全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 789−805 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31271756, 31101175)和高等学校学科创新引智计划(111计划)项目(B12006)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 梁颖, E-mail: yliang@swu.edu.cn; 卢坤, E-mail: drlukun@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: dfang1987@163.com (朱斌); junxlu@163.com (陆俊杏) **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-11-01; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1021.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00789
甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析
朱 斌 1,2,3,** 陆俊杏 1,2,3,** 彭 茜 1,2,3 翁昌梅 1,2,3 王淑文 1,2,3
余 浩 1,2,3 李加纳 1,2,3 卢 坤 1,2,3,* 梁 颖 1,2,3,*
1 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715; 2重庆市油菜工程技术研究中心, 重庆 400715; 3南方山地农业教育部工程研究中心, 重
庆 400715
摘 要: 从甘蓝型油菜中克隆了 MAPK7 基因家族 3 个成员 BnMAPK7-1、BnMAPK7-2 和 BnMAPK7-3 的全长 cDNA
序列, 它们最长标准 mRNA分别为 1593、1434和 1547 bp。系统进化分析表明, 甘蓝型油菜 MAPK7基因全部来自白
菜, 而且 BnMAPK7-1/-2由白菜 Bra03723祖先的基因加倍产生, 而 BnMAPK7-3则由白菜 Bra037234的祖先基因进化
形成。同时, 克隆获得 BnMAPK7-1/-2的启动子序列, 该启动子里含有多个与光诱导相关的元件、激素响应元件和逆
境胁迫响应元件。实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)显示甘蓝型油菜 MAPK7基因家族在所有的组织器官中均表达, 并发
现该基因家族的表达受植物激素(MeJA、ABA和 SA)、信号分子(H2O2)、逆境(高温)以及伤害(损伤和核盘菌)的诱导,
初步证明甘蓝型油菜 MAPK7基因在植物逆境胁迫应答中起一定作用。实现了甘蓝型油菜 MAPK7-1/-3基因的原核表
达, 并证明它们编码的蛋白主要以包涵体形式存在, 为后续的研究提供了基础。
关键词: 甘蓝型油菜; MAPK7基因; 实时荧光定量 PCR; 原核表达
Cloning and Analysis of MAPK7 Gene Family and Their Promoters from Bras-
sica napus
ZHU Bin1,2,3,**, LU Jun-Xing1,2,3,**, PENG Qian1,2,3, WENG Chang-Mei1,2,3, WANG Shu-Wen1,2,3, YU
Hao1,2,3, LI Jia-Na1,2,3, LU Kun1,2,3,*, and LIANG Ying1,2,3,*
1 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2 Chongqing Rapeseed Engineering & Technology Re-
search Center, Chongqing 400715, China; 3 Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400715,
China
Abstract: Mitogen-activated protein kinase (MAPK) is a large family of serine/threonine protein kinase, containing 11 conserved
subdomains. MAPK pathways play a central role in transferring information from diverse receptors/sensors to a wide range of
cellular responses in plants. Signaling through MAP kinase cascade can lead to cellular responses including cell division, deve-
lopment, hormone, physiology, as well as the response to a broad variety of biotic and abiotic stresses. In this study, the full-length
cDNA of MAPK7 gene family was isolated from Brassica napus. There were three members in this gene family, including
BnMAPK7-1, BnMAPK7-2, and BnMAPK7-3. Standard mRNA lengths of these genes were 1593, 1434, and 1547 bp. Phyloge-
netic tree showed that BnMAPK7 gene family was all originated from Brassica rapa, and BnMAPK7-1/-2 were generated from
ancestral gene of Bra03723, while BnMAPK7-3 was evolved from ancestral gene of Bra03724. We also cloned promoters of
BnMAPK7-1/-2, which contain some light responsive elements, hormone responsive elements and stress response elements.
Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) showed that BnMAPK7 gene family expressed in all organs tested, and could be induced
by phytohormones (MeJA, ABA, and SA), signaling molecules (H2O2), stress (heat) and injury (wounding and Sclerotinia scle-
rotiorum). This study preliminarily proved that the BnMAPK7 gene family plays certain roles in plant stress responses. In addition,
the recombinant BnMAPK7-1/-3 proteins were successfully expressed in Escherichia coli, but the main form of proteins was in-
clusion body, this result would contribute to further discuss in the future.
Keywords: Brassica napus; MAPK7 gene; Quantitative real-time PCR; Prokaryotic expression
790 作 物 学 报 第 39卷
蛋白质磷酸化和去磷酸化是调控细胞响应各种
外源信号的重要机制, MAPKs (促分裂原活化蛋白
激酶)级联途径在内源、外源信号传导过程中发挥着
重要的作用。植物中的 MAPK通路是多种生长信号
跨膜传递的共同通路, 它可以将外源刺激转入细胞
内并引发细胞应答, 从而调控基因表达、细胞生长
发育、细胞分裂分化以及凋亡等过程 [1], 因此 ,
MAPK 通路在植物抗逆诱导方面的作用越来越受到
人们的关注。MAPK 级联途径包括 3 种蛋白激酶
(MAPKKKs、MAPKKs 和 MAPKs), 构成三级激酶
模式, 通过该级联途径将上游信号和下游的应答分
子联系起来[2]。在拟南芥中, 20个编码 MAPKs的基
因已经被分离鉴定, 根据预测的氨基酸序列, 其分
成 A~D族, 其中 A~C族包含 TEY基序, 然而 D族
包含的是 TDY 基序[3]。C 族中的 MAPKs 包括拟南
芥中的 AtMPK1、AtMPK2、AtMPK7和 AtMPK14。
目前对植物 MAPKs的研究主要集中在 A、B族, 对
C 族中的 MAPKs 也有一定的研究[4-8]。据报道, 拟
南芥 AtMPK1和 AtMPK2在盐胁迫下的 mRNA水平
略有增加[7], 而在冷处理 24 h后分别下调[9], 而在损
伤、茉莉酸(JA), 脱落酸(ABA)和过氧化氢 H2O2 胁
迫下 , 它们的蛋白活性同样被激活上调 [10]。Ortiz-
Masia 等 [11]在豌豆 (Pisum sativum L.)中克隆得到
PsMPK2基因, 并在拟南芥中表达, 发现 PsMPK2跟
拟南芥的 AtMPK1和 AtMPK2同样可以被损伤、茉
莉酸(JA), 脱落酸(ABA)和 H2O2激活, 证明 C 亚类
的 MAPKs可能跟植物响应外界胁迫相关。目前, 植
物 C 族中的 MAPKs 研究主要集中在拟南芥等少数
植物的相关基因序列分析和逆境胁迫应答上 [10-11],
而在其它经济作物如甘蓝型油菜等中的研究还未见
报导。本试验克隆出甘蓝型油菜 MAPK7基因, 并对
其进行基本生物信息学研究和表达特征研究, 以期
有助于进一步了解植物 MAPK7 的功能, 为油菜抗
性机制研究及分子育种提供重要参考。
1 材料与方法
1.1 植物材料
典型黑籽系甘蓝型油菜中油 821, 由重庆市油
菜工程技术研究中心提供, 于常规大田试验条件种
植。
1.2 甘蓝型油菜 MAPK7全长基因的克隆
取甘蓝型油菜典型植株的叶片, 采用 Easy Pure
Plant Genomic DNA Kit (北京全式金生物技术有限
公司)参照说明书提取基因组 DNA。取甘蓝型油菜
的根、下胚轴、子叶、茎、叶、蕾、花、荚果皮、
花后 15、30 和 45 d 种子, 采用 Invitrogen 公司的
TRIzol 提取总 RNA, 用 RNase-free DNase I (Fer-
mentas 公司)去除 DNA 杂质, 采用 PrimeScript
RT
Reagent Kit (TaKaRa公司)分别反转录为 cDNA。根
据 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和 BRAD (http://
brassicadb.org/brad/downloadOverview.php)上已有物
种的 MAPK7 基因序列设计引物(表 1), 以甘蓝型油
菜混合器官总 cDNA 为模板 , 扩增甘蓝型油菜
MAPK7 基因的开放读码框 (open reading frame,
ORF), 用 Promega 公司的 pGEM-T Easy 载体连接
PCR 产物, 转化大肠杆菌 DH5α, 挑选阳性克隆测序,
获得 BnMAPK7基因的 ORF序列。以甘蓝型油菜所
有组织总 RNA 混合样为模板 , 根据已有物种的
MAPK7 基因序列和扩增得到的甘蓝型油菜 MAPK7
基因 ORF序列, 针对基因 5和 3 cDNA末端设计特
异引物 , 利用 Clontech 公司的 SMARTer RACE
cDNA Amplification Kit 进行 5和 3RACE (rapid
amplification of cDNA ends)扩增。根据 RACE的结
果和已有物种的 MAPK7 基因序列设计引物(表 1),
以甘蓝型油菜混合组织总 cDNA 为模板 , 扩增
MAPK7 基因的全长 cDNA 序列。PCR 产物经
Promega公司的 pGEM-T Easy载体连接, 转化大肠
杆菌 DH5α, 挑选阳性克隆测序, 获得 MAPK7 基因
全长 cDNA序列。
1.3 甘蓝型油菜 MAPK7基因启动子扩增
根据 BRAD 上甘蓝和白菜 MAPK7 基因序列和
本研究中克隆得到的甘蓝型油菜 MAPK7 基因序列
设计引物(表 1), 以甘蓝型油菜的基因组 DNA 为模
板, 扩增 ORF上游约 1400 bp的启动子序列。
1.4 生物信息学分析
序列比对、ORF查找和翻译、基因和蛋白注释、
分子参数计算等在 Vector NTI Advance 9.0上进行,
核酸和蛋白质的Blast分析在NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/)网站上进行, 利用 Seaview 4 软件, 采
用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树。
1.5 甘蓝型油菜 MAPK7基因的组织特异性检测
根据 MAPK7 基因的 cDNA 序列比对结果设计
引物(表 1), 用于检测甘蓝型油菜 MAPK7 基因各成
员的表达。分别以甘蓝型油菜的根、下胚轴、子叶、
茎、叶、蕾、花、荚果皮、花后 15 d、30 d和 45 d
种子的总 cDNA为模板, 内参基因 UBC21[12]采用引
第 5期 朱 斌等: 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析 791
表 1 本研究所用 PCR引物
Table 1 PCR primers used in this study
引物名称
Name of primers
引物序列
Sequence of primers (5′–3′)
功能
Function
FMAPK7-51 AAGGCGTCAACGCGATTCTCG 5′末端第一轮 PCR扩增引物 Primer of 5′ end first PCR
FMAPK7-52 CCTCTTCCGATGGGTTTGATGGG 5′末端第二轮 PCR扩增引物 Primer of 5′ end nested PCR
FMAPK7-31A ACCTGCGCATGTCCCAATCTC 3′A末端的第一轮 PCR扩增引物 Primer of 3′A end first PCR
FMAPK7-31B CTCCTGCTCATGTCCCTATTGC 3′B末端的第一轮 PCR扩增引物 Primer of 3′ B end first PCR
FMAPK7-32 AGAGATGATGTGGGACGAGATGCT 3′末端第二轮 PCR扩增引物 Primer of 3′ end nested PCR
FMAPK7ORF ATGGCGATGTTAGTTGAGCCACC 与RMAPK7ORFA组合, PCR扩增 BnMAPK7ORFA; 与RFMAPK7ORFB组
合, PCR扩增 BnMAPK7ORFB。
Pair with RMAPK7ORFA, PCR amplify of BnMAPK7ORFA; pair with
RMAPK7ORFB, PCR amplify of BnMAPK7ORFB.
RMAPK7ORFA TTAGGGGTTTGCAGTTTCAGCTCC
RMAPK7ORFB CTAAACACTCGCAGTTTCAGCTTCAG
FMAPK7-1F ATAACGTATTGCTTCATCTTCTTCCTCTTCT
C
与 RMAPK7-1F组合, PCR扩增 BnMAPK7-1全长序列; 与 RMAPK7-2F组
合, PCR扩增 BnMAPK7-3全长序列。
Pair with RMAPK7-1F, PCR amplify full length of BnMAPK7-1; pair with
RMAPK7-2F, PCR amplify full length of BnMAPK7-3.
FMAPK7-2F CAATTTAAGGAATAAAAGACCGAGAATTT
GGAGGT
与 RMAPK7-1F组合, PCR扩增 BnMAPK7-2全长序列。
Pair with RMAPK7-1F, PCR amplify full length of BnMAPK7-2.
RMAPK7-1F GTCTGAAAATATGACGTAAACTCATCAGC
TCAA
RMAPK7-2F ACAGGATCTGGTCTGGAAATCTGAAGTA
FMAPK7-1P CATGTCATCATTTTTCTTCAAAATCGATGT
GGTG
与 RMAPK7-1P组合, PCR扩增 BnMAPK7-1/-2启动子片段。
Pair with RMAPK7-1P, PCR amplify promoters of BnMAPK7-1/-2.
RMAPK7-1P TGTTCTTCTGCTAAGAACTCAACAAATCC
FMAPK7-1E acGGATCCATGGCGATGTTAGTTGAGCCA-
CCAAATG①
与 RMAPK7-1E组合, PCR扩增 BnMAPK7-1原核表达片段 pMAPK7-1。
Pair with RMAPK7-1E, PCR amplify pMAPK7-1 for prokaryotic expression.
RMAPK7-1E acGTCGACTTAGGGGTTTGCAGTTTCAG
CTCCAG②
FMAPK7-3E acGGATCCATGGCGATGTTAGTTGAGCC
ACCAAACG③
与 RMAPK7-3E组合, PCR扩展 BnMAPK7-3原核表达片段 pMAPK7-3。
Pair with RMAPK7-3E, PCR amplify pMAPK7-3 for prokaryotic expression.
RMAPK7-3E acGTCGACCTAAACACTCGCAGTTTCAG
CTTCAG④
FMAPK7-1Q GACGTTATGCTCCCTACGAATAAATC 与 RMAPK7-1Q组合, 实时荧光定量 PCR检测 BnMAPK7-1/-2的表达。
Pair with RMAPK7-1Q, qRT-PCR analysis of BnMAPK7-1/-2 expression.
RMAPK7-1Q ACGCGTGACCACATACTCGGT
FMAPK7-2Q GATGTTATGTTGCCTTCGGTTAGATC 与 RMAPK7-2Q组合, 实时荧光定量 PCR检测 BnMAPK7-3的表达。
Pair with RMAPK7-2Q, qRT-PCR analysis of BnMAPK7-3 expression.
RMAPK7-2Q ACGTGTAACCACGTACTCCGT
FUBC21 CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT 与RUBC21组合, 扩增UBC21, 作为实时荧光定量 PCR检测组织特异性表
达的内参。
Pair with RUBC21, amplify UBC21, as internal reference gene of tissue speci-
ficities in various organs tested in qRT-PCR.
RUBC21 CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC
FACT7 TGGGTTTGCTGGTGACGAT 与 RACT7组合, 扩增 ACT7, 作为实时荧光定量 PCR检测诱导特性表达的
内参。
Pair with RACT7, amplify ACT7, as internal reference gene of mRNA expres-
sion after treatment in qRT-PCR.
RACT7 TGCCTAGGACGACCAACAATACT
①③: 下画线标注限制性内切酶位点 BamH I; ②④: 下画线标注限制性内切酶位点 Sal I。
①③: Underline restriction enzyme site of BamH I; ②④: Underline restriction enzyme site of Sal I.
物对 FUBC21/RUBC21扩增(表 1), 按照 MIQE国际
化标准进行实时荧光定量 PCR [13], 检测甘蓝型油菜
MAPK7 基因家族各成员在各个组织器官中的表达
情况。
1.6 甘蓝型油菜 MAPK7基因的诱导表达检测
甘蓝型油菜中油 821 于温室中培养至幼苗为
792 作 物 学 报 第 39卷
2~3 片真叶时, 开始诱导, 化物处理为 50 μmol L–1
MeJA、100 μmol L–1 ABA、1 mmol L–1 SA, 分别添
加 0.05% (V/V)乙醇和 0.01% Tween-20表面活性剂,
喷施叶面和浇灌根部, 5 mmol L–1 H2O2喷施叶面并
浇根部; 损伤处理为用打孔器在叶片上打孔(30%体
积); 高温处理为将甘蓝型油菜幼苗放置光照培养箱
内, 正常光照, 40℃进行处理。分别于处理后 0、0.5、
1.0、2.0、4.0和 8.0 h取幼苗地上部存于液氮中, 于
–80℃保存。真菌核菌盘(Sclerotinia sclerotiorum)处
理为将油菜播种于育苗钵中, 6片真叶后分别于接种
核菌盘, 0、3、6、12、24和 48 h取叶片, 存于液氮
中备用。用保存的材料提取总 RNA, 并用 DNase I
去除DNA杂质后, 反转录成 cDNA。内参基因 ACT7 [12]
采用引物对 FACT7/RACT7 扩增(表 1), 按照 MIQE
国际化标准进行实时荧光定量 PCR [13], 检测甘蓝型
油菜 MAPK7基因家族各成员表达情况。
1.7 甘蓝型油菜 MAPK7基因在 E. coli中表达
1.7.1 原核表达载体的构建及酶切鉴定分析 根
据 BnMAPK7 基因家族的全长 cDNA 序列, 由于
BnMAPK7-1 和 BnMAPK7-2 编码的蛋白完全一致,
故只设计 2 对引物 FMAPK7-1E/RMAPK7-1E 和
FMAPK7-3E/RMAPK7-3E (表 1), 以包含 BnMAPK7-1
和BnMAPK7-3全长基因的阳性克隆子为模板, 分别
扩增原核表达片段 pMAPK7-1 (对应 BnMAPK7-1的
开放阅读框)、pMAPK7-3 (对应 BnMAPK7-3的开放
阅读框), PCR产物用 Promega公司的 pGEM-T Easy
载体连接, 转化大肠杆菌DH5α, 挑选阳性克隆进行
测序验证。选取 2 种序列正确的克隆, 分别命名为
pGEM-MAPK7-1 和 pGEM-MAPK7-3, 利用 Easy-
Pure Plasmid MiniPrep Kit (Transgene公司)分别提取
pGEM-MAPK7-1、pGEM-MAPK7-3 和载体 pET28a
质粒, 用限制性内切酶 BamH I和 Sal I (Fermentas)
分别双酶切质粒 pGEM-MAPK7-1、pGEM-MAPK7-3
和 pET28a, 用 T4 DNA连接酶(Fermentas公司)将载
体骨架 pET28a 和基因片段 pGEM-MAPK7-1、
pGEM-MAPK7-3 连接后, 转化大肠杆菌 DH5a, 通
过 PCR 检测和酶切鉴定, 挑取 2 种阳性克隆, 分别
命名为 pET28a-MAPK7-1、pET28a -MAPK7-3, 提
取质粒, 备用。
1.7.2 目的蛋白的表达 将重组质粒 pET28a-
MAPK7-1、pET28a-MAPK7-3 和空白载体 pET28a
分别转化大肠杆菌 BL21于含 Kan抗性的 LB固体培
养基培养, 经 PCR 鉴定后, 挑取阳性克隆于含 Kan
抗性的 LB液体培养基 20 mL的三角瓶, 37 , 225℃
转 min–1培养过夜。次日按 1∶50 的接种量 2 次接
种培养, 37 , 225℃ 转 min–1培养至OD值约为 0.4时,
加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol L–1, 37 , 225℃ 转
min–1下诱导 BnMAPK7蛋白表达, 于 2、4和 6 h各
取 500 μL菌液, 离心收集菌体, 备用。以含空白载
体 pET28a的 BL21菌液和空白菌液 BL21作为对照。
收集的菌体用 1×SDS Loading buffer重悬, 于 100℃水
中煮 5 min, 9000×g离心 1 min, 冰浴2 min [14], 收集上
清液, 进行 SDS-PAGE电泳, 确定最佳诱导时间。
1.7.3 目的蛋白的可溶性分析 在收集的菌体中
加入细菌裂解液重悬, 用反复冻融法和冰上超声破
碎法(Hu Y-T, 2009)破碎后 , 离心分离 , 取上清液 ,
加入 2×SDS Loading buffer混匀, 沸水浴 5 min。取
沉淀, 加入 1×SDS Loading buffer 重悬, 沸水浴 5
min。煮沸后的上清液、沉淀于 9000×g离心 1 min, 分
别取上清液, 进行 SDS-PAGE电泳, 检测BnMAPK7
蛋白在细胞破碎后的上清液和沉淀中的表达情况 ,
从而确定该蛋白是分泌到胞外, 还是以包涵体形式
存在。
2 结果与分析
2.1 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族全长 cDNA的
克隆
扩增得到 2条不同的甘蓝型油菜 ORF条带, 测
序表明为 2 条不同的 ORF 序列(图 1)。通过 RACE
扩增和测序, 分别得到 2 个不同的 5RACE 末端(图
2)和 2个不同的 3RACE末端(图 3)。以甘蓝型油菜
cDNA 为模板 , 利用全长引物 FMAPK7-1F、
FMAPK7-2F 与 RMAPK7-1F、RMAPK7-2F 两两组
合进行 PCR扩增(表 1), 得到 3条约 1500 bp的条带
(图 5)。测序结果表明, 在甘蓝型油菜中包含 3条不
同的 cDNA 序列 , 将其命名为 BnMAPK7-1 (JX
683732.1)、BnMAPK7-2 (JX827378.1)和 BnMAPK7-3
(JX827379.1)。BLASTn序列比对表明, 本研究在甘
蓝型油菜中克隆得到的 MAPK7 基因均与拟南芥
(Arabidopsis thaliana) MPK7 (NM_127374. 3)具有
95%以上的同源性 , 远高于与其他基因的同源性 ,
本研究得到的 3 个基因均为 MAPK7 基因。以拟南
芥 AtMPK7 基因为探针, 利用数据库 BRAD 获得白
菜 MAPK7 基因家族 2个成员 Bra037234 和 Bra-
039629 的 ORF 序列 , 但在甘蓝中却没有找到与
AtMPK7垂直同源的基因。
第 5期 朱 斌等: 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析 793
图 1 BnMAPK7基因家族开放读码框的扩增
Fig. 1 PCR products of ORF of BnMAPK7 gene family
M: trans2K plus DNA marker; 1: BnMAPK7ORFA PCR扩增产物;
2: BnMAPK7ORFB PCR扩增产物。
M: trans2K plus DNA marker; 1: PCR product of BnMAPK7ORFA;
2: PCR product of BnMAPK7ORFB.
图 2 BnMAPK7基因家族 5′末端扩增
Fig. 2 PCR products of 5′ end of BnMAPK7 gene family
M: trans2K plus DNA marker; 1: 5′末端的第 1轮 PCR扩增;
2: 5′末端的第 2轮 PCR扩增。
M: trans2K plus DNA marker; 1: 5′ end first PCR; 2: 5′ end nested
PCR.
图 3 BnMAPK7基因家族 3′A末端扩增
Fig. 3 PCR products of 3′A end of BnMAPK7 gene family
M: trans2K plus DNA marker; 1: 3′A末端的第 1轮 PCR扩增;
2: 3′A末端的第 2轮 PCR扩增。
M: trans2K plus DNA marker; 1: 3′A end first PCR, 2: 3′A end
nested PCR.
图 4 BnMAPK7基因家族 3′B末端扩增
Fig. 4 PCR products of 3′B end of BnMAPK7 gene family
M: trans2K plus DNA marker; 1: 3′B末端的第 1轮 PCR扩增;
2: 3′B末端的第 2轮 PCR扩增。
M: trans2K plus DNA marker; 1: 3′B end first PCR, 2: 3′B end
nested PCR.
图 5 BnMAPK7基因家族全长 cDNA扩增
Fig. 5 PCR products of full-length cDNA of BnMAPK7 gene family
M: trans2K plus DNA marker; 1: BnMAPK7-1 cDNA PCR扩增产
物; 2: BnMAPK7-3 cDNA PCR扩增产物; 3: BnMAPK7-2 cDNA
PCR扩增产物。
M: trans2K plus DNA marker; 1: PCR product of BnMAPK7-1
cDNA; 2: PCR product of BnMAPK7-3 cDNA; 3: PCR product of
BnMAPK7-2 cDNA.
图 6 BnMAPK7基因家族启动子扩增
Fig. 6 PCR products of promoters of BnMAPK7 gene family
M: trans2K plus DNA marker; 1: BnMAPK1启动子的扩增。
M: trans2K plus DNA marker; 1: amplifying of promoters of
BnMAPK7 gene family.
794 作 物 学 报 第 39卷
2.2 甘蓝型油菜 MAPK7基因启动子扩增与分析
以甘蓝型油菜基因组 DNA 为模板, 利用引物
FMAPK7-1P+RMAPK7-1P, 扩增得到 2 条电泳条带
(图 6)。每个电泳条带里只包含一种启动子序列, 大
小分别为 1452 bp (BnMAPK7-P1, JX827380.1)和 1058
bp (BnMAPK7-P2, JX827381.1)。采用 PlantCARE
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare
/html/)数据库分析(表 2 和表 3)显示, 甘蓝型油菜
MAPK7 基因启动子含有核心元件 TATA-box 和
CAAT-box 及多种与光诱导相关的顺式元件, 还含
有 TC-rich repeats、WUN-motif、HSE和 MBS等多
种胁迫相关的元件。此外, 还含有 TGA-element、
ABRE、TGACG-motif和 GARE-motif等与植物激素
相关的元件。
2.3 拟南芥和甘蓝型油菜、白菜 MAPK7 基因家
族的结构分析
甘蓝型油菜和拟南芥 MAPK7 基因家族 4 个基
因的最长标准 mRNA 为 1434~1695 bp, 甘蓝型油
菜、白菜和拟南芥 MAPK7 基因家族编码区(开放读
码框 ORF, 包括终止密码子)均为 1107 bp, 编码区
的 GC 含量为 41.6%~46.9%, 略高于非编码区(5′
UTR+3′ UTR)的 GC含量(33.3%~36.6%) (表 4)。
2.4 甘蓝型油菜和白菜 MAPK7 家族的同源性和
系统发生关系
2.4.1 核酸水平的同源性 Vector NTI上的两两
比对表明, 甘蓝型油菜MAPK7基因家族 3个成员全
长基因之间 mRNA 水平一致率为 76.6%~87.5%, 甘
蓝型油菜、白菜和拟南芥 MAPK7 基因家族编码区
水平的一致率为 90.2%~99.8%。NCBI Blastn 表明,
甘蓝型油菜 MAPK7 家族 3 个成员全长基因的
mRNA与 AtMPK7的同源性最高, Vector NTI计算的
mRNA 水平一致率为 70.7%~78.5%, 编码区水平的
一致率为 88.3%~88.6% (表 5), 在核酸水平, 它们还
与一些其他 AtMPK 基因有一定同源性 , 但均比
AtMPK7 低。基因水平的多重比对表明(图 7), 它们
在编码区的保守性显著高于非编码区的保守性 ,
5′UTR 和 3′UTR 中大部分区域变化较大, 这些特点
可能与基因表达活动有关。
2.4.2 蛋白水平的同源性 MAPKs 在蛋白水平
上非常保守。Vector NTI 上的两两比对表明, 甘蓝
型油菜和白菜 MAPK7家族 5个基因 ORF推导蛋白
之间的一致率为 95.9%~99.7%, 相似率为 98.1%~
100%, 只有少量的氨基酸不一样(图 8)。NCBI Blastp
表明, 甘蓝型油菜和白菜 MAPK7 家族 5 个蛋白与
AtMPK7蛋白的同源性最高, Vector NTI计算的一致
率为 96.2%~96.7%, 相似率均为 97.8% (表 6), 这进
一步证明了 MAPK7的保守性。
2.4.3 系统发生关系 系统进化分析表明 ,
BnMAPK7-1和 BnMAPK7-2首先聚在一起, 与白菜
MAPK7 (Bra037234)形成芸薹属 MAPK7 第一个分
支; BnMAPK7-3与白菜 MAPK7 (Bra039629)也聚在
一起, 形成芸薹属 MAPK7第 2个分支; 但是, 芸薹
属 MAPK7 第 2 个分支先与拟南芥 AtMPK7 聚在一
起后, 再与芸薹属MAPK7第 1个分支形成十字花科
分支(图 9)。该结果表明, 芸薹属的 5 个 MAPK7 基
因和 AtMPK7互为垂直同源基因(orthologs), 并且推
测甘蓝型油菜 MAPK7-1/2 来自白菜 MAPK7
(Bra037234), 而甘蓝型油菜 MAPK7-3 来自白菜
MAPK7(Bra039629)。理论上, 芸薹属的 2组 MAPK7
基因是由芸薹属祖先中的 1 个 MAPK7 基因在芸薹
属与拟南芥属分开后通过基因加倍而产生的, 但从
进化树看, 芸薹属 MAPK7 第 2 个分支跟 AtMPK7
的遗传距离比芸薹属 MAPK7 两个分支还要近, 这
可能是芸薹属祖先中的 1 个 MAPK7 基因在芸薹属
与拟南芥属分开后的基因加倍过程中, 一些基因比
较保守地保留了下来, 而另外一些基因发生了较大
的变化。同时可看到, 在芸薹属MAPK7两个分支中,
甘蓝型油菜 MAPK7 基因几乎没产生遗传距离, 而
白菜 MAPK7 都产生了遗传距离, 这说明在白菜和
甘蓝杂交形成甘蓝型油菜后, 白菜中的 MAPK7 还
产生了较大的进化。从进化树还可看出, 拟南芥、
白菜和甘蓝型油菜这些同属于十字花科芸薹族物种
的 MAPK 的进化关系相比其他物种, 如棉花和葡萄
等要更为接近一些。
2.5 甘蓝型油菜 MAPK7 基因组织特异性表达特
征
实时荧光定量 PCR 检测发现 , 甘蓝型油菜
MAPK7 基因在检测的器官中均有表达 (图 10)。
BnMAPK7-1/-2基因在子叶中的表达量最高, 在荚果
皮和花后 30 d种子中的表达量略低, 而在根、下胚
轴、花和花后 15 d种子中的表达量约为子叶的 1/2,
在茎、叶和花后 45 d种子中的表达量较低, 其中在
茎中的表达量最低, 仅为子叶的 1/4。BnMAPK7-3
基因在花后 15 d种子中的表达量最高, 在子叶中的
表达量略低, 而在花、荚果皮和花后 30 d种子中的
表达量约为花后 15 d种子的 1/2, 在下胚轴、茎、叶、
表 2 BnMAPK7-1和 BnMAPK7-2基因启动子序列分析
Table 2 Analysis of promoter sequences of BnMAPK7-1 and BnMAPK7-2 gene
元件名称
Site name
来源物种
Organism
位置
Position
正反链
Strand
匹配度
Matrix score
序列
Sequence
功能
Function
BnMAPK7-1
CAAT-box Glycine max –63 + 5 CAATT Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
TATA-box Arabidopsis thaliana –88 + 6 TATAAA Core promoter element around -30 of transcription start
circadian Lycopersicon esculentum –107 + 6 CAANNNNATC Cis-acting regulatory element involved in circadian control
Skn-1_motif Oryza sativa –167/–758/–1263 + 5 GTCAT Cis-acting regulatory element required for endosperm expression
TC-rich repeats Nicotiana tabacum –427 + 9 ATTCTCTAAC Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
WUN-motif Brassica oleracea –538 – 9 TCATTACGAA Wound-responsive element
TGA-element Brassica oleracea –544 – 6 AACGAC Auxin-responsive element
HSE Brassica oleracea –567/–1053/–1091 + 9 AAAAAATTTC Cis-acting element involved in heat stress responsiveness
TCT-motif Arabidopsis thaliana –559 + 6 TCTTAC Part of a light responsive element
AE-box Arabidopsis thaliana –574 + 8 AGAAACAA Part of a module for light response
MBS Arabidopsis thaliana –597/–890 + 6 TAACTG /CAACTG MYB binding site involved in drought-inducibility
ABRE Arabidopsis thaliana –669/–1245/–1268 + 6 TACGTG /CACGTG Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
Box 4 Petroselinum crispum –738/–1036/–1125 + 6 ATTAAT Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
ARE Zea mays –1073 + 6 TGGTTT Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
G-box Brassica napus –1270 – 9 ACACGTGGC Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
TGACG-motif Hordeum vulgare –1362 + 5 TGACG Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
GAG-motif Arabidopsis thaliana –1388 + 7 AGAGAGT Part of a light responsive element
Box I Pisum sativum –1409 + 7 TTTCAAA Light responsive element
BnMAPK7-2
CAAT-box Glycine max –60 + 5 CAATT Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
circadian Lycopersicon esculentum –105 + 6 CAANNNNATC Cis-acting regulatory element involved in circadian control
HSE Brassica oleracea –123/–567 + 9 AAAAAATTTC Cis-acting element involved in heat stress responsiveness
Skn-1_motif Oryza sativa –165/–869 + 5 GTCAT Cis-acting regulatory element required for endosperm expression
TATA-box Lycopersicon esculentum –209 + 5 TTTTA Core promoter element around -30 of transcription start
TC-rich repeats Nicotiana tabacum –425 + 9 ATTCTCTAAC Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
ACE Petroselinum crispum –451 + 9 CTAACGTATT Cis-acting element involved in light responsiveness
WUN-motif Brassica oleracea –539 – 9 TCATTACGAA Wound-responsive element
TGA-element Brassica oleracea –545 – 6 AACGAC Auxin-responsive element
TCT-motif Arabidopsis thaliana –559 + 6 TCTTAC Part of a light responsive element
MBS Arabidopsis thaliana –599 + 6 TAACTG MYB binding site involved in drought-inducibility
GARE-motif Brassica oleracea –574 + 7 AAACAGA Gibberellin-responsive element
ABRE Arabidopsis thaliana –666/–851/–874 + 6 CACGTG Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
Box 4 Petroselinum crispum –735 + 6 ATTAAT Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
G-box Arabidopsis thaliana –851/–874 + 6 CACGTG Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
TGACG-motif Hordeum vulgare –968 + 5 TGACG Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
GAG-motif Arabidopsis thaliana –994 + 7 AGAGAGT Part of a light responsive element
Box I Pisum sativum –1015 + 7 TTTCAAA Light responsive element
796 作 物 学 报 第 39卷
表 3 甘蓝型油菜 MAPK7基因启动子元件比较分析
Table 3 Comparative analysis of MAPK7 genes promoter in B.napus
BnMAPK7-1P元件名称
Site name of BnMAPK7-1P
BnMAPK7-2P元件名称
Site name of BnMAPK7-2P
功能
Function
CAAT-box CAAT-box Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
TATA-box TATA-box Core promoter element around −30 of transcription start
Circadian circadian Cis-acting regulatory element involved in circadian control
Skn-1_motif Skn-1_motif Cis-acting regulatory element required for endosperm expression
TC-rich repeats TC-rich repeats Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
WUN-motif WUN-motif Wound-responsive element
TGA-element TGA-element Auxin-responsive element
HSE HSE Cis-acting element involved in heat stress responsiveness
TCT-motif TCT-motif Part of a light responsive element
MBS MBS MYB binding site involved in drought-inducibility
ABRE ABRE Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
Box 4 Box 4 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
G-box G-box Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
TGACG-motif TGACG-motif Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
GAG-motif GAG-motif Part of a light responsive element
Box I Box I Light responsive element
AE-box — Part of a module for light response
ARE — Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
— ACE Cis-acting element involved in light responsiveness
— GARE-motif Gibberellin-responsive element
表 4 BnMAPK7基因家族的基本特征
Table 4 Basic features of BnMAPK7 genes family
基因名称
Gene name
标准 mRNA的长度
Length of standard mRNA (bp)
编码区长度
Length of ORF (bp)
编码区 GC含量
GC content of ORF (%)
非编码区 GC含量
GC content of non-ORF (%)
BnMAPK7-1 1593 1107 46.8 36.4
BnMAPK7-2 1434 1107 46.9 33.3
BnMAPK7-3 1547 1107 46.0 39.3
Bra037234 — 1107 46.9 —
Bra039629 — 1107 46.1 —
AtMPK7 1695 1107 41.6 36.6
表 5 MAPK7基因间的 mRNA序列一致率(右上角, 斜线左边)、编码区一致率(右上角, 斜线右边)、蛋白一致率(左下角, 斜线左边)
和蛋白相似率(左下角, 斜线右边)
Table 5 mRNA sequence identities (upper right, left of oblique line), coding region identities (upper right, right of oblique line),
protein identities (bottom left, left of oblique line) and protein positives bottom left, right of oblique line) among MAPK7 genes (%)
Gene BnMAPK7-1 BnMAPK7-2 BnMAPK7-3 Bra037234 Bra039629 AtMAPK7
BnMAPK7-1 87.5/99.6 83.7/90.9 –/98.9 –/90.7 78.5/88.5
BnMAPK7-2 99.7/100 76.6/90.9 –/98.9 –/90.7 70.7/88.3
BnMAPK7-3 96.5/98.1 96.5/98.1 –/90.4 –/99.8 77.8/88.6
Bra037234 99.7/99.7 99.7/99.7 96.2/98.1 –/90.2 –/88.3
Bra039629 96.2/98.1 96.2/98.1 99.7/99.7 95.9/98.1 –/88.4
AtMAPK7 96.7/97.8 96.7/97.8 96.5/97.8 96.5/97.8 96.2/97.8
第 5期 朱 斌等: 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析 797
798 作 物 学 报 第 39卷
图 7 AtMPK7与芸薹属 MAPK7家族基因核苷酸序列的多重比对
Fig. 7 Multi-alignment of nucleotide sequences of AtMPK7and Brassica MAPK7 genes
图 8 AtMPK7与芸薹属 MAPK7家族蛋白氨基酸序列的多重比对
Fig. 8 Multi-alignment of amino acid sequences of AtMPK7 and Brassica MAPK7 proteins
第 5期 朱 斌等: 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析 799
图 9 甘蓝型油菜和白菜MAPK7家族与拟南芥(At)等植物的同
源蛋白的系统树
Fig. 9 Phylogenetic tree of B. npus and B. rapa MAPK7 fami-
lies proteins and homologous proteins from other plants
白菜: Bra027234 (BrMAPK7)和 Bra039629 (BrMAPK7); 拟南芥:
AtMAPK7 (NP_179409); 棉花: GhMAPK7 (ADI52622); 葡萄:
VvMAPK4 (XP_002276158)。
Brassica rapa: Bra027234 (BrMAPK7) and Bra039629
(BrMAPK7); Brassica oleracea: Bol036554 (BoMAPK2); Arabi-
dopsis thaliana: AtMAPK7 (NP_179409); Gossypium hirsutum:
GhMAPK7(ADI52622); Vitis vinifera: VvMAPK4
(XP_002276158).
蕾和花后 45 d种子中的表达量约为花后 15 d种子的
1/3, 而在根中的表达量最低, 约为花后 15 d种子中
的 1/7。比较甘蓝型油菜 MAPK7-1/-2 和 MAPK7-3
的表达模式, 发现它们比较相似, 在子叶中的表达
量均较高 , 在茎和叶中的表达量则较低 , 同时 , 它
们也存在不同之处, BnMAPK7-1/-2在根中表达水平
中等, 而 BnMAPK7-3在根中表达量最低。
2.6 甘蓝型油菜 MAPK7 基因家族植物激素和逆
境诱导表达特征
在不同的外源诱导条件下, 甘蓝型油菜 MAPK
7-1/2 和 MAPK7-3 有不同的应答反应(图 11)。在植
物激素脱落酸 (ABA)处理后 , BnMAPK7-1/-2 和
BnMAPK7-3 基因的表达模式, 均呈上升趋势, 并在
8 h表达量达最高(图 11-a)。在茉莉酸甲酯(MeJA)诱
导处理后, BnMAPK7-1/-2 和 BnMAPK7-3 基因均呈
先上升后下降的表达模式, 但 BnMAPK7-1/-2 在诱
导 0.5 h后, 表达量持续上升, 在 4 h达到高峰, 在 8
h出现下降的趋势, 而 BnMAPK7-3在 1 h即达到高
峰, 在 2 h有所下降, 但随后一直持续比对照 0 h高
(图 11-b)。在喷施水杨酸(SA)后, BnMAPK7-1/-2 和
BnMAPK7-3 基因表达量均在短时间内上调, 其中
BnMAPK7-1/-2在 2 h达高峰, BnMAPK7-3在 0.5 h
达高峰, 随后均持下降趋势, 并且恢复到 0 h的水平
(图 11-c)。
在逆境条件下 , 甘蓝型油菜 MAPK7-1/-2 和
M A P K 7 - 3 基因的表达也发生变化。损伤后 ,
图 10 BnMAPK7基因家族组织特异性检测
Fig. 10 Tissue specificities in various organs tested of BnMAPK7 gene family
Ro: 根; Hy: 下胚轴; Co: 子叶; St: 茎; Le: 叶; Bu: 蕾; Fl: 花; SP: 荚果皮; 15DAF: 花后 15 d种子; 30DAF: 花后 30 d种子; 45DAF:
花后 45 d种子。
Ro: root; Hy: hypocotyl; Co: cotyledon; St: stem; Le: leaf; Bu: bud; Fl: flower; SP: silique pericarp; 15DAF: seed at 15 days after flowering;
30DAF: seed at 30 days after flowering; 45DAF: seed at 45 days after flowering.
800 作 物 学 报 第 39卷
图 11 不同的外因诱导下 BnMAPK7基因家族 mRNA水平的变化
Fig. 11 BnMAPK7 gene family mRNA expression with different treatments
BnMAPK7-1/-2 和 BnMAPK7-3 的表达量均上调, 并
在 0.5 h达到最高, 随后呈下降趋势, 但在 8 h的表
达量均比对照 0 h高(图 11-d)。在高温下, BnMAPK
7-1/-2 和 BnMAPK7-3 的表达量也上调 , BnMAPK
7-1/-2在诱导 1 h达高峰, BnMAPK7-3在诱导 2 h达
高峰, 随后均有所下降, 在 8 h均下降到比对照 0 h
更低的水平(图 11-e)。喷施 H2O2后, BnMAPK7-1/-2
和 BnMAPK7-3的表达量迅速上调, 在 0.5 h达最高,
第 5期 朱 斌等: 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析 801
随后量呈下降趋势, 在 4 h恢复到 0 h的水平, 但在 8
h 却又出现上升趋势(图 11-f)。在真菌核菌盘(Sclero-
tinia sclerotiorum) 的 诱 导 下 , BnMAPK7-1/-2 和
BnMAPK7-3 基因上调相对较缓慢, 在 3 h 略有上调,
而在 12 h, BnMAPK7-3 表达量达到最大, 在 24 h,
BnMAPK7-1/-2 表达量达到高峰, 随后表达量均下降,
在 48 h恢复至接近原来的水平(图 11-g)。
本研究分析表明, 植物激素脱落酸、水杨酸、
茉莉酸甲酯, 逆境因子损伤、高温、真菌核菌盘以
及信号分子 H2O2 均可诱导 BnMAPK7-1/-2 和
BnMAPK7-3 的表达 , 并且不同诱导条件下 ,
BnMAPK7 基因家族不同成员间的表达模式也比较
相似。
2.7 甘蓝型油菜 MAPK7 基因家族在 E. coli 中
的表达
2.7.1 甘蓝型油菜 MAPK7 基因家族原核表达载体
构建 以包含 BnMAPK7-1和 BnMAPK7-3全长基
因的质粒为模板, 分别扩增得到两条电泳条带, 经
测序证明, 分别对应 BnMAPK7-1 和 BnMAPK7-3 的
开放阅读框 (图 12)。用限制性内切酶双酶切质粒
pET28a 后, 得到一条比 pET28a 质粒略大的载体骨
架(图 13), 双酶切质粒 pGEM-MAPK7-1 和 pGEM-
MAPK7-3, 均得到一条比对照质粒略大的条带和一
条约为 1100 bp 的目的基因片段(图 14), 将 pET28a
载体骨架和目的基因片段连接后 , 转化大肠杆菌
DH5α, 通过酶切鉴定, 均得到与载体骨架和目的基
因片段大小一致的 2条带(图15), 说明得到了重组质
粒 pET28a-MAPK7-1 和 pET28a-MAPK7-3, 可用于
后续转化表达菌株 BL21。
图 12 甘蓝型油菜 pMAPK7-1和 pMAPK7-3扩增
Fig. 12 Amplification of pMAPK7-1 and pMAPK7-3 from
B.napus
M: trans2K plus DNA marker; 1: pMAPK7-1 PCR 扩增产物;
2: pMAPK7-3 PCR扩增产物。
M: trans2K plus DNA marker; 1: PCR product of pMAPK7-1;
2: PCR product of pMAPK7-3.
图 13 质粒 pET28a的双酶切
Fig. 13 Double enzyme digest of pET28a plasmid
M: trans2K plus DNA marker; 1: pET28a质粒; 2: pET28a酶切。
M: trans2K plus DNA marker; 1: plasmid of pET28a; 2: enzyme
digest of pET28a.
图 14 质粒 pGEM-MAPK7-1和 pGEM-MAPK7-3的双酶切
Fig. 14 Double enzyme digest of pGEM-MAPK7-1 and
pGEM-MAPK7-3 plasmid
M: trans2K plus DNA marker; 1: pGEM-MAPK7-1 质粒;
2: pET28a酶切; 3: pGEM-MAPK7-3质粒;
2: pGEM-MAPK7-3酶切。
M: trans2K plus DNA marker; 1: plasmid of pGEM-MAPK7-1;
2: enzyme digest of pGEM-MAPK7-1; 3: plasmid of
pGEM-MAPK7-3; 4: enzyme digest of pGEM-MAPK7-3.
图 15 质粒 pET28a-MAPK7-1 and pET28a-MAPK7-3的
双酶切
Fig. 15 Double enzyme digest of pGEM-MAPK7-1 and
pET28a-MAPK7-3 plasmid
M: trans2K plus DNA marker; M1: λ-Hind III DNA marker;
1: pET28a-MAPK7-1质粒; 2: pET28a-MAPK7-1酶切;
3: pET28a-MAPK7-3质粒; 2: ET28a-MAPK7-3酶切。
M: trans2K plus DNA marker; M1: λ-Hind III DNA marker,
1: plasmid of pET28a-MAPK7-1; 2: enzyme digest of
pET28a-MAPK7-1, 3: plasmid of pET28a-MAPK7-3;
4: enzyme digest of pET28a-MAPK7-3.
802 作 物 学 报 第 39卷
2.7.2 目的蛋白的表达及其可溶性分析 SDS-
PAGE结果显示, 得到了约 45.0 kD的条带, 理论上
BnMAPK7-1和 BnMAPK7-3蛋白质含有 368个氨基
酸, 加上 pET28a载体上的 His Tag和 T7 Tag标签,
表达蛋白的大小约为 44.2 kD, 与电泳结果相符, 作
为对照的 BL21 菌液和含空白载体 pET28a 的 BL21
菌液在 45.0 kD 附近均未发现有明显的蛋白条带,
说明 BnMAPK7-1 和 BnMAPK7-3 蛋白成功地在
BL21中得到表达(图 16)。此外, 从图中也可以看出,
BnMAPK7-1 蛋白的表达量随时间的增加而增加 ,
诱导 6 h使蛋白量达到最大; 而 BnMAPK7-3蛋白在
2 h就被大量表达, 在 4 h表达量达到最大。分别取
细胞破碎后的上清液和沉淀进行 SDS-PAGE 电泳,
发现诱导表达的蛋白主要存在于细胞破碎后的沉淀
中, 因此可以确定诱导表达蛋白主要是以包涵体形
式存在(图 17)。
图 16 BnMAPK7蛋白的 SDS-PAGE检测
Fig. 16 SDS-PAGE analysis of BnMAPK7 protein
M: unstained protein molecular weight marker; CK1: BL21菌液;
K2: pET28a空白载体菌液; 1~3: pET28a-MAPK7-1分别诱导 2、
4和 6 h; 4~6: pET28a-MAPK7-3分别诱导 2、4和 6 h。
M: unstained protein molecular weight marker, CK1: BL21; CK2:
pET28a; 1–3: pET28a-MAPK7-1 after inducted 2, 4, and 6 h,
4–6: pET28a-MAPK-3 after inducted 2, 4, and 6 h.
3 讨论
甘蓝(B. oleracea, 2n=CC=18)与白菜(B. rapa,
2n=AA=20)的共同祖先于 1300~1700 万年前通过基
因组倍增方式使得自身基因组复杂化[15-16], A 染色
体组与 C染色体组于 400万年前完成分化[17]。然后,
甘蓝和白菜通过天然种间杂交再加倍而形成异源四
倍体物种甘蓝型油菜(B. napus, 2n=AACC=38)[18]。
此外, 近年来关于同为十字花科的模式植物拟南芥
(Arabidopsis thaliana)与芸薹属的比较基因组学研究
表明, 芸薹族祖先曾发生了基因组水平的三倍化[19]。
基于该假说, 一般推测在芸薹属二倍体物种存在约
3 个垂直同源基因与拟南芥的单个基因相对应 ,
图 17 BnMAPK7蛋白的可溶性检测
Fig. 17 Soluble analysis of BnMAPK7 protein
M: unstained protein molecular weight marker; CK1:
pET28a-MAPK7-1总蛋白; CK2: pET28a-MAPK7-3总蛋白;
1: pET28a-MAPK7-1上清; 2: pET28a-MAPK7-1沉淀;
3: pET28a-MAPK7-3上清; 4: pET28a-MAPK7-3沉淀。
M: unstained protein molecular weight marker; CK1: total ex-
pressed protein of pET28a-MAPK7-1; CK2: total expressed protein
of pET28a-MAPK7-3; 1: supernatant liquid of pET28a-MAPK7-1;
2: deposition of pET28a-MAPK7-1; 3: supernatant liquid of
pET28a-MAPK7-3; 4: deposition of pET28a-MAPK7-3.
而甘蓝型油菜与拟南芥间的这种对应关系就应为
6∶1。不过, 上述属内种间以及属间进化关系的确
立, 过去主要是基于分子标记和传统进化手段来研
究, 尚缺乏基于不同物种间基因家族克隆的功能比
较基因组学研究的证据的支撑。本研究从 BRAD数
据库的白菜基因组中获得 2条MAPK1基因, 可能是
白菜中的MAPK1基因三倍化后, 有 1条基因发生了
片段化, 只保留了 2 条。在数据库 BRAD 的甘蓝基
因组中, 没找到与 AtMPK7 垂直同源的基因, 可能
是在甘蓝中, MAPK7 基因已经完全退化消失, 它的
功能完全被其他基因所替代。从甘蓝型油菜基因组
中分离出 3 条的 MAPK7 基因 , 在核酸水平上 ,
BnMAPK7-1/-2与白菜中的Bra037234的编码区一致
率达到 98.9%, 大于与 Bra039629 的一致率 ;
BnMAPK7-3与白菜中的 Bra039629的编码区一致率
达到 99.8%, 大于与 Bra037234 的一致率(表 6)。在
ORF 推导的蛋白上 , BnMAPK7-1/2 与白菜中的
Bra037234的一致率和相似率均为 99.7%, 均大于与
Bra039629 的一致率和相似率; BnMAPK7-3 与白菜
中的 Bra039629 的一致率和相似率均为 99.7%, 均
大于与 Bra037234的一致率和相似率(表 6)。从系统
树来看, BnMAPK7-1/2 也先跟白菜中的 Bra037234
聚在一起 , 形成芸薹属 MAPK7 第一个分支 ;
BnMAPK7-3 则先与白菜 MAPK7 (Bra039629)聚在
一起, 形成芸薹属 MAPK7 第 2 个分支(图 9)。这些
证据都表明, 甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成甘
第 5期 朱 斌等: 甘蓝型油菜 MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析 803
蓝型油菜后, 甘蓝型油菜 MAPK7 基因全部来自于
白菜, 而且 BnMAPK7-1/-2 是由白菜 Bra03723 祖先
基 因 加 倍 产 生 的 , BnMAPK7-3 是 由 白 菜 中
Bra037234的祖先基因进化形成。同时, 这些证据也
很好地证明甘蓝和白菜经历天然杂交和自然加倍 ,
形成甘蓝型油菜这一说法[18]。
甘蓝型油菜 MAPK7-1/-2 基因启动子含有核心
元件 TATA-box和CAAT-box及多种与光诱导相关的
顺式元件 TCT-motif, Box 4, G-box, GAG-motif, Box
I, AE-box和 ACE, 表明 MAPK7基因可能与光信号
响应有关(表 2~表 4)。含有响应防御与胁迫的 TC-
rich repeats元件和响应外界伤害的元件WUN-motif,
说明它们在甘蓝型油菜抵御逆境胁迫的过程中可能
发挥着重要作用。含有响应热胁迫的 HSE元件和响
应干旱的 MYB转录因子结合位点 MBS元件, 说明
MAPK7在甘蓝型油菜响应高温干旱环境时起作用。
含有生长素响应元件 TGA-element 和赤霉素响应的
元件 GARE-motif, 说明 MAPK7 基因可能参与调节
植株的生长发育; 响应脱落酸(ABA)的顺式作用元
件 ABRE, 推测甘蓝型油菜 MAPK7 基因可能与
ABA 信号途径相关; 含有响应 MeJA 的 TGACG-
motif元件, 推测甘蓝型油菜MAPK7可能通过MeJA
途径对外界胁迫起作用 ; 此外 , 甘蓝型油菜
MAPK7-1/-2 基因启动子还含有厌氧诱导必不可少
的顺式作用元件 ARE, 参与昼夜节律控制的顺式作
用元件 circadian, 胚乳形成所需的顺式调控元件
Skn-1_motif。
本研究发现 MAPK7基因在白菜型油菜的 11个
组织器官中均能表达(图 10), 即MAPK7在甘蓝型油
菜中可能为组成型表达基因, 然而它在不同器官中
呈现出不同的表达量, 这可能与 MAPK7 在不同组
织中所参与的生物学功能重要程度有关, 亦可能是
在表达量较低的组织中 MAPK7 所发挥的功能能够
被同族的其他蛋白替代或补充。
其他植物中的 MAPK基因在损伤诱导几分钟内
表达量即有明显的升高 [20-24], 如拟南芥 AtMAPK4
and AtMAPK6在损伤诱导下 5~10 min表达量即达到
最大[21], 而拟南芥 AtMAPK1/2却在诱导 2 h后才出
现表达高峰[10]。在本研究中, 甘蓝型油菜 BnMAPK7
对损伤的反应与其他植物中的 MAPK 相似, 非常迅
速, 在诱导 0.5 h即达最高峰, 随后呈下降的状态。
这些研究结果表明, BnMAPK7受损伤诱导而表达量
增加, 而且它很可能是初级做出响应的基因。
植物响应损伤是由茉莉酸途径诱导的[25-27]。在
甘蓝型油菜中, JA可以在较短时间内诱导BnMAPK4
表达水平升高, 与 AtMAPK4 在拟南芥中的作用有
相似处, 可能是油菜 JA/ET 途径中的重要元件[28]。
而在本研究中 , MeJA 也可以在较短时间内诱导
BnMAPK7 表达水平升高, 并与损伤和高温逆境诱
导下 BnMAPK7表达模式相似, 说明 BnMAPK7也可
能是油菜 JA/ET 途径中的重要元件, 推测 BnMAPK7
基因在通过激活 JA/ET 途径诱导油菜抗性的过程中
起重要作用。
H2O2 是 ABA 途径中的信号分子[29-30], 而拟南
芥的 AtMPK1/2 类似也同样受到 H2O2和 ABA 的诱
导[10]。在本研究中, BnMAPK7 基因的表达受 H2O2
和 ABA的诱导, 在 H2O2处理后, BnMAPK7基因的
表达量迅速上调, 在 0.5 h达到最高, 而在 1 h后则
呈缓慢下降的状态, 而在ABA诱导下, BnMAPK7基
因在 0.5 h 即呈持续上升的趋势, 而在损伤诱导下
MAPK7 的反应也非常迅速, 这说明在甘蓝型油菜
响应损伤过程中, ABA 和 H2O2可能也起一定作用,
并且可能参与调节 MAPK7基因的表达。
SA参与植物抗病、抗逆的过程[31]。在本研究中,
甘蓝型油菜经过 SA诱导处理后, 在 0.5 h即有所上
升, 并且一直保持较高水平, 推测 BnMAPK7基因可
能也参与 SA途径诱导油菜产生抗性。
Wang 等 [32]研究发现 , 超量表达甘蓝型油菜
MAPK4基因能够提高甘蓝型油菜抗菌核病的能力。
在本研究中, 接种核菌盘后, BnMAPK7 基因的表达
水平也有一定的上调, 推测在甘蓝型油菜抵抗菌核
病过程中, MAPK7具有与MAPK4相似的功能, 在诱
导甘蓝型油菜抗菌核病中起着重要作用。
不断有证据表明 , 同一途径里有多个 MAPKs
参与[33-35]。确实, 拟南芥中很多 MAPKs与 JA、H2O2
和 ABA 信号途径相关。有相关证据表明 , 虽然
AtMAPK4 不受茉莉酸甲酯的明显诱导, 但在茉莉酸
介导的途径中起作用[36]。AtMAPK3/6已被证明能够
被 H2O2所激活[37-39]。最新研究成果表明, ABA信号
途径中, 通过激活 AtMAPK3 的表达作用于 ABA 受
体, 从而阻止种子发芽中 ABA含量的升高[40]。这些
证据都表明 MAPKs 间交错形成的信号途径是很多
的[33], 这些复杂的MAPK信号网络造成很难确定某
个特定的 MAPK 特异地对某种激素或者某种逆境单
独起作用。这也很好地解析了单MAPK突变体有可能
出现多种表现[33], 也有可能不出现明显的表型[10]。
804 作 物 学 报 第 39卷
原核表达系统是迄今为止最为成熟可靠的蛋白
表达系统[41-42]。本研究在大肠杆菌中成功诱导表达
了甘蓝型油菜 MAPK7 基因, 并通过可溶性分析得
出该基因编码的蛋白以包涵体形式存在, 为后续的
目的蛋白的纯化和功能鉴定提供了基础。同时, 甘
蓝型油菜 MAPK7 基因在大肠杆菌中的成功表达也
证明该基因的编码框正确性, 为植物转化工作提供
了基础。为了进一步了解 MAPK7 基因在甘蓝型油
菜抗性机制中的作用, 我们将转化拟南芥和甘蓝型
油菜等植物载体, 进一步探索其功能, 为油菜育种
工作提供优良种质资源。
4 结论
从甘蓝型油菜中分离得到 MAPK7 基因家族 ,
该基因家族包括 BnMAPK7-1、 BnMAPK7-2 和
BnMAPK7-3。同时, 克隆得到 BnMAPK7-1/-2 的启
动子序列, 该启动子里含有多个与光诱导相关的元
件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。该基因家
族在各个器官里均表达, 说明该基因在植物体内各
个器官均起着重要作用。该基因家族的表达受植物
激素(MeJA、ABA和 SA)、信号分子(H2O2)、逆境(高
温)以及伤害(损伤和菌核病)的诱导, 初步证明甘蓝
型油菜 MAPK7 基因在油菜逆境胁迫应答中起一定
作用。在大肠杆菌中, 成功诱导表达了甘蓝型油菜
MAPK7基因, 并证明该基因编码的蛋白主要以包涵
体形式存在。
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