全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(12): 2162−2170 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102604), 国家国际合作项目(2009DFA30820, 2013DFA31600), 广西自然科
学基金项目(2011GXNSFF018002, 2013NXNSFAA019073), 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科产 1123008-1, 桂科攻 1222009-1B),
广西八桂学者特聘专家专项经费和广西农业科学院团队项目(桂农科 2011YT01)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨丽涛, E-mail: liyr@gxu.edu.cn; 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net
第一作者联系方式: E-mail: tanqinliang06@163.com
Received(收稿日期): 2013-01-29; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-09-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130929.1537.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02162
甘蔗 ABA信号转导关键酶 SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析
谭秦亮 1 李长宁 1,2 杨丽涛 1,2,* 李杨瑞 1,2,*
1 广西大学农学院 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁 530005; 2中国农业科学院甘蔗研究中心 / 农业部广
西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西作物遗传改良生物技术重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 广西南宁 530007
摘 要: 蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内 ABA 信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中
发挥着重要的作用。本研究利用 RT-PCR和 RACE-PCR技术, 克隆出编码甘蔗 SnRK2蛋白的基因 SoSnRK2.1。该基
因 cDNA序列全长为 1385 bp, 包含一个 1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测 SoSnRK2.1基因编码 333
个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是禾本科的玉米和水稻。构建该基因的
原核表达载体 pET-SoSnRK2.1, 在 IPTG诱导下可得到 38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量 PCR分析
表明, SoSnRK2.1基因在 ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和 H2O2外源胁迫下均呈诱导表达的
趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。
关键词: 甘蔗; SoSnRK2.1; 基因克隆; 原核表达
Cloning and Expression Analysis of Abscisic Acid Signal Transduction Key
Enzyme Gene SoSnRK2.1 from Sugarcane
TAN Qin-Liang1, LI Chang-Ning1,2, YANG Li-Tao1,2,* , and LI Yang-Rui1,2,*
1 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources / Agricultural College of Guangxi University, Nanning
530005, China; 2 Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy of Agri-
cultural Sciences / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Crop
Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007, China
Abstract: Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase (SnRK) is a key enzyme in the ABA signal transduction pathways,
which plays an important role in plant development under adverse environments. Reverse transcription-polymerase chain reaction
(RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) were applied to clone SoSnRK2.1. The cDNA full length of SoSnRK2.1
gene is 1385 bp, containing a 1002 bp complete open reading frame. The amino acids sequence analysis indicated that SoSnRK2.1
gene encodes 333 amino acids, sharing high homology with other species, especially gramineous of Zea mays and Oryza sativa.
We constructed the gene prokaryotic expression vector pET-SoSnRK2.1, and obtained the protein of 38 kD induced by IPTG,
which was consistent with the theoretical value. The result of Real time qPCR analysis showed that SoSnRK2.1 gene expression
was basically up-regulated under different stresses of ABA, PEG+ABA, PEG, NaCl, cold, and H2O2. It indicated that SoSnRK2.1
gene takes part in regulations of drought, highsalt, low temperature or other stress process, which may play an important role in
adaptation of plants to adverse stresses.
Keywords: Sugarcane; SoSnRK2; Gene cloning; Prokaryotic expression
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是典型的亚热
带作物。随着全球气候的多变性, 近年来干旱、低
温、盐碱和氧化等非生物胁迫因子的影响已成为制
约甘蔗产量和品质的关键因素。植物应答逆境胁迫
的过程是一个涉及多基因、多信号转导和多基因表
达产物的复杂过程 [1], 其中蛋白质的可逆磷酸化是
第 12期 谭秦亮等: 甘蔗 ABA信号转导关键酶 SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析 2163


植物受渗透逆境诱导的主要信号转导机制之一。在
蛋白质的磷酸化过程中, 蛋白激酶对植物的生长发
育起着重要的调控作用。
蔗糖非酵解型蛋白激酶(sucrose non-fermenting
1-related protein kinase, SnRK)广泛存在于植物中,
是一类丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 (serine/threonine
protein kinase), 参与植物体内多种信号途径转导中
的磷酸化。根据基因结构及蛋白序列同源性分析[2],
植物中 SnRK 相关蛋白激酶基因有 SnRK1、SnRK2
和 SnRK3共 3个家族, 其中 SnRK2和 SnRK3是植
物特有的蛋白激酶。SnRK2 家族基因在蛋白结构上
均含有非常保守的 Ser/Thr 酶活催化结构域 DFGY
SKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPE[3] 和 ATP 位 点
GXGXXGX, 且其 C端序列具有较高的多态性[4-5]。
通过对 ABA 信号转导通路中受体蛋白 PYR/
PYL/RCAR、蛋白激酶 PP2Cs 及蛋白磷酸激酶
SnRK2s 的不断研究发现[6-8], 当植物细胞中不存在
ABA 时, 受体蛋白 PYR/PYL/RCAR 不能与 PP2Cs
相互作用, PP2Cs 处于高活性状态并抑制其下游的
SnRK2s 的活性; 当植物受到外界的刺激或自身发
育产生 ABA后, 细胞中的 ABA会与受体蛋白 PYR/
PYL/RCAR结合, 使其构型发生变化进而使 SnRK2s
的活性得以释放, 处于激活状态的 SnRK2s 就可以
通过磷酸化作用激活下游的转录因子 , 正向调控
ABA信号应答基因的表达[9-11]。
大量研究证明, 编码 SnRK2蛋白激酶的基因是
参与植物逆境胁迫以及糖代谢调控的一类家族基
因 [12-14], 主要受水分胁迫和 ABA诱导[15-17]。在拟南
芥中 SnRK2.2、SnRK2.3 和 SnRK2.6 基因可以通过
磷酸化激活 bZIP 类转录因子, 使其增强与 ABA 应答
转 录 因 子 (ABA responsive transcription factors,
ABF/AREB)的结合从而参与干旱和 ABA 的诱导过
程[18,12], Umezawa等[19]证实 SnRK2.8可以被渗透胁迫
激活, 并且过量表达该基因的拟南芥抗旱性明显增
强。小麦 TaSnRK2.8 参与干旱、高盐、低温及 ABA
等信号转导的过程, 其过量表达可引起转基因植株根
部组织含水量、细胞膜稳定性、渗透势等抗逆境生理
的一系列变化[20]。此外, 有研究发现, 大豆中的 SnRK2
成员 SPK1和 SPK2可以被高渗透逆境诱导激活[21], 而
SPK3 和 SPK4 可被脱水和高盐激活[22]。由此说明
SnRK2家族基因与植物的抗逆性有密切的相关性。
近年来 , 已有报道在多种植物中克隆得到
SnRK2家族的相关基因, 但迄今未见甘蔗中ABA信
号转导途径中关键基因 SnRK2 克隆及功能分析报
道。本课题组前期应用基因芯片技术、RT-PCR 和
cDNA 末端快速扩增技术 (rapid amplification of
cDNA ends, RACE) 等 方法筛 选 和克隆 获 得
SoSnRK2.1 基因的 cDNA 全长, 同时构建原核表达
载体 pET-SoSnRK2.1, 并在大肠杆菌中进行 IPTG的
诱导表达。应用实时荧光定量技术对 SoSnRK2.1 基
因在ABA胁迫和 PEG+ABA胁迫下的表达模式进行
了研究, 以期为进一步研究该酶在甘蔗中的调控机
制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
选用甘蔗品种桂糖 21 (GT21), 取生长健壮、大
小一致的蔗茎在沙床中培育, 待苗长至三至四叶期
后, 一部分移栽至桶中水培; 一部分移栽至桶中土
培。当苗长至五至六叶期时选取长势一致时进行处
理, 水培处理如下: ABA胁迫(ABA stress, AS), 以叶
面喷施 100 μmol L–1 ABA; 干旱+ABA 胁迫(water
stress + AS, WAS), 于营养液中加入 25% (W/V)的
PEG-6000及叶面喷施 100 μmol L–1 ABA。土培处理
如下 : H2O2 胁迫 (H2O2 stress, HS), 以叶面喷施
10 mmol L–1 H2O2; 低温胁迫(cold stress, CS), 于
4℃低温冷库中处理 , 干旱胁迫(PEG stress, PS)和
NaCl胁迫(NaCl stress, NS)分别使用 PEG-600015%
(W/V)、NaCl (100 mmol L–1)做浇淋根部处理。在水
培处理后的 0、3、6、9、12和 24 h采集叶样(+1叶)
和幼嫩根系, 在土培处理后的 0、6、12 、24、48
和 72 h 采集叶样(+1 叶), 分装速冻于液氮中, 并于
－80℃冰箱保存备用。
1.2 甘蔗总 RNA提取及 cDNA第一链合成
采用 TRIzol试剂(Invitrogen) 提取甘蔗总 RNA,
参照购自 Clontech (634923)和 Formentas (K1622)公
司逆转录试剂盒说明合成 cDNA 第一链, 产物分别
用于基因 5′-RACE、3′-RACE和全长的克隆; 实时荧
光定量 PCR 的 cDNA 第一链的合成则按照 TaKaRa
(SYBR Premix Ex TaqII)的说明书操作。
1.3 SoSnRK2.1基因全长克隆
根据基因芯片中得到的 EST片段序列设计
3′-RACE和5′-RACE特异引物扩增该基因全长cDNA,
引物序列为: 3′-RACE: 5′-ACAGCAGGGCGATTCAG
TG; 5′-RACE: 5′-TTCACGCGAGGTGTTGGA。3′-RACE-
PCR结合接头引物 18AP (5′-GGCCACGCGTCGA
2164 作 物 学 报 第 39卷


CTAGTAC-3′), 及 5′-RACE-PCR结合Clontech Race
试剂盒提供的接头引物UPM (Universal Primer A
Mix), 分别进行SoSnRK2.1的3′和5′末端扩增 , 反应
体系含: 2× GoldStar Best MasterMix 25 μL、cDNA 2
μL、10 μmol L–1 Forward和Reverse引物各1 μL, 用
ddH2O补齐至50 μL。扩增程序为95℃预变性10 min;
95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 36个循
环; 72℃最后延伸10 min。PCR产物经1.5% 的琼脂
凝胶电泳检测 , 回收纯化目的条带 , 连接pMDl8-T
载体, 热激转化DH5α 感受态细胞, 通过蓝白斑筛选
挑取白色菌落, 经PCR验证后挑选几个阳性克隆送生
工生物工程(上海)公司测序, 3′-RACE和5′-RACE产物
共有149 bp的重叠序列, 用于后续全长拼接。
1.4 SoSnRK2.1 基因的生物信息学分析
用 BioXM2.6 预测基因氨基酸序列 ; ExPASy
(http://expasy.org/tools/)分析 SoSnRK2.1 蛋白质的基
本理化性质 ; 由 ScanProsite (http://prosite.expasy.
org/scanprosite/)预测蛋白质保守域 ; 由 Protscale
(http://web.expasy.org/protscale/)预测蛋白质的疏水
性 ; 由 NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/
services/NetPhos/)预测蛋白质磷酸化位点 ; 用
MEGA 5.0 程序(http://www.megasoftware.net/)进行
系统进化树分析。
1.5 SoSnRK2.1 基因原核表达
以 pET-30a(+) 作为表达载体, 根据 SoSnRK2.1
基因的 ORF (open reading frame)设计 SoSnRK2.1基
因原核表达载体构建的引物 , pETSn-F: 5-CGG
GGTACCATGGAGGAGAGGTACGAGGC-3和 pETSn-R:
5-CCGCTCGAGTCAGTAGGTGTCATCAGCGTCT-3
(斜体加下画线部分分别为N端Acc65 I和C端Xho I)
进行 PCR扩增。PCR体系参见步骤 1.3, PCR程序为
95℃预变性 10 min; 95℃变性 50 s, 66℃退火 50 s,
72℃延伸 90 s, 共 36个循环; 72℃延伸 10 min。PCR
产物经 1.5% 的琼脂凝胶电泳检测回收纯化后连接
pMDl8-T载体, 热激转化DH5α感受态细胞, 通过蓝
白斑筛选挑取白色菌落, 经 PCR 验证后挑选几个阳
性克隆送生工生物工程(上海)公司测序。选择测序正
确的菌液提取大量质粒, 然后与 pET30a(+)载体质
粒分别同时用 Acc65 I和 Xho I双酶切, 回收片段、
连接和转化。菌液检测和双酶切鉴定阳性单克隆 ,
获得重组质粒 pET-SoSnRK2.1, 酶切鉴定正确的重
组质粒需经测序验证后方可用于后续试验。
将构建好的重组质粒 pET-SoSnRK2.1与空载体
pET30a(+)质粒分别转化至表达菌株大肠杆菌
BL21(DE3), 经Kan抗性筛选, 提取重组质粒进行双
酶切鉴定和测序。将转化后的重组菌株接种至 LB
液体培养基中, 37℃培养振荡至OD值约 0.4~0.6, 以
终浓度为 1.0 mmol L–1的 IPTG在 37℃条件下分别诱
导表达 2、4、6 和 8 h, 以不加 IPTG 诱导的
pET-SoSnRK2.1和 pET30a(+)空载体作为对照。诱导
完成后以 6000×g 离心 , 收集沉淀加 150 μL 3×
SDS-PAGE 缓冲液裂解变性, 沸水浴 10 min, 冰上
冷却后取 15 μL 进行 SDS-PAGE 电泳分析(SDS-
PAGE浓缩胶浓度为 4%, 分离胶浓度为 12%)。
1.6 SoSnRK2.1基因在不同外源胁迫下的实时荧
光定量表达分析
根据获得的SoSnRK2.1基因全长序列设计荧光
定量PCR的特异性引物RT-SnF: 5′-GGTTTGTTTA
ACACCCACAC-3′, RT-SnR: 5′-ACCTGGACTCATC
TTCACTG-3′; 以已发表甘蔗看家基因GAPDH(EF
189713)为内参[23], 设计其引物序列为GAPDH-F: 5′-
TGGTGCTGACTATGTCGTGGA-3′, GAPDH-R: 5′-
CATGGGTGCATCTTTGCTTG-3′。反应体系20 μL
中含10 μL 2×Premix Ex Taq II; 2 μL cDNA; 4 μmol
L−1的正反向引物各1.0 μL、6.0 μL双蒸水; 扩增程序
为95℃预变性10 min; 95℃变性10 s, 60℃退火20 s,
72℃延伸20 s, 共40个循环。反应完成后进行溶解曲
线检验, 采用2−ΔΔCt法计算基因相对表达量。
2 结果与分析
2.1 SoSnRK2.1基因全长 cDNA克隆
以逆转录合成的 cDNA 为模板, 经 3′-RACE-
PCR和 5′-RACE-PCR分别扩增得到 1007 bp (图 1-A)
和 600 bp (图 1-B)片段, 对所得片段回收、连接、克
隆测序, 除去接头引物及重叠序列, 最后拼接得到
SoSnRK2.1基因全长 cDNA序列为 1385 bp, 基因登
录号为 JQ292841。序列分析显示 5′端已经包含起始
密码子且符合 Kozak法则, 3′端有典型的 poly (A)加
尾信号 , 包含完整的开放阅读框 (ORF), 长度为
1002 bp, 编码 333个氨基酸, 5′端非编码区长 125 bp,
起始密码子 ATG位于序列 126 bp处, 3′端非编码区
长 258 bp (图 2)。
2.2 序列生物信息学分析
利用Expasy工具分析显示 SoSnRK2.1编码蛋白
第 12期 谭秦亮等: 甘蔗 ABA信号转导关键酶 SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析 2165



图 1 SoSnRK2.1基因的扩增结果
Fig. 1 Amplified products of SoSnRK2.1 gene
A: 3′-RACE产物; B: 5′-RACE产物。
A: 3′-RACE amplified results; B: 5′-RACE amplified results.

等电点为 5.54, 分子量为 37.8 kD, 平均亲水系数
(GRAVY)为–0.437。ScanProsite 蛋白预测结果显示
其在第 5~261 位氨基酸之间存在蛋白激酶保守催化
域(图 3), 其中第 11~19 位和第 34 位氨基酸为 ATP
结合位点, 第 120~132 位氨基酸为丝氨酸/苏氨酸蛋
白激酶活化位点, 第 124位氨基酸为质子受体位点。
利用 Protscale对 SoSnRK2.1蛋白的疏水性预测发现,
蛋白质氨基酸链上第 192位络氨酸(Tyr-192)、第 193
位缬氨酸(Val-193)疏水性最强, 分值为 2.189; 分值
最低的是第 275位丙氨酸(Ala-275), 为–2.867。该蛋
白的亲水区域多于疏水区域, 为亲水蛋白质(图 4)。
NetPhos 2.0 Server 分析结果表明, SoSnRK2.1蛋白
有 11 处潜在丝氨酸磷酸化位点, 分别为第 97、第
101、第 135、第 159、第 173、第 231、第 232、第
247、第 306、第 322位氨基酸; 3处潜在苏氨酸磷酸
化位点, 分别为第 137、第 213、第 301位氨基酸; 8
处潜在络氨酸磷酸化位点, 分别为第 5、第 35、第
103、第 147、第 166、第 227、第 277、第 333位氨
基酸。

图 2 SoSnRK2.1基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide of coding seguence and predicted amino acid sequence of SoSnRK2.1
2166 作 物 学 报 第 39卷



图 3 SoSnRK2.1蛋白结构预测
Fig. 3 Putative protein structure of SoSnRK2.1


图 4 SoSnRK2.1疏水性预测
Fig. 4 Hydrophobicity prediction of SoSnRK2.1
纵轴正值为疏水区, 使用 Kyte-Doolittle算法来预测氨基酸的疏水值。
The positive numbers on the vertical scale stand for hydrophobic
regions, the hydrophobicity profile was constructed by using
Kyte-Doolittle algorithm.
将获得的 SoSnRK2.1 开放阅读框通过 NCBI
BlastX 比对表明 , 其与玉米(NP_001136496)、水稻
(BAD17999)、短柄草 (XP_003574349)、葡萄 (XP_
002262726) 、 大 豆 (XP_003549953) 和 高 粱 (XP_
002461041)的一致性/相似性依次为 93%/98%、93%/
92%、91%/86%、92%/84%、91%/82%和 90%/77%, 说
明 SoSnRK2.1与其他作物 SnRK2基因进化关系较近。
通过与拟南芥 SnRK2家族 10个基因的氨基酸聚类分
析发现 (图 5), SoSnRK2.1 与拟南芥 SnRK2.1、
SnRK2.4、SnRK2.5、SnRK2.9和 SnRK2.10先聚在一
起, 同属于拟南芥 SnRK2家族第一亚家族。

图 5 SoSnRK2.1蛋白的系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of SoSnRK2.1 proteins
进化树分支上的数字表示 Bootstrap验证中该分支可信度百分比, 括号内为 GenBank登录号。
The numeric values in each node represent percentage of homology amongst SnRK2s verified by bootstrap, and the GenBank
accession number of each protein is listed in the bracket.
第 12期 谭秦亮等: 甘蔗 ABA信号转导关键酶 SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析 2167


2.3 SoSnRK2.1基因的原核表达
使用引物 pETSn-F和 pETSn-R进行扩增, 以逆
转录成 cDNA为模板, 扩增得到约为 1002 bp的条带
(图 6-A)。对目的条带回收纯化, 连接 PMD18-T 后
测序结果表明, 该产物为 SoSnRK2.1 基因 ORF, 长
为 1002 bp。重组质粒 pET-SoSnRK2.1双酶切结果
(图 6-B)显示, 可切出约 1002 bp 左右片段, 所获片
段大小与预期结果相符, 表明 SoSnRK2.1 基因 ORF
已成功插入载体质粒中。将阳性克隆测序, 结果与
获得的基因比对完全一致 , 进一步证明 pET-
SoSnRK2.1 重组质粒构建正确, 表明 SoSnRK2.1 基
因的原核表达载体构建成功, 可进行下一步的表达
分析。
如图 7 所示, 经 IPTG 和不同时间诱导后均在
38 kD 处出现 pET-SoSnRK2.1融合蛋白, 与蛋白理
论分子量 37.8 kD 结果一致, 而对照没有融合蛋白
的表达。这说明 SoSnRK2.1 基因在原核生物大肠杆
菌中已被成功表达。

图 6 SoSnRK2.1基因的 PCR检测与双酶切验证
Fig. 6 SoSnRK2.1 PCR and recombinant analysis
M1: DL 2000 marker; M2: DL 10000 marker; 1: SoSnRK2.1 PCR
结果; 2: pET-SoSnRK2.1重组质粒; 3: pET-SoSnRK2.1重组质粒
的双酶切结果。
M1: DL 2000 marker; M2: DL 10000 marker; 1: SoSnRK2.1 PCR
analysis; 2: recombinant of pET-SoSnRK2.1 plasmid; 3: Digestion
of pET-SoSnRK2.1.

图 7 SoSnRK2.1 基因的原核表达
Fig. 7 Expression of recombinant SoSnRK2.1 protein
M: 蛋白 marker; 1: pET-30a(+)未诱导; 2: pET-30a(+)诱导 4 h; 3: pET-SoSnRK2.1未诱导; 4~7: pET-SoSnRK2.1 1.0 mmol L–1 IPTG诱导
2 h、4 h、6 h、8 h。
M: protein marker; 1: pET-30a(+) without induction; 2: pET-30a(+) with induction 4 hours; 3: pET-SoSnRK2.1 without induction; 4–7:
pET-SoSnRK2.1 1.0 mmol L–1 IPTG with induction for 2, 4, 6, and 8 h, respectively.

2.4 SoSnRK2.1基因在不同外源胁迫下的表达量
分析
应用实时荧光定量 PCR 技术, 以甘蔗 GAPDH
基因作为内参, 分析 SoSnRK2.1 基因在不同栽培技
术不同外源胁迫下不同时间内的表达量。由图 8 可
知, SoSnRK2.1基因在甘蔗叶片和根系中的表达模式
明显不同, 且水培条件下的表达量远远高于土培条
件下的表达量。随着处理时间的延伸 , 根系中
SoSnRK2.1基因在 AS和 WAS处理下均呈抑制表达
(图 8-B), 但在 WAS 处理下表达量的下降趋势明显
慢于 AS 处理。在无论水培或土培条件下不同胁迫
处理的叶片中, SoSnRK2.1基因均呈诱导表达, 但表
达量存在明显差异。在水培条件 AS和 WAS处理下
(图 8-A), 甘蔗叶片中 SoSnRK2.1基因的表达量均显
著提高, 且在 9 h 达到最大值, 约为对照表达量的
40倍, 随后出现表达低谷, 24 h 后表达量又出现回
升。在土培条件下各个处理中 SoSnRK2.1 基因表达
量明显低于水培条件 , 在 HS 处理中 (图 8-C),
SoSnRK2.1 基因表达量 12 h 达到最高值, 为对照的
1.93 倍, 随后表达量有些回落, 到 72 h 再次上升达
到较高值, 为对照的 1.78倍。在 WS处理中(图 8-D),
SoSnRK2.1 基因表达量在 12 h 出现第一次的高值,
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为对照的 2.00倍, 到 24 h有小幅度的下降, 出现整
个处理期内的最低值, 随后又回升, 48 h和 72 h表达
量均达到较高值, 分别为对照的 1.87倍和 1.75倍。
在NS处理中(图 8-E), SoSnRK2.1基因的表达量在 12 h
出现第一次高值然后有所下降, 后又再次逐渐增加,
到 72 h达最高值, 为对照的 2.65倍。在CS处理中(图
8-F), SoSnRK2.1基因表达量缓慢增长到 48 h出现最
高值, 为对照的 2.23倍, 随后 72 h表达量略下降。

图 8 不同处理条件下甘蔗叶片(A, C, D, E, F)和根系(B)中 SoSnRK2.1表达量变化
Fig. 8 Changes of SoSnRK2.1 gene expression in leaves (A, C, D, E, F) and roots (B) of sugarcane seedlings under different treatments
AS: ABA stress; WAS: water stress +AS; HS: H2O2 stress; NS: NaCl stress; CS: cold stress.

3 讨论
ABA 作为植物体内重要的生长激素, 不仅可以
调节植物的生长发育, 且在对逆境胁迫的响应中也
有着重要的作用, 且逆境胁迫响应机制的实现离不
开其复杂的信号转导途径的调节[24-25]。参与 ABA受
体 PYL/PYR/RCAR 介导的信号转导途径的相关酶
类很多, 蛋白激酶 SnRK2 就属于其中一类, 参与了
ABA信号转导途径中激活下游转录因子或膜蛋白等
作用因子的磷酸化过程[26-27]。
本研究克隆得到甘蔗 SoSnRK2.1 基因全长, 其
氨基酸序列与其他物种如玉米、水稻等具有很高的
同源性, 尤其是与水稻中起着 ABA信号转导作用的
SAPK3 同源性极高。这些结果说明 SoSnRK2.1 基因
可能与水稻[28,29]、小麦[30]及拟南芥[14]等植物中已研
究的 SnRK2 基因的功能相似, 可以响应水分胁迫、
渗透胁迫、低温胁迫等一系列逆境胁迫过程。分析
甘蔗 SoSnRK2.1 基因功能结构域发现, 在其氨基酸
序列上存在 ATP 结合位点和蛋白激酶保守催化域,
分别具有 11、3 和 8 处潜在的丝氨酸、苏氨酸、络
氨酸磷酸化位点。因此可以推断, 甘蔗 SoSnRK2.1
基因属于典型的 Ser/Thr蛋白激酶, 而存在的磷酸化
位点和 ATP 结合位点可能与 ABA 信号转导途径中
的蛋白磷酸化相关。此外, 本研究将甘蔗 SoSnRK2.1
基因与原核表达载体 pET30a(+)重组, 转入大肠杆
菌 BL21(DE3)中进行融合蛋白的诱导。分析表明, 甘
蔗 SoSnRK2.1 基因可在原核表达体系中得到正确表
达, 为制备单克隆抗体及后期的研究打下基础。
SnRK2基因是ABA信号转导途径中的关键调控
第 12期 谭秦亮等: 甘蔗 ABA信号转导关键酶 SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析 2169


酶, 它的激活在植物响应渗透逆境胁迫时发挥着重
要的作用[3]。本研究结果分析表明, 在受到各种外源
胁迫时甘蔗叶片中 SoSnRK2.1基因均得到诱导表达,
而在根中则受到抑制表达。随着处理时间的增加 ,
甘蔗叶片 SoSnRK2.1基因在受到 ABA、PEG+ABA、
H2O2、PEG、NaCl胁迫时表达量都先有一个大的增
幅, 有所下降后又逐渐上升, 而在受到低温胁迫时
表达量缓慢增加, 推测可能是甘蔗根部有土壤的保
护, 使来自外界的胁迫缓慢作用于甘蔗根部, 植物
体内启动抗逆境的过程也就比较缓慢, 具体原因还
有待进一步研究。由于 H2O2、PEG、NaCl和 4℃低
温对甘蔗的胁迫与甘蔗受氧化胁迫、干旱胁迫、盐
胁迫和渗透胁迫的效应相似。因此, 通过 SoSnRK2.1
基因表达调控的复杂性可以推测甘蔗 SoSnRK2.1 基
因可能受到甘蔗抗逆境胁迫多个途径调控。目前在
玉米 [31]、拟南芥 [32]、小麦 [15]和蚕豆 [4]等植物上对
ABA 信号转导途径和 SnRK2 蛋白激酶的研究已越
来越多, 但至今尚未见有关甘蔗 SnRK2 蛋白激酶
的研究在国内的报道。对该基因的上述研究可以为
进一步研究甘蔗 SoSnRK2.1 基因的功能及其在逆境
胁迫中的调控作用奠定一定的基础。
4 结论
甘蔗 SoSnRK2.1基因的全长为 1385 bp, 完整的
阅读框长度为 1002 bp, 编码 333个氨基酸, 预测分
子量为 37.8 kD, 为亲水性非跨膜蛋白质。该基因以
融合蛋白形式表达, 相对分子量约为 38 kD。不同外
源胁迫下不同时间甘蔗叶片中 SoSnRK2.1 基因都上
调表达, 推测该蛋白在甘蔗抗逆境胁迫机制中发挥
一定作用, 可作为研究甘蔗抗逆境的待选基因。
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