。
目前主要通过 RGA 分析现阶段品种的抗性多
样性 [7-11], 而未见对不同时期品种抗性多样性分析
的报道。为此本文通过分析广东不同时期水稻品种
RGA的多态性来了解广东水稻品种抗性多样性变化,
为今后水稻新品种选育和病害防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试品种
选取 5 个不同时期品种, 根据《中国水稻品种
及其系谱》的记载, 选取 20 世纪 50 年代初广东种
植面积较大的地方品种, 根据广东省农业厅提供的
品种种植面积统计表选取其余时期主栽常规品种和
杂交稻主要恢复系及不育系(表 1)。其中 1972 年和
1980年有 6份品种相同, 1994年和 2008年有 10份
品种相同, 共计 171份材料。试材来自广东省农业科
学院水稻研究所、中国水稻研究所、广西农业科学
院、华南农业大学等单位。
1.2 水稻全基因组 DNA提取
采用 SDS提取法提取 DNA [18], 然后用 300 mL
TE 溶解备用, 并用紫外分光光度计检测 DNA 含量
和纯度。
1.3 RGA引物
参考刘二明等[16]、Sun等[19]、马辉刚等[20]研究,
选用 3对 RGA引物(表 2)。
1.4 RGA-PCR扩增、电泳和银染
1.4.1 PCR PCR 步骤为: (1) 94℃变性 5 min;
(2) 94℃下变性 1 min, 45℃下退火 1 min, 72℃下延
伸 2 min, 共 40个循环; (3) 72℃延伸 8 min。
1.4.2 电泳及显色 在 Bio-Rad 公司生产的 Sequi-
Gen 垂直电泳槽中电泳, 变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为
6% (含 7 mol L−1尿素), 电泳溶液为 1×TBE, 电压为
1200 V, 电泳时间 1.0~2.5 h。电泳后, 采用银染法显色。
表 1 不同时期品种数量和种植面积
Table 1 Quantity of cultivars and their total planting areas in different phases
年代
Period
品种数
Number of
cultivars
所选品种种植面积
Planting area for chosen
cultivars (×103 hm2)
广东省总种植面积
Total rice area in
Guangdong (×103 hm2)
百分比
Percentage a (%)
1950年代初 Early 1950s 31 — — —
1972 25 2509.6 4330.1 58.0
1980 19 2878.3 4088.8 70.4
1994 41 1876.7 2678.0 70.1
2008 71 1439.4 2056.2 70.0
a 所选品种种植面积占广东水稻总面积中的百分比。
a The percentage of planting area of chosen cultivars to the total planting area in Guangdong.
表 2 用于 RGA分析的引物对
Table 2 List of RGA primer pairs
引物对代码
Code
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5′–3′)
保守结构域来源
Conserved motifs and origin
XLRR-for F: TCCGTTGGACAGGAAGGAG RGA1
XLRR-rev R: TCCCATAGACCGGACTGTT
水稻抗白叶枯病基因 Xa21含 LRRs结构
LRR region of Xa21 gene from rice
Pto-kin1 F: GCATTGGAACAAGGTGAA RGA2
Pto-kin2 R: AGGGGGACCACCACGTAG
来自于番茄 Pto的激酶结构
Kinase domain of Pto from tomato
NLRR-for F: TAGGGCCTCTTGCATCGT RGA3
NLRR-rev R: TATAAAAAGTGCCGGACT
来自于烟草 N 含 LRRs结构
LRR region of the tobacco N gene
1208 作 物 学 报 第 39卷
1.5 读带及数据处理
在荧光灯箱上读取扩增产物的电泳图谱带, 有
带的记为“1”, 无带的记为“0”。利用 NTSYSpc Ver-
sion 2.10E (Applied Bio Statistics Inc.)中的 UPGMA
程序进行聚类分析, 构建聚类图。
1.6 品种在不同类群中分布均匀度及 RGA 多态
性的计算
根据 RGA 标记带型数据将品种分成不同类群,
分别统计不同时期品种在各类群中的数量。参考物
种均匀度计算公式[21]计算某时期品种分布均匀度。
均匀度= )ln(
1
i
S
i
i PP∑
=
− /ln S
Pi 为某时期第 i 类群内品种数占品种总数的比
例, s为该时期品种类群数。
根据 RGA 标记带型数据计算得到某时期品种
的 Nei遗传多样性指数[22], 可反映该时期品种 RGA
多态性状况。
Nei遗传多样性指数=1 − 2
1
n
i
i
P
=
∑
n为某时期品种类群数, Pi为该时期第 i类群内
品种数占品种总数的比例。
2 结果与分析
2.1 品种 RGA多态性
3 对 RGA 引物在 171 份供试品种(系)中共扩增
出可辨析谱带 100 条, 其中多态性谱带 86 条, 占总
带数的 86%。引物 RGA1、RGA2 和 RGA3 扩增条
带数分别是 49、17 和 34, 其中多态性谱带分别是
40、15和 31。
2.2 基于 RGA相似性对品种(系)聚类
2.2.1 品种类群划分 根据带型相似系数 0.81为
度, 可将 171个品种(系)分为 20类群(图 1和图 2)。
从图 1汀秋 5号起到图 2珍桂矮止, 共 95份材料属
于第一类群。图 2 秋长矮到黄华占, 共 8 份材料属于
第二类群, 剩下品种的划分以此类推。第一、十一类
群品种数较多, 其余类群品种数少, 在 1~8之间。
2.2.2 不同时期品种在各类群中的分布 地方品
种、1972年、1980年、1994年和 2008年品种分别
分布于 11、7、4、8 和 11 个类群中。地方品种和
2008年品种分布类群最多, 1980年品种分布类群最
少(表 3)。
2.2.3 不同时期品种在各类群中分布比例及均匀度
地方品种在各类群中分布较现代品种均匀, 大
部分现代品种分布于某一类群中, 其中 2008年最明
显(图 3)。从 1950年代初到 2008年, 品种在各类群
中分布均匀度一直在下降, 2008年降至最低(图 4)。
2.2.4 不同时期品种 RGA 多态性 地方品种、
1972、1980、1994和 2008年品种 Nei遗传多样性指
数分别是 0.801、0.682、0.493、0.603和 0.527, 1950
年代初到 1980 年品种 RGA 多态性处于下降趋势;
1980 年到 1994 年多态性得到提高; 1994 年到 2008
年 RGA多态性又有所下降。地方品种 RGA多态性
最高, 1980年最低, 2008年处于第二低水平。
1950 年代初到 1994 年 RGA 多态性的降低, 一
方面由于品种类群减少, 另一方面由于现代品种在
各类群中分布均衡性较地方品种差。2008 年品种
RGA 多态性低, 主要是由于品种在各类群中分布均
衡性差。
3 讨论
不同时期品种抗性多样性分析结果显示现代品
种 RGA多态性低于地方品种, 且从 20世纪 50年代
初到 2008 年, 类群 1 中品种所占比例越来越高(图
3), 说明越来越多品种的抗性背景相近 , 品种抗性
背景趋同化加剧。刘传光和张桂权[23]利用 SSR标记
分析广东主栽常规品种遗传多样性指出, 20世纪 50
年代以来品种间遗传距离呈下降趋势 , 这与本文
1950年代初以来品种抗性背景趋同化结果一致。
根据赖真如等[1]的统计可知广东 20 世纪 50 至
60 年代稻瘟病全省只部分地区发生且大爆发年份少,
其后全省发生且大爆发年份增多; 纹枯病 20世纪 70
年代之前为次要病害, 之后上升为主要病害, 80 年
代发病范围和发病程度进一步加剧; 白叶枯 20世纪
50至 60年代只在河边田块发生, 70年代到 80年代
中期发病严重[1,24]。广东 20世纪 50年代以来水稻病
害加剧很可能与品种 RGA多态性降低有关。另外根
据广东省农村统计年鉴 2006 年至 2008 年每公顷稻
田内病害造成水稻产量年均损失量为 59.42 kg, 1992
年至 1994年均损失量为 35.13 kg [2], 表明 2008年附
近年份病害较 1994年附近年份严重, 这可能与 2008
年品种抗性背景趋同化加剧及 RGA多态性低有关。
品种抗性背景趋同化势必加大病菌的选择压
力, 使弱势致病小种迅速繁衍, 从而加速品种抗性
丧失[25]。Villaréal和 Lannou[26]分析白粉病致病菌在
多样性低的单一品种群体中和多样性高的混合品种
群体中繁殖 7 代后发现, 在多样性低的群体中繁殖
快。可见遗传多样性低的群体有利于致病菌的繁殖
第 7期 唐志明等: 广东不同时期水稻主栽品种抗病基因同源序列多态性分析 1209
及加剧病害。高呈祥等[27]指出黑龙江省稻瘟病大发
生是由于个别抗性品种大面积种植, 单一抗源大规
模利用导致能够侵染该抗性品种的劣势小种迅速繁
殖成为优势小种, 进而导致品种丧失抗性。如今我
国的水稻品种虽然含有多种抗源, 但大多数育种家
却倾向利用少数优势抗源。广东近年来主要常规品
种和多数恢复系都含有抗白叶枯基因 Xa4 [28], 近年
来新育成品种稻瘟病抗源主要来源于二八占、巴太
软香、三黄占 2 号和 IR64, 且抗源来自二八占比例
较大[29]。张雪梅对四川 134 份主栽品种进行抗性聚
类分析, 得到 70 份品种属于同一类群[30], 说明大多
数品种抗性背景类同。沙学延和朱立宏[31]对我国 20
世纪 90 年代 158 份水稻品种白叶枯抗源分析表明,
68.7%的品种只含有 Xa4基因。育种家倾向利用少数
优势抗源, 虽然使培育出来新品种暂时具有良好抗
性, 但势必会造成大多数品种抗性背景趋同化, 大
图 1 3对 RGA引物对 171份供试品种的聚类
Fig. 1 Dendrogram of the 171 tested rice cultivars based on three pairs of RGA-PCR
1210 作 物 学 报 第 39卷
大缩短品种抗性持续时间, 导致品种丧失抗性, 引
发病害大面积发生。这可能是广东从 20 世纪 50 年
代初到 2008年品种抗性背景趋同化原因之一, 同时
也加剧病害发生。因此, 同一抗源应避免被大量利
用, 应均衡利用不同抗源, 避免过多品种抗性背景
相近。抗性稍差的抗源也应受到重视, 各种抗源应
均衡利用到新品种中。我国上世纪七八十年代由于
小麦抗源单一, 导致病害大流行, 后来不同抗源小
麦品种出现才使病害得以控制[32]。日本曾经稻瘟病
发病严重, 他们通过利用聚合多种抗源的多系品种
成功控制稻瘟病[33]。Mundt [34]研究发现含有不同抗
源的混合品种相对于单一品种具有更好的抗性。另
外朱有勇等[35]将RGA差异较大品种混栽, 达到不同
抗源品种混栽目的, 使稻瘟病得到有效控制。可见,
合理利用抗源的重要性, 因此我们应该从几个方面
或更好的途径来合理利用抗源。
图 2 3对 RGA引物对 171份供试品种的聚类(续)
Fig. 2 Continued dendrogram of the 171 tested rice cultivars based on three pairs of RGA-PCR
第 7期 唐志明等: 广东不同时期水稻主栽品种抗病基因同源序列多态性分析 1211
表 3 不同时期品种在各类群中分布数量及分布类群数
Table 3 Cultivar number in each group and group number in different stages
年代 Period 年代 Period 类群
Group Early 1950s 1972 1980 1994 2008
类群
Group Early 1950s 1972 1980 1994 2008
1 8 13 13 25 48 11 10 3 2 2 5
2 — 3 1 2 2 12 1 1 — — —
3 1 1 — — — 13 — — — 2 1
4 — — — 2 5 14 — — — — 1
5 — — — 1 4 15 1 — — 4 —
6 — — — — 2 16 — — — 3 1
7 1 — — — 1 17 1 — — — —
8 1 3 — — — 18 1 — — — —
9 — — 3 — — 19 2 1 — — —
10 4 — — — — 20 — — — — 1
各期品种类群数 Group number of varieties in different stages 11 7 4 8 11
— 表示该类群中无品种。— means no cultivars in that group.
图 3 不同时期各类群品种数在总品种数中所占比例
Fig. 3 Rate of cultivars from each group to total cultivars in different stages
图 4 不同时期品种在各类群中分布均匀度
Fig. 4 Distribution evenness of cultivars from different
stages in each group
丰富、优质的抗源是抗源利用多样化的基础 ,
所以新抗源的开发显得尤为重要。野生稻具有很好
的适应性, 对恶劣环境的抵抗力强, 在抗性方面也
不例外。如优良白叶枯病抗源 Xa21就是从野生稻中
得到的。因此, 野生稻可作为优质抗源筛选对象。
另外, 地方品种在各地经过长期的进化, 对当地的
环境具有最佳适应性 , 对病害也具备很好的抗性 ,
它们可以作为各地优良抗源的筛选对象。我们还可
以从国外品种、水稻相近的物种等中筛选抗源。
4 结论
广东现代品种 RGA多态性低于地方品种, 其中
1212 作 物 学 报 第 39卷
1972、1980和 1994年品种 RGA多态性降低是由于
类群减少及品种在各类群分布均匀度降低所致 ,
2008 年品种 RGA 多态性降低是由于该年大多数品
种属于同一类群, 使品种在各类群分布均匀度降低
所致。近年来广东大多数水稻品种抗性背景趋同化
势必造成抗性多样性降低, 加剧病害, 因此应该改
变当今只利用少数优势抗源的现状, 均衡利用不同
抗源。
致谢: 感谢广东省种子管理总站罗森辉站长和司徒
志谋提供品种种植资料。
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