全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 2039−2045 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30270855)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王海波, E-mail: nkywanghb@yahoo.com.cn; 杨学举, E-mail: shmyxj@hebau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: hebgyp@163.com, Tel: 0312-87652133
Received(收稿日期): 2013-05-13; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-08-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130814.1415.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02039
水稻细胞悬浮系的中短期保存方法
高义平 1,2 吕孟雨 1 赵 和 1 杨学举 2,* 王海波 1,*
1河北省农林科学院遗传生理研究所 / 河北省植物转基因中心, 河北石家庄 050051; 2河北农业大学农学院, 河北保定 071000
摘 要: 细胞悬浮系的中短期保存广泛需要。本文应用中花 15细胞悬浮系, 比较了 AA、N6、MS三种固体培养基对
水稻细胞悬浮系的繁殖保存效果, 结果表明, AA固体培养基保存效果最好。细胞系可以在 AA0培养基上 4个月、在
AA0.5培养基上 6个月(中间 45 d左右继代一次)连续保存后仍然保持其可重悬性。通过比较 AA固体培养基繁殖保存、
冷冻保存、连续悬浮培养 3种保存方法, 表明 AA固体培养基繁殖保存细胞系 2~9个月内, 既可保持细胞的可悬浮性,
又对细胞系的 POD、SOD活性和植株再生率影响较小, 是一种理想的细胞悬浮系中短期保存方法。
关键词: 水稻; 悬浮细胞; 冷冻保存; 植株再生; POD活性; SOD活性
Short-medium Term Preservation of Rice Suspension Cells
GAO Yi-Ping1,2, LÜ Meng-Yu1, ZHAO He1, YANG Xue-Ju2,*, and WANG Hai-Bo1,*
1 Institute of Genetics and Physiology, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province,
Shijiazhuang 050051, China; 2 College of Agriculture, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China
Abstract: The preservation of cell suspension in short-medium term is widely needed in cell biology. In this paper, the preserva-
tion effects of cell suspension of rice cultivar Zhonghua 15 on AA, N6, and MS solid culture media were compared. The results
showed that AA medium was suitable for suspension cells preservation. The cell suspension still kept resuspensible after growing
continuously on AA solid medium for 4 months, and then on AA medium supplemented with 0.5 mg L–1 2,4-D for 6 months
(subcultured at about 45 d interval). Three kinds of methods of suspension cells preservation, namely preservation on AA solid
medium, cryopreservation, and continuously suspending culture, were compared. The results indicated that the first method kept
good suspensible property, had high regeneration rate, and had a little influence on activities of POD and SOD, even though the
suspension cells grew on AA medium for 2–9 months. AA solid medium is ideal for the preservation of suspension cells in
short-middle-term.
Keywords: Rice; Suspension cell; Cryopreservation; Plant regeneration; POD; SOD
水稻细胞悬浮系是用来开展水稻遗传学、蛋白
质组学和遗传改良研究的重要材料[1-2]。从愈伤组织
的诱导到悬浮系的建立一般需要4~6个月时间[3], 过
程繁琐。悬浮系的保存多年来一直是人们想解决而
又没有解决好的问题, 目前常用的保存方法是超低
温保存法。自 Sakai 1960年首次报道植物超低温保存
以来, 目前已建立了两步冷冻法[4-7]、玻璃化法[8-9]、
包埋脱水法[10-12]和包埋玻璃化法[13]等多种方法, 并
不断有改进冷冻保存方法的研究[14]。在超低温条件
下, 细胞的分裂和生理代谢近乎停止, 理论上可以
保持其遗传稳定性[15-17]。因此, 超低温保存被视为
长期保存细胞悬浮系最理想、有效的方法[18-22]。
细胞悬浮系如果作为资源材料长期保存, 超低
温保存非常合适 , 但是作为生物工程的实验材料 ,
经常仅需做短期或中短期保存, 例如, 试验中经常
遇到细胞悬浮系已经建好, 但2~3个月, 或者3~4个
月时间内暂不应用的情况, 如何在这一时间内保存
细胞悬浮系, 一般做法是要么冷冻保存, 要么继续
悬浮培养, 但超低温保存处理操作较复杂、再悬成
活率低, 不适于悬浮系的中短期保存, 继代悬浮培
2040 作 物 学 报 第 39卷


养又费时费力。对于细胞悬浮系的中短期保存的研
究一直未见报道。笔者将植物繁殖保存的概念引入
细胞系的保存, 以繁殖保存为思路, 将悬浮细胞系
继代到不同固体培养基, 通过在固体培养基上的简
单继代, 和后期的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶测
定及细胞系再生能力的检测, 找到了一种既能维持
细胞的适宜悬浮状态, 又操作方便、简单实用的中
短期保存方法。
1 材料与方法
1.1 供试材料和实验设计
粳稻品种中花15种子由中国农业科学院作物科
学研究所赵志超博士提供, 细胞悬浮系由本实验室
用成熟胚诱导建立。
实验设置固体培养基保存、冷冻保存和液体培
养基悬浮保存3种保存方法, 每个方法设3次重复。
1.1.1 固体培养基保存 以 AA、N6和 MS培养
基为基本培养基, 分别添加 0 mg L–1、0.5 mg L–1、
1.0 mg L–1和 2.0 mg L–1的 2,4-D, 形成 AA0、AA0.5、
AA1.0、AA2.0、N60、N60.5、N61.0、N62.0、MS0、MS0.5、
MS1.0、MS2.0 12种固体培养基, pH5.8, 蔗糖 3%, 琼
脂 0.5%。培养基经高压灭菌后倒入直径 6 cm 的培
养皿, 每个培养皿 16.0 g。称取 0.1 g细胞悬浮系分
别接种到上述 12种培养基上, 25℃暗培养。观察细
胞团生长情况, 测定 30 d 的生长量, 根据其在培养
基上的生长情况, 确定适宜的基本培养基及 2,4-D
用量。然后改用 9 cm培养皿, 每皿加入 36 g培养基,
接种 0.3 g细胞团, 根据愈伤组织质量和生长量情况
继代。记录每次继代间隔时间、适宜培养基的 2,4-D
用量。
1.1.2 冷冻保存 用AA + 0.26 μg L–1 ABA +
10%Pro + 5% DMSO + 10% 蔗糖预培养液对水稻悬
浮细胞预培养2 d, 然后利用冷冻保护剂10% DMSO
+ 10% PEG + 10% 蔗糖对悬浮细胞系冷冻前处理
1 h, 倒掉冷冻保护剂, 用滤纸吸去多余水分和冷冻
保护剂 , 装入无菌冷冻管 , 在液氮中速冻之后 , 放
入−80℃冰箱保存。
用 AA 10%蔗糖 + 2 mg L−1 2,4-D、AA + 8%蔗
糖 + 2 mg L−1 2,4-D、AA + 5%蔗糖 + 2 mg L–1 2,4-D
依次对悬浮细胞洗涤复苏 , 每次 20 min, 最后用
AA2.0液体培养基悬浮培养[5]。
1.1.3 悬浮继代保存 用 AA2.0 液体培养基悬浮
培养, 每隔 4~5 d继代一次。
1.2 不同保存时间细胞悬浮系的重新悬浮
对固体培养基培养和冷冻保存的细胞系, 分别
于 6 个月、9 个月、12 个月重新悬浮。每个细胞系
称取 0.4 g细胞团, 接种于 60 mL 瓶–1 AA2.0液体培
养基中, 25 , 110℃ 转 min–1暗培养, 并 3~5 d继代一
次, 每次继代时弃去下面大颗粒和静止后不能迅速
下沉的衰败细胞, 更换相同体积的新鲜培养液, 当
细胞分裂速度达到 4 d 增殖一倍时, 表明细胞团再
次进入快速分裂状态, 重悬成功。
1.3 重悬细胞系 SOD、POD活性测定
称取每个重悬完毕的细胞系 0.5 g接种于 MS +
6BA 4.0 mg L–1 + KT 2.0 mg L–1 + NAA 0.2 mg L–1 +
CuSO4⋅5H2O 1.5 mg L–1诱导分化培养基, 诱导植株
再生, 并于接种到分化培养基上的第 0、4、8、12、
16、20 d, 用南京建成生物工程研究所的植物组织铜
锌-超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、过氧化物酶
(POD)测试盒, 测定不同时期细胞团的 SOD和 POD
的活性。
1.4 重悬细胞系的植株再生
细胞团接种到分化培养基上后仍处于不断分裂
生长过程中, 每隔 25~30 d 将没有分化芽的愈伤组
织在分化培养基上继代, 有分化芽的愈伤组织留在
原培养基上, 待芽长 1 cm 左右, 接种到生根培养
基。经过连续 3至 4次继代, 完成植株分化。
2 结果与分析
2.1 不同固体培养基的培养效果
悬浮细胞团在固体培养基上经过 1个月的培养,
沙状愈伤组织逐渐减少, 形成松散、松软程度不等、
颜色由乳白色到浅黄色、黄色不同的团块(图 1)。可
以看出不同基本培养基对悬浮细胞系的培养效果差
异非常明显。其中 AA 培养基上的愈伤组织颜色乳
白、松脆、鲜艳亮泽, 分裂旺盛。MS培养基上的愈
伤组织浅黄、松散, 边缘颗粒黄色、较致密, 生长较
旺盛。N6上的愈伤组织后期生长速度较慢、褐化早,
愈伤组织状态介于 AA、MS之间。
2.1.1 不同培养基对细胞系可重悬性状的影响
以适宜重新悬浮为质量标准, 从 14 d、22 d、30 d的
愈伤组织颜色、光泽、松脆程度来判断愈伤组织的
质量, 从高到低的顺序为: AA > N6 > MS, 且 AA培
养基上的愈伤组织质量远远高于 N6和 MS, 非常适
合重新建立悬浮系; AA0、AA0.5、AA1.0、AA2.0 4种
培养基上的愈伤组织质量相近, 在适悬性上差别很
第 11期 高义平等: 水稻细胞悬浮系的中短期保存方法 2041



图 1 不同固体培养基对水稻悬浮细胞团的培养效果
Fig. 1 Culture effects of different culture media on the rice suspension cells

小。从适合悬浮角度看, 不同培养基的选择效果优
于不同 2,4-D剂量的选择效果。
2.1.2 不同培养基的保存效果 从 30 d称重结果
看, 愈伤组织生长速度从高到低的顺序为: AA2.0 >
AA1.0 > AA0.5 > AA0 > MS2.0 > MS1.0 > MS0.5 > N62.0 >
N61.0 ≈ MS0 > N60.5 > N60 (图 2)。从保存过程中需要
降低生长速度来看, 愈伤在 N6 培养基上生长最慢,
但从愈伤组织适于悬浮质量看, AA培养基上的愈伤
组织最佳, 所以下一步实验选用 AA 培养基进行了
继代保存方法的探索。

图 2 细胞悬浮系在不同培养基、不同 2,4-D剂量上的增重
Fig. 2 Increased weight of suspension cells on different culture
media, different 2,4-D levels

在 4种 AA培养基中, AA0既保存了细胞团的可
悬浮性, 又使细胞团分裂最慢, 适于悬浮细胞系继
代保存; MS培养基上生长的愈伤组织是朝分化方向
发展的, 可以用于悬浮细胞系的胚性恢复和分化。
2.2 利用 AA固体培养基的继代保存效果
根据悬浮细胞系第一次接种到固体培养基上的
生长情况, 后面的继代只在 AA0、AA0.5、AA1.0、AA2.0
4 种培养基上进行。以保持愈伤组织适于悬浮培养
状态为前提、以降低细胞分裂速度、延长继代间隔
时间为原则, 选取生长量大约 1.5 g以上、最低 2,4-D
剂量培养基上的愈伤组织进行继代。
结果显示, 细胞悬浮系在 AA0 培养基上连续继
代 3次, 降低分裂速度, 然后继代到AA0.5培养基上,
可以持续保持 1.5 g 月–1以上的生长速度, 并使继代
间隔时间达到 40~50 d, 这样一年内只需继代 9次。
具体保存方式为: AA 液 2.0 →AA0 30 d →AA0 45 d
→AA0 45 d →AA0.5 50 d →AA0.5 45 d →AA0.5 45 d
→AA0.5 40 d →AA1.0 45 d →AA2.0 20 d →AA 液 2.0重
悬, 见表 1。并且, 悬浮系在 AA培养基的继代过程
中, 没有明显的颗粒褐化现象。
参照表1, 可以推算细胞系在 AA培养基上保存
的时间, 以确定选用2,4-D的愈用量和继代的次数。
例如, 需要保存4个月的, 直接将细胞系继代到没有
激素的 AA 固体培养基上, 继代3次, 即可。
2.3 繁殖保存和冷冻保存细胞系重悬性质的差异
结果显示, 保存时间不同的细胞系重悬成功所
需时间不同, 无论是固体培养基还是冷冻保存的细
胞系, 保存的时间越长, 细胞再次进入高速分裂状
态所需时间越长(表2)。在固体培养基上保存的细胞
系 , 重悬速度显著快于冷冻保存的细胞系。6~9个
月之内固体 AA 培养基上的细胞团可悬浮性很好,
重新悬浮培养时没有褐化现象, 可以在一个月之内
得到一个良好的细胞悬浮系。在−80℃冷冻保存的
细胞悬浮系复苏、重悬时细胞团生长启动慢, 褐化、
衰败的细胞多, 重悬需要50 d左右。
2.4 不同保存方法对重悬细胞系 SOD和 POD活
性的影响
不同保存方法、不同保存时间重悬建立起来的
悬浮系的 SOD和 POD活性没有明显差异(图 3-A~F
中 0 d 的结果), 显示悬浮系细胞的状态相似, 没有
受到冷冻、长期悬浮和固体培养基保存 3 种不同方
式的影响。
3 种保存方法的重悬细胞系在分化培养基上的
POD活性规律明显。一是来自不同保存方法的细胞
系在分化培养基上 4 d时的 POD活性都呈上升趋势,
2042 作 物 学 报 第 39卷


表 1 悬浮细胞团在 AA培养基上多次继代的生长情况
Table 1 Growth situation of rice suspension cells on AA media in the course of subculture
继代次数
Subculture times
继代方向
Subculture direction
间隔时间
Interval time (d)
愈伤组织生长及变化趋势
Growth and change trend
1 AA液2.0→AA0, AA0.5, AA1.0, AA2.0 30 嫩黄鲜艳、松脆、生长旺盛; AA2.0上层愈伤生长最快、最早老化。
AA0上愈伤生长最慢, 以 AA0上愈伤进行继代.。
Calli thrived on all media were light yellow, bright, crisp. Calli on
AA2.0 grew the fastest and aged the earliest. Calli on AA0 grew the
slowest, so they were subcultured.
2 AA0→AA0, AA0.5, AA1.0, AA2.0 45 同上。The same as above.
3 AA0→AA0, AA0.5, AA1.0, AA2.0 45 AA0愈伤组织生长速度明显下降。
The growth rate of calli on AA0 medium decreased abviously.
4 AA0→AA0, AA0.5, AA1.0, AA2.0 50 AA0愈伤生长变缓, 最早暗淡、老化。改用AA0.5上的愈伤进行继代。
Calli on AA0 medium grew slowly, dimmed and aged the earliest.
Calli AA0.5 medium were subcultured instead.
5 AA0.5→AA0.5, AA1.0, AA2.0 45 AA0.5、AA1.0 和 AA2.0上的愈伤生长速度呈渐进趋势; AA2.0上的
愈伤生长最快、最早老化, AA0.5上愈伤生长最慢。
Callus growth rate increased with the increase of 2,4-D dosage.
Calli on AA2.0 medium grew the fastest and aged the earliest, calli
on AA0.5 medium grew the slowest.
6 AA0.5→AA0.5, AA1.0, AA2.0 45 随 2,4-D水平降低, 愈伤下部硬块增多、增大, AA2.0上硬质颗粒
2~3 mm, AA0.5上硬质颗粒 3~4 mm左右。
Lumps in the lower part of calli increased in number and volume
with the decrease of 2,4-D dosage. Compact lumps on AA2.0 were
2−3 mm, on AA0.5 were 3−4 mm.
7 AA0.5→AA0.5, AA1.0, AA2.0 40 AA0.5上愈伤鲜艳、松脆, 生长最慢, 以其进行继代; 随 2,4-D水
平升高, 愈伤更加鲜艳。
Calli on AA0.5 medium were bright, crisp, and grew the most slowly,
so they were used to subculture. Calli were more bright with the
increase of 2,4-D dosage.
8 AA0.5→AA0.5, AA1.0, AA2.0 45 愈伤生长状态、趋势同上; AA0.5 上愈伤底部硬块达到总量的约
1/3, 但不影响有足够适悬愈伤正常继代。
Growth state, trends of callus was the same as above; Lumps
reached one-third of the total calli on AA0.5 medium, there were still
enough suspensible calli to subculture.
9 AA1.0→AA2.0 25 准备重悬。Preparation for resuspension.
AA2.0→AA 液 2.0 重悬。Resuspenion.

后期 , 随着重悬之前保存时间和分化培养时间的
延长 , POD 活性上升趋势越来越明显。二是来自悬
浮培养的愈伤组织 POD 活性最高 , 变化最大 , 来
自冷冻保存的重悬细胞系在 4 d时快速累积后 , 后
期 POD 活性最低 , 变化幅度最小。来自固体培养
基的愈伤组织 POD 活性也逐渐增强 , 增加幅度居
于二者之间。三是随着保存时间和分化培养时间
的延长 , 3种保存方法重悬细胞系的 POD活性差异
越来越大。
分化培养基对细胞系的胁迫作用和细胞系分化
能力的差异是引起 POD累积和 3种来源细胞系 POD
值差异的主要原因。因此, 6个月繁殖保存与冷冻保
存细胞系的 POD差别较小, 显示其对分化培养基的
适应能力相近; 12个月繁殖保存细胞系的 POD值明
显高于冷冻保存细胞系的 POD值, 说明繁殖保存细
胞系的分化培养基适应能力已远不如冷冻保存细胞
系; 9 个月繁殖保存与冷冻保存的 POD 变化趋势居
于 6 个月与 12 个月之间, 分化培养后期 POD 值差
别增大。
SOD的活性4 d时上升, 之后保持了下降趋势,
随着在分化培养基上培养时间的延长, 悬浮保存与
繁殖保存细胞系 SOD下降趋势增强。3种保存方法
相比较, 细胞团重悬之前保存时间越长, SOD 活性
下降幅度越大。悬浮保存细胞团下降最多, 冷冻保
存的细胞团变化最小, 固体培养基保存的细胞系下
降的幅度居中。SOD 与 POD 的基本规律相似, 后
期变化方向相反 , 6个月冷冻保存和繁殖保存的细
胞系 SOD值相近, 9个月开始出现差异, 12个月差异
第 11期 高义平等: 水稻细胞悬浮系的中短期保存方法 2043


表 2 不同方式保存细胞系的重悬和植株再生情况
Table 2 Resuspension and regeneration of rice suspension cells preserved in different ways
保存方式 Preservation ways
重悬或再生
Resuspension or regeneration
保存时间(月)
Preservation time
(months)
固体培养基繁殖保存
Propagation preservation
on solid medium
冷冻保存
Cryopreservation
悬浮保存
Suspension preservation
6 22.3 ± 1.5 d 42.3 ± 3.5 b —
9 24.7 ± 3.5 d 43.0 ± 3.6 b —
重悬所需时间
Days of resuspension (d)
12 35.0 ± 3.6 c 47.7 ± 3.5 a —
6 37.3 ± 5.5 e 29.3 ± 3.5 f 42.3 ± 5.0 cd
9 45.0 ± 5.0 c 31.3 ± 3.5 f 49.3 ± 4.0 b
第一株幼苗出现
Days of emergence of
regenerated seedling (d) 12 51.7 ± 7.0 b 35.3 ± 6.5 de 56.7 ± 7.5 a
6 59.3 ± 5.5 e 71.3 ± 3.5 d —
9 69.0 ± 5.0 d 74.3 ± 4.5 c —
重悬到幼苗出现
Days from suspension to
seedling emergence (d) 12 86.7 ± 6.7 a 82.3 ± 5.1 b —
6 17.7 ± 4.0 a 19.3 ± 3.2 a 13.3 ± 3.8 c
9 15.0 ± 3.2 b 18.7 ± 2.9 a 8.3 ± 3.5 d
分化幼苗数
Regenerated seedling
number (plant) 12 4.7 ± 2.1 e 15.7 ± 4.0 b 2.7 ± 1.2 f
标以不同字母的数据在 P=0.05 水平差异显著。
Values followed by different letters are significantly difference at P=0.05.

图 3 不同保存方式的细胞悬浮系重新悬浮后在分化培养基上的 POD和 SOD活性
Fig. 3 POD and SOD activities of suspension cells preserved in different ways on regeneration medium
A、B、C: 保存 6个月、9个月、12个月的细胞团重悬系在分化培养基上的 POD活性变化; D、E、F: 保存 6个月、9个月、12个月
的细胞团重悬系在分化培养基上的 SOD活性变化。
A, B, C: POD activities of suspension cells in different preservation way in 6, 9, and 12 months; D, E, F: SOD activities of suspension cells in
different preservation way in 6, 9, and 12 months.

非常明显。
2.5 不同保存方法对植株再生效果的影响
保存6个月时固体培养基繁殖保存和冷冻保存
的幼苗分化数量没有显著差异(表2); 9个月时, 繁殖
保存和冷冻保存分化幼苗数量差异显著(未达极显
著水平); 12个月时, 繁殖保存幼苗分化率急剧下降,
冷冻保存的分化率也有下降。繁殖保存9个月与冷冻
保存12个月时的幼苗分化率相近。从进入分化培养
基到出现1 cm左右幼苗的时间看, 冷冻保存较繁殖
保存所用时间短, 从重悬到第一株再生苗出现的时
间看, 6个月和9个月两个保存期都是繁殖保存较冷
冻保存所用时间短。
2044 作 物 学 报 第 39卷


3 讨论
3.1 细胞悬浮系的 AA培养基中短期保存
细胞悬浮系的保存主要是降低细胞分裂速度并
维持其可悬浮性。本实验采用了降低 2,4-D 用量的
方式来降低细胞分裂速度, 用固体培养基代替悬浮
培养简化了操作过程。还可以采用降低生长温度的
方式来降低生长速度[23], 或二者同时并用。
AA 固体培养基适于细胞悬浮系的保存, 可能
原因之一是悬浮系来自 AA2.0 液体培养基, 细胞团
已经适应了这种培养基的营养吸收过程, 再者, 从
AA、MS 和 N6三种基本培养基的氮素营养来分析,
MS 的 NH4+/ NO3−比例较 N6高, 一般情况下还原态
氮有利于细胞分裂, 但 NH4+会伤害单细胞或小细胞
团的质膜 [24], 所以 MS 培养基上的细胞团生长快,
并更容易形成大的硬质颗粒来保护自己, 而 AA 培
养基的有机营养更利于小细胞团的吸收利用, 且作
用缓和, 这可能也是以氨基酸为氮源的培养基有助
于降低水稻悬浮细胞褐化程度的主要原因之一[25]。
与冷冻保存、继代悬浮培养比较, AA固体培养
基对细胞悬浮系的中短期保存, 避免了冷冻保存处
理的繁杂操作和再悬成活率低的问题, 节省了继代
悬浮的工作量。与重新诱导成熟胚建立细胞悬浮系
比较, 固体培养基保存节省了 3~5 个月的时间和工
作量。固体培养基繁殖保存的问题, 是随着细胞系
繁殖代数增多 , 引起遗传变异的几率增大 , 因此 ,
适于资源创新和遗传改良工作。
3.2 来自不同保存方法的重悬细胞系的 POD、
SOD活性差别
超氧化物歧化酶 (SOD)和过氧化氢酶 (POD)是
植物组织抗冻生理反应和愈伤组织分化生理反应的
重要指标 [26-28]。来自不同保存方法重悬细胞系的
SOD和 POD值没有明显差异, 说明重悬过程选择了
具有快速分裂能力的细胞, 这些细胞进入快速分裂
状态后的生理状态相近, 冷冻和冷冻保护剂 DMSO
的伤害作用已消失。9个月之后的冷冻保存与固体培
养基保存的重悬细胞团在分化培养基上的 POD、SOD
活性差异增大, 与其分化活力的差异相一致。重悬细
胞团接种到分化培养基前后的 POD 差异说明, 分裂
状态相近细胞团的分化能力可能存在很大差异。
对于适应了 AA2.0 液体培养基中有机氮源的细
胞团, 分化培养基中营养成分和激素的改变成为一
种逆境。长期悬浮细胞团在不断继代过程中, 分化
能力逐渐丧失 , 因此在分化培养上大量累积 POD,
来减轻伤害。保存 12个月的细胞团在分化培养基上
培养 20 d时, 大量细胞褐化死亡, POD活性降低。
来自冷冻保存的愈伤组织更多的细胞具有分化功能,
随着分化功能基因启动, 细胞内发生复杂的生理生
化变化, 来调节、适应新的培养基成分, POD积累速
度变小。固体培养基保存的愈伤组织在分化培养基
上的 POD活性居于二者之间。
SOD具有清除超氧阴离子自由基、保护组织免
受活性氧伤害的作用。细胞团继代到分化培养基 4 d
时, SOD活性提高, 随着培养时间延长, 具有分化功
能的细胞活化, 适应了分化环境, SOD 活性恢复到
继代时的状态 , 不具有分化能力的细胞很快衰败 ,
SOD活性降低。
4 结论
AA 固体培养基6~9个月之内保存的细胞团重悬
性好, 可以在1个月之内重悬出一个良好的细胞系。
AA 固体培养基保存与冷冻保存相比, 保存6个月细
胞系的 POD、SOD活性和植株再生率没有显著差异,
保存9个月的细胞系 POD、SOD 活性和植株再生率
出现显著(未达极显著)差异。AA固体培养基中短期
保存细胞悬浮系的方法简单、实用, 是保存悬浮细
胞系的理想培养基, 适于2~9个月, 尤其适于2~6个
月细胞悬浮系的保存。本实验室利用固体 AA 培养
基对日本晴和中花11悬浮系保存了8个月 , 结果显
示重悬和分化效果均较理想。
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