全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(3): 499506 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31340060), 福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划项目(JA14095)和国家现代农业产业技术体系
建设专项(CARS-20)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 阙友雄, E-mail: queyouxiong@126.com; 陈如凯, E-mail: fafu948@126.com
第一作者联系方式: E-mail: 373889724@qq.com
Received(收稿日期): 2014-07-14; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2014-12-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141230.0832.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00499
甘蔗 CIPK基因的同源克隆与表达
黄 珑 苏炜华 张玉叶 黄 宁 凌 辉 肖新换 阙友雄 陈如凯
福建农林大学 / 农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 / 国家甘蔗产业技术研发中心, 福建福州 350002
摘 要: CIPK (calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 该蛋白在植物响
应逆境胁迫中发挥着重要的作用, 尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米 CIPK15
基因(EU957447.1, 2247 bp)核酸序列保守区域设计 1对同源克隆 PCR引物, 以甘蔗品种崖城 05-179的 cDNA为模板, 通
过 RT-PCR 扩增得到甘蔗 CIPK 基因的一条全长 cDNA 序列(GenBank 登录号为 KM114052)。序列分析结果表明, 甘蔗
ScCIPK基因全长 1782 bp, 具有完整的开放阅读框(ORF, 91~1631 bp), 编码 513个氨基酸, 该基因具有 CIPK基因的 2
个特征结构域(Kc-like superfamily和 AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,
为可溶性蛋白, 不存在信号肽, 二级结构元件多为 α-螺旋, 含有多个保守功能域, 主要参与中间代谢。实时定量 PCR表
达分析表明, 该基因表达具有组织特异性, 虽在甘蔗各组织中均有表达, 但在芽中的表达量最高。该基因在 PEG、NaCl、
ABA、SA和 MeJA的胁迫诱导过程中, 受 ABA 胁迫后表达量最高, 约为对照的 5.3倍, 推测该基因的表达与甘蔗抗干
旱和抗渗透胁迫有关。
关键词: 甘蔗; CIPK基因; 同源克隆; 生物信息学; 实时定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of CIPK Gene in Sugarcane
HUANG Long, SU Wei-Hua, ZHANG Yu-Ye, HUANG Ning, LING Hui, XIAO Xin-Huan, QUE You-Xiong*,
and CHEN Ru-Kai*
Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University / Sugar-
cane Research & Development Center, China Agricultural Technology System, Fuzhou 350002, China
Abstract: CIPK (calcineurin B-like-interacting protein kinase) is a plant specific class of serine / threonine protein kinases, which
plays an important role in plant response to stress, especially relates with the signal transduction for biotic stresses (drought, high
salt, ABA). According to the primers designed on the conserved domain of CIPK15 gene from Zea mays, a full-length cDNA se-
quence of serine/threonine kinase gene termed as ScCIPK was cloned by RT-PCR method from sugarcane (Saccharum Complex).
The sequence analysis showed that ScCIPK had a length of 1782 bp containing the open reading frame (ORF, 91–1631 bp), which
encoded 513 amino acids residues with two conserved domains (Kc-like superfamily and AMPKA-C-like superfamily). The
characters predicted based on the bioinformatics analysis revealed that the ScCIPK gene of sugarcane was a soluble acidic protein,
which has two conserved functional domains with the main function for central_intermediary_metabolism, and its protein was
located in endoplasmic reticulum (membrane). The mainly secondary structure element was α-helix. Real-time quantitative
PCR(RT-qPCR) analysis revealed that the expression of ScCIPK was higher in bud than in other tissues, meanwhile the inducible
expression level of ScCIPK was most significantly up-regulated under the ABA stress, 5.3 times higher than that of control, which
suggested that ScCIPK most probably involves in sugarcane resistance to drought and osmotic stresses. The results in this study
could provide a basis of cloning and functional identification of other members of ScCIPK in sugarcane and promote the use of
ScCIPK gene in sugarcane genetic engineering.
Keywords: Sugarcane; CIPK; homology cloning; Bioinformatics; Real-time PCR
在适应复杂多变自然环境的进化中 , 植物已形成了
完善的信号转导网络。Ca+是植物信号转导网络中不可或
缺的第二信使 , 在介导植物生长发育的生理生化过程中
起着关键作用[1]。高等植物在响应外界的各种信号和胁迫
500 作 物 学 报 第 41卷
(光、干旱、激素等)时, 细胞内 Ca+水平会发生相应的变
化。前 人研 究发现 , 植物体内存在钙调素 CaM
(Calmodulin)及其相关蛋白、钙依赖性蛋白激酶 (Ca2+-
dependent protein kinases, CDPK)、钙调磷酸酶 B类蛋白
(calcineurin B-like protein, CBL) 3种 Ca+结合蛋白[2]。CBL
本身没有活性 , 在识别钙信号后 , 必须和靶蛋白 CIPK
(CBL-interacting protein kinase)结合形成复合体才能发挥
作用[3]。CIPK是植物特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,
属于第 3 类的 SnRK3 激酶(SNF1-related protein kinase3,
SnRK3)[4]。对模式植物拟南芥 CIPK蛋白的结构分析表明,
所有的 CIPK 蛋白含有 N-端的激酶蛋白域和 C-端的调节
域, 后者为 CBL 特异接合的 NAF 结构域[4]和能与 PP2C
相互作用的 PPI结构域[5]。这 2个结构域的结构特性使得
CIPK成为一个连接 CBL蛋白和 PP2C蛋白传导信号途径
的重要分子开关, 从而能更好地发挥其信号调控作用[6]。
甘蔗不仅是最重要的糖类作物 , 还是高生物量的能
源作物。蔗糖约占我国食糖总产的 92%。我国甘蔗 85%
种植于盐碱地及旱地。近年频发的干旱、寒害和日趋严重
的病虫害等, 对甘蔗生产造成极大的危害。因此, 挖掘甘
蔗抗逆基因以及解析甘蔗抗逆的分子机制是甘蔗抗逆育
种的重要基础工作[7]。前人研究表明, CIPK在植物响应逆
境胁迫中发挥着重要的作用 , 该基因与非生物逆境胁迫
(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关[8]。迄今, 在
拟南芥和水稻中已克隆鉴定出 25 个 CIPK 基因和 30 个
CIPK基因[9], 从杨树中鉴定了 27个 CIPK基因[9], 从玉米
中克隆得到了 43个CIPK基因[2], 从油菜中克隆获得了 23
个 CIPK基因[10], 从高粱中鉴定出了 32个 CIPK基因[11]。
同一植物的不同 CIPK基因以及不同植物相同的 CIPK 基
因在定位和功能上都有较大的差异。Priji和 Hemaprabha[12]
研究表明甘蔗在 ABA 信号通路上存在一个 CIPK14 基因
可以响应干旱胁迫。邓小敏[13]揭示了小麦的 TaCIPK14基
因受冷、渗透胁迫和盐胁迫等非生物胁迫以及相关信号分
子 ABA、乙烯和 H2O2的诱导。Kim等[9]研究揭示, AtCIPK3
在拟南芥中的过量表达可以提高其对盐胁迫的忍耐力。
Chen等[14]研究结果表明拟南芥中 AtCIPK6在响应干旱胁
迫的 ABA 通路上发挥关键作用。Zhao 和 Su[2]认为
ZmCIPK16与 PEG、NaCl、ABA、干旱胁迫有很大的关系。
边鸣镝等[15]在对玉米 CIPK的研究中发现, 该基因在甘露
醇、氯化钠、ABA和 4℃低温诱导时, 在玉米幼苗叶片中
表达量明显上升。但是, 国内外尚未见甘蔗中有关 CIPK
基因克隆和功能研究的报道。
本研究分析该基因在不同组织及各种外源胁迫下的
表达特性, 以期进一步揭示该其的功能和作用模式。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蔗品种崖城05-179由福建农林大学农业部福建甘
蔗生物学与遗传育种重点实验室提供。PrimeScript RT-
PCR Kit反转录试剂盒, SYBR Green PCR Master Mix Kit
(Roche), 购买自TaKaRa公司(中国大连)。
1.2 材料处理
在大田中随机选取生长健壮并且长势一致的崖城
05-179蔗茎 , 并砍成单芽茎段 , 洗净后放入50℃水浴锅 ,
100 mg L–1多菌灵(福瑞得, 中国河南郑州)水溶液中温育
40 min, 随后将单芽茎段种到高压无菌土中(16 h/8 h, 光/
暗, 28℃)培养至长出蔗苗, 切下蔗苗用于无菌苗的诱导、
扩繁以及生根。将组培苗放入蒸馏水中预培养10 d, 随后
选取生长一致的小苗用于处理 , 根据预备实验结果确定
取样时间点。每个处理分别设3个生物学重复, 在平底试
管中培养, 胁迫组处理条件为水杨酸(5 mmol L–1 SA水溶
液)、茉莉酸甲酯(100 μmol L–1 MeJA水溶液)、脱落酸(100
μmol L–1 ABA)水溶液, 分别于6、12和24 h各取3棵蔗苗的
蔗叶; PEG-8000水溶液(25.0%)和250 mmol L–1 NaCl水溶
液培养, 分别于12、24和48 h各取3棵蔗苗的蔗叶; 0 h未处
理的蔗叶作为对照。以上所有植物材料均被立即投入–80℃
液氮中保存至RNA提取。
1.3 同源克隆
以玉米CIPK15基因(EU957447.1, 2247 bp)核酸序列
作为探针, 运行NCBI的BlastN工具检索甘蔗EST数据库,
获得2条同源的EST序列(CF577339.1, 568 bp; DN236273.1,
303 bp), 用BioEdit中的Contig Assembly Program (CAP)
(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)软件无法将这2条甘蔗
EST序列拼接组装获得全长cDNA序列。经序列分析, 直
接根据 NCBI上玉米 CIPK15基因的全长 cDNA序列
(EU957447.1, 2247 bp)保守区域设计引物, 以甘蔗品种崖
城05-179的cDNA为模板, RT-PCR扩增获得甘蔗中CIPK基
因序列。
1.4 甘蔗 CIPK基因的 RT-PCR及测序
采用 TRIzol法提取叶片的总 RNA。用反转录试剂盒
合成 cDNA, 作为 PCR的模板。以上述玉米 CIPK15基因
的 cDNA 序列(EU957447.1)为基础, 设计 1 对特异性的
RT-PCR扩增引物, 5端 5-TCACCTTGGAGACGACG-3和
3端 5-ACTGCAGAAATGCCATGTATTCCAG-3。PCR体
系 25 L, 含 10GC buffer 2.5 L、10 mmol L–1 dNTPs
2 L、20 mol L–1 5 Primer 1.0 L、20 mol L–1 3 Primer
1.0 L、Ex Taq酶 0.125 L、cDNA模板 1.0 L、ddH2O
17.375 L。PCR程序为 94℃预变性 4 min; 94℃变性 1 min,
50℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 35个循环; 72℃延伸
10 min。使用 Gel Extracti on Kit (TianGen Biotech Co., Ltd.,
Beijing)纯化回收扩增产物, 并与 pMD-19T载体连接转化
到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中, 在抗性 Amp的 LB平板
上筛选阳性克隆, 随机挑取单菌落进行 PCR 鉴定, 将阳
性单菌落菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司
测序, 测序获得的甘蔗 CIPK基因 cDNA 序列经 NCBI 的
ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)服
务器, 进行开放阅读框分析并翻译。
第 3期 黄 珑等: 甘蔗 CIPK基因的同源克隆与表达 501
1.5 甘蔗 CIPK基因序列的生物信息学分析
利用 ExPASy中 ProtParam pI/Mw (http://web.expasy.
org/compute_pi/)在线工具对序列的理化性质、氨基酸组成
等一级结构进行预测, 利用 SignalP 4.1 Server (http://www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析、ProtScale
(http://web.expasy.org/protscale/)进行疏水性/亲水性预测、
Profun 2.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)
进行功能预测、编码蛋白亚细胞定位用 Psort (http://
www.psort.org/)在线工具预测、GOR IV (http://npsa-pbil.
ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)进行
二级结构预测、SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.
org/)进行蛋白质三级结构预测; 使用 Blast 工具在 NCBI
上查找氨基酸同源性序列。
1.6 甘蔗 CIPK基因的实时定量 PCR
采用 TRIzol法提取叶片、叶鞘、侧芽、蔗皮、蔗髓、
根及经 SA、MeJA、ABA、PEG、NaCl 胁迫处理和对照
组 ROC22 叶片的总 RNA, 用反转录试剂盒合成 cDNA,
作为实时定量 PCR 模板, 以 GAPDH 作为内参基因[13]。
ScCIPK定量引物为: 5端(5-ACCACCGGAGACACAGGA
TG-3)和 3端(5-CTGGAGCGATTGGCGTTTGC-3), 内参
基因 GAPDH定量引物为: 5端(5-CACGGCCACTGGAAG
CA-3)和 3端(5-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3)[16]。按
照 SYBR R Green PCR Master Mix Kit (Roche)说明书配置
定量反应体系。实时定量 PCR扩增程序为: 50℃ 2 min; 95℃
10 min; 95℃ 15 s、60℃ 1 min, 45个循环; 增加熔解曲线;
反应时设置 3次技术重复。
1.7 数据处理
使用 DNAMAN 软件 , 将重组质粒序列与玉米
CIPK 基因序列进行同源性比对。并用 DNAMAN 软件
分析氨基酸同源性及多序列比对 , 完成并构建系统进
化树。在 Microsoft Excel 工作表种采用 2–ΔΔCT算法 [17]
分析实时定量 PCR 实验结果 , 画图并计算 3 次重复数
据的标准误。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 CIPK基因序列的获得
以玉米 CIPK15基因(EU957447.1, 2247 bp)核酸序列
设计 1对同源克隆 PCR引物, 以甘蔗的 cDNA为模板, 经
过 RT-PCR扩增获得约 1782 bp的单一条带(图 1), 经过胶
回收、连接转化、菌落 PCR 鉴定、菌液测序得到图 2。
经序列比对, 甘蔗 CIPK 基因的开放读码框序列与玉米
CIPK15 全长的 mRNA 序列有较高的同源性, 达 94.50%,
具有完整的开放读码框, 被命名为 ScCIPK (GenBank登录
号为 KM114052)。此外, 甘蔗 ScCIPK 蛋白包含 PKc-like
superfamily和 AMPKA-C-like superfamily保守结构域, 一
个 CBL interaction 结合位点和一个潜在的 PP2C 结合位
点。因此, 推测同源克隆所获得的甘蔗 ScCIPK 基因序列
是正确的。
图 1 甘蔗 ScCIPK基因的 RT-PCR扩增
Fig. 1 RT-PCR amplification of ScCIPK gene in sugarcane
M: DNA marker 15000+2000 bp; 1: RT-PCR产物。
M: DNA marker 15000+2000 bp; 1: RT-PCR product.
2.2 甘蔗 ScCIPK基因的生物信息学分析
2.2.1 甘蔗 ScCIPK基因编码氨基酸的一级结构预测
该蛋白分子式 C2586H4138N700O772S16, 分子量 Mw 为
5.79 kD, 编码了 513个氨基酸。等电点(pI) 7.58, 负电荷
残基(Asp+Glu) 69, 正电荷残基(Arg+Lys) 70, 不稳定系
数(II) 43.91, 平均疏水性(GRAVY) –0.477, 脂肪系数(AI)
87.45。
2.2.2 甘蔗 ScCIPK 蛋白二级结构预测和分析 根据
GOR IV 软件预测, 甘蔗 ScCIPK 蛋白无规则卷曲所占的
比例最高为 45.61%, 其次是 α-螺旋占 41.52%, 延伸链所
占比例是 12.87%, β-螺旋的比例为 0。
2.2.3 甘蔗 ScCIPK 蛋白信号肽预测和分析 根据
SignalP 4.1 Server 软件预测可知, 第 25 位赖氨酸残基具
有最高的原始剪切位点分值 0.132 和最高的信号肽分值
0.130, 第 39 位丙氨酸残基具有最高的综合剪切位点分值
0.139。由于最后算得氨基酸残基的加权平均值较小, 为
0.105 (远远小于 0.5), 因此推测 ScCIPK 基因所编码的蛋
白不存在信号肽, 而为非分泌蛋白, 说明该蛋白在细胞质
中合成后不能被转运。
2.2.4 甘蔗 ScCIPK蛋白疏水性/亲水性的预测和分析
根据 ProtScale软件预测, 第 203位具有最高分值, 为
3.289, 疏水性最强; 第 440 位具有最低分值, 为–3.100,
亲水性最强。整条多肽链表现为亲水性, 没有明显的疏水
区, 故推测甘蔗 ScCIPK蛋白是一种亲水蛋白。
2.2.5 甘蔗 ScCIPK 蛋白质三级结构预测 根据
SWISSMODEL软件预测, ScCIPK蛋白的空间结构以无规
则卷曲和螺旋为主。比较甘蔗、高粱、玉米和水稻中 CIPK
蛋白的三级空间结构虚拟图结果显示 , 甘蔗的三级空间
结构与玉米高度相似 , 而水稻和高粱与甘蔗的三级结果
存在一定的差异。
2.2.6 甘蔗 ScCIPK蛋白的功能预测 根据 Profun 2.2
Server 软件预测, 该蛋白主要参与中间代谢, 可能性为
502 作 物 学 报 第 41卷
图 2 同源克隆获得的甘蔗 ScCIPK基因的 cDNA序列及其推导的氨基酸序列(*终止密码子)
Fig. 2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of sugarcane ScCIPK gene obtained by homology cloning (* stop codon)
下画线部分为特异性引物在基因序列中的位置。The sequence fragment complementary to primer is underlined.
2.252, 其次也可能参与翻译、嘌呤和嘧啶类合成及脂肪酸
代谢。可能性依次为 1.990、1.675和 1.265。
2.2.7 甘蔗 ScCIPK 蛋白的亚细胞定位预测 根据
Psort 软件预测, 甘蔗 ScCIPK 蛋白可能被定位于内质网
(膜 )(85.0%), 其次是原生质膜 (79.0%), 再次是细胞核
(60.0%)。
2.2.8 甘蔗 ScCIPK 蛋白的保守结构域分析 如图3所
示 , 甘蔗 ScCIPK 蛋白包含 2个保守结构域 , 分别为
PKc-like superfamily 和 AMPKA-C-like superfamily, 有一
个CBL interaction结合位点, 一个潜在的 PP2C结合位点。
这和上述提到的所有 CIPK 蛋白含有2个结构域 N 端和 C
端的结构特征相符[4-5]。
2.2.9 甘蔗 ScCIPK 蛋白的氨基酸同源性分析 以玉米
(Zea mays_gb|NP_001148041.1|)、高粱(Sorghum bicolor_
gb|ACQ83516.1|)、水稻(Oryza sativa japonica Group_gb|
ACD76978.1|)、小麦(Triticum urartu_gb_gb|EMS 64809.1|)、
山 羊 草 (Aegilops tauschii_gb|EMT28213.1|) 、 毛 白 杨
(Populus tomentosa_gb|AGW15605.1|) 、 鳄 梨 (Persea
americana_gb|ABY58264.1|) 、 葡 萄 (Vitis vinifera_gb|
ACQ83523.1|)氨基酸残基序列以及甘蔗 ScCIPK氨基酸残
基序列进行氨基酸同源性分析。结果如图 4 所示甘蔗
CIPK 蛋白的氨基酸残基序列与近缘物种玉米、高粱、水
稻、小麦、山羊草、毛白杨、鳄梨、葡萄相似性分别为
93%、89%、79%、77%、77%、57%、57%和 58%。
从图 5 可以看出, 同属单子叶植物的甘蔗和玉米同源
性最高。系统进化树显示(图 5), 单子叶植物甘蔗、玉米、
图 3 甘蔗 ScCIPK蛋白的保守结构域分析
Fig. 3 Conserved domain prediction of ScCIPK protein
第 3期 黄 珑等: 甘蔗 CIPK基因的同源克隆与表达 503
图 4 甘蔗 ScCIPK蛋白与其他植物种蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 4 Homology analysis of sequences from sugarcane ScCIPK and those of other plant species
图 5 8个物种基于 CIPK氨基酸序列的系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of eight plant species based on CIPK protein sequences
504 作 物 学 报 第 41卷
水稻和高粱等为一分支, 同属双子叶植物的毛白杨、鳄梨
和葡萄为另一分支。因此, 该基因在不同物种间具有很强
的保守性, 它们对应的蛋白属于同一个家族。
2.3 甘蔗 ScCIPK基因的组织特异性表达分析
图 6 所示, 该基因的表达具有组织特异性, 在不同组
织中均有表达, 其中在蔗髓中表达量最少, 侧芽中表达量
最高, 是蔗髓中的 30.8倍, 其次是在根中的表达量, 为蔗
髓中的 18.6倍。
2.4 甘蔗 ScCIPK 基因在不同外源胁迫下的表达特性分
析
图 7所示, 外源 SA处理在 3个时间点(6、12和 24 h)
抑制了甘蔗 ScCIPK基因的表达, 表现为在处理 24 h达到
最低, 约为对照的 0.4倍。与 SA的应答模式相反, 该基因
的表达受到 PEG强烈诱导, 在处理 12 h的相对表达量达
到最高, 为对照的 4.6 倍; 并且在整个处理周期(24 h 和
48 h)内均维持在 3倍以上的较高水平。
从总体上看, ScCIPK的表达对外源MeJA、ABA、NaCl
的应答呈现出上调和恢复 2 个阶段的模式。ScCIPK 的相
对表达量在MeJA、ABA处理 12 h后均达最大, 其中MeJA
在 6 h后下调表达, 但在 12 h时表达量增加, 为对照的 4.1
倍; ABA诱导时, ScCIPK在各个时点(6、12和 24 h)都是
上调表达, 6 h开始上调, 到 12 h达最高, 约为对照的 5倍;
在 NaCl的处理下, 24 h时表达量达最高, 约为对照的 3.1
倍, 在 48 h, ScCIPK的表达水平迅速恢复到与对照相当的
水平(图 7-E)。
图 6 甘蔗 ScCIPK基因在不同组织中的表达
Fig. 6 The relative expression of ScCIPK gene in different
sugarcane tissues and organ
误差线为每组处理的标准误差(n=3)。
The error bars represent the standard error of each treating group (n=3).
图 7 甘蔗 ScCIPK基因在不同外源胁迫下的表达
Fig. 7 ScCIPK gene expression of sugarcane under different exogenous stress
误差线为每组处理的标准误差(n=3)。
The error bars represent the standard error of each treating group (n=3).
3 讨论
干旱和低温等逆境条件严重危害甘蔗生产 , 造成蔗
茎产量与蔗糖分损失。近年来, 随着生物技术的迅速发展,
利用基因工程技术对甘蔗品种进行定向遗传改良 , 已经
被证明是一种甘蔗育种的有效新途径[18]。在已有的研究
中, 我们得知 CIPK 基因家族是一个较大的家族, 家族内
不同的 CIPK 成员的功能存在特异性, 可以响应一种或多
种胁迫。与甘蔗近缘的玉米、高粱等作物中均已克隆到多
个 CIPK 家族基因, 这为我们探究该基因提供一定的理论
基础。
本研究利用与甘蔗同源性较高的玉米 CIPK15 基因
(EU957447.1, 2247 bp)的核酸序列保守区域, 设计 1对同
源克隆 PCR 引物, 而后以崖城 05-179 为材料, 成功克隆
获得甘蔗 ScCIPK 基因。该基因与玉米 CIPK15 全长的
mRNA全长序列的同源性达 94.5%, 具有完整的开放读码
框, 且在甘蔗 ScCIPK 蛋白中包含 2 个 CIPK 基因典型保
守结构域, 分别为 PKc-like superfamily 和 AMPKA-C-like
superfamily, 这说明同源克隆所获得的甘蔗 ScCIPK 基因
序列是正确的。甘蔗 ScCIPK基因在不同物种间的保守性
一般, 亲缘关系较近的物种(如玉米、高粱和水稻)其蛋白
同源序列均达到 80%左右, 亲缘关系较远的物种间相应
的蛋白同源序列只有 50%左右。所编码的蛋白位于内质膜
(85%)和原生质膜 (79%)上 , 这与已报道的一些物种的
CIPK 基因定位存在一定差异 , 如在拟南芥中 , 已报道
AtCIPK24 和 AtCIPK1 分布在细胞膜、细胞核和细胞质
中 [19-21]; 在玉米中, ZmCIPK16则分布在细胞核和原生质
膜上[19]。导致这种结果的主要原因可能在于 CIPK本身不
第 3期 黄 珑等: 甘蔗 CIPK基因的同源克隆与表达 505
具有已知定位信号, 因此每个 CIPK 的亚细胞定位最终可
能取决于与其相互作用的 CBL[22]。在进一步的蛋白预测
中, ScCIPK基因编码的蛋白为亲水、非分泌酸性蛋白, 在
调控中间代谢中发挥关键的作用。
前人研究表明, CIPK 基因在植物逆境应答信号中发
挥极其重要的作用 , 该蛋白与其上游 CBL 蛋白组成的
CBL-CIPK 信号系统参与了植物多种逆境应答信号途径[23]。
Zhao和 Sun[2]研究结果显示, 玉米 CIPK16基因在 NaCl、
ABA、PEG 胁迫下表达量均会被调节, 在 250 mmol L–1
NaCl 胁迫下, 该基因表达呈上升趋势, 在 12 h 时其表达
量达到最大; 同时, 在 100 μmol L–1的 ABA处理下, 均显
示为上调表达, 在 6 h时表达量达到最大; 在干旱胁迫下,
其表达量在 6 h 的时候是最高的 , 这与本研究中甘蔗
ScCIPK基因的表达趋势是相似的。此外, 有文献报道, 干
旱或者高盐引起的胁迫信号的转导至少通过 ABA依赖和
ABA不依赖的 2条途经[20]。在本试验中, 甘蔗 ScCIPK的
表达不仅受到外源 NaCl 和 PEG 的诱导, 而且受到外源
ABA 的强烈诱导, 说明该基因很可能与干旱或渗透胁迫
响应有关。
References
[1] Zhu J K. Salt and drought strsee signal transdutiong in plants.
Annu Rev Plant Biol, 2002, 53: 247–273
[2] Zhao J F, Sun Z F. Cloning and characterrization of a
novel CBL-interracting protein kinase from maize. Plant
Mol Biol, 2009, 69: 661–674
[3] 王琦, 王伟, 申腾飞, 薛瑞丽, 邰付菊. 玉米中 3个 CIPK同源
基因在干旱和低温胁迫下的表达分析. 华中农业大学学报,
2011, 30: 545–551
Wang Q, Wang W, Shen T F, Xue R L, Tai F J. Three CIPK of
homologous genes in maize under drought and low temperature
stress analysis of the expression. J Huazhong Agric Univ, 2011,
30: 545–551 (in Chinese with English abstract)
[4] Albrecht V, Ritz O, Linder S, Harter K, Kudla J. The NAF do-
main defines a novel protein-protein interaction module in
Ca2+-regulated kinases. EMBO J, 2001, 20: 1051–1063
[5] Lee S C, Lan W Z, Kim B G, Lin L, Cheong Y H, Pandey G K,
Lu G H, Buchanan B B, Luan S. A protein phosphoryla-
tion/dephosphorylation network regulates a plant potassium
channe. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 15959–15964
[6] Sánchez-Barrena M J, Fujii H, Angulo I, Martínez-Ripoll M, Zhu
J K, Albert A. The structure of the C-terminal domain of the pro-
tein kinase AtSOS2 bound to the calcium sensor AtSOS3. Mol
Cell, 2007, 26: 427–435
[7] 郭晋隆, 李国印, 苏亚春, 王恒波, 阙友雄, 徐景升, 许莉萍.
甘蔗 R2R3-MYB 类似基因 Sc2RMyb1 的克隆及表达特性分析.
农业生物技术学报, 2012, 20: 1009–1017
Guo J L, Li G Y, Su Y S, Wang H B, Que Y X, Xu J S, Xu L P.
Sugarcane R2R3 MYB-similar gene cloning and expression of
Sc2RMyb1 characteristics analysis. J Agric Biotechnol, 2012, 20:
1009–1017 (in Chinese with English abstract)
[8] Ye C Y, Xia X L, Yin W L. Evolutionary analysis of
CBL-Interacting protein kinase gene family in plants. Plant
Growth Regul, 2013, 71: 49–56
[9] Yu Y H, Xia X L, Yin W L, Zhang H C. Comparative genomic
analysis CIPK gene family in Arabidopsis and Populus. Plant
Growth Regul, 2007, 52: 101–110
[10] Zhang H F, Yang B, Liu W Z, Li H W, Wang L, Wang B Y, Deng
M, Liang W W, Deyholos K M, Jiang Y Q. Identification and
characterication of CBL and CIPK gene families in canola (Bras-
sica napus). BMC Plant Biol, 2014, 14: 8–32
[11] Li L B, Zhang Y R, Liu K C, Ni Z F, Fang Z J, Sun Q X, Gao J W.
Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK
family genes in sorghum. Agric Sci China, 2010, 9: 19–30
[12] Priji P J, Hemaprabha G.. Sugarcane specific drought responsive
candidate genes belonging to ABA dependent pathway identified
from basic species clones of Saccharum sp. and Erianthus sp.
Sugar Tech, 2014, DOI: 10.1007/s12355-014-0313-6
[13] 邓小敏. 小麦CBL基因和CIPK基因的克隆及在非生物胁迫种
的功能研究. 华中科技大学博士学位论文, 湖北武汉, 2013
Deng X M. Study on Wheat CBL and CIPK Genes Cloning and
the Function under Abiotic Stress. PhD Dissertation of Huazhong
University of Science and Technology, Wuhan, China, 2013 (in
Chinese with English abstract)
[14] Chen L, Wang Q Q, Zhou L, Ren F, Li D D, Li X B. Aradidopsis
CBL-interacting protein kinase(CIPK6) is involved in plant re-
sponse to salt/osmotic stress and ABA. Mol Biol Rep, 2013, 40:
4759–4767
[15] 边鸣镝, 吴忠义, 赵久然, 王永勤, 张秀海, 黄丛林, 曹鸣庆.
非生物胁迫诱导的玉米蛋白激酶基因 ZmCIPK1的 cDNA克隆
和表达分析. 农业生物技术学报, 2008, 16: 965–970
Bian M D, Wu Z Y, Zhao J R, Wang Y Q, Zhang X H, Huang
C L, Cao M Q. The corn protein kinase gene induced by
abiotic stress ZmCIPK1 cDNA cloning and expression analy-
sis. J Agric Biotechnol, 2008, 16: 965–970 (in Chinese with
English abstract)
[16] 阙友雄, 许莉萍, 徐景升, 张积森, 张木清, 陈如凯. 甘蔗基
因表达定量PCR分析中内参基因的选择. 热带作物学报, 2009,
30: 274–278
Que Y X, Xu L P, Xu J S, Zhang J S, Zhang M Q, Chen R K.
Sugarcane quantitative PCR analysis of gene expression in the
choice of internal genes. Chin J Trop Crops, 2009, 30: 274–278
(in Chinese with English abstract)
[17] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression
data using Real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.
Methods, 2001, 25: 402–408
[18] 张志勇, 雷朝云, 蒙秋伊, 卢加举. 甘蔗抗逆基因工程育种研
究进展. 核农学报, 2012, 26: 471–477
Zhang Z Y, Lei Z Y, Meng Q Y, Lu J Y. Sugarcane art research
progress of genetic engineering breeding. J Nucl Agric Sci, 2012,
26: 471–477 (in Chinese with English abstract)
[19] Quintero F J, Ohta M, Shi H, Zhu J K, Pardo J M. Reconstitution
in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+ ho-
meostassis. Proc Acad Natl Sci USA, 2002, 99: 9061–9066
[20] D. Angelo C, Weinl S, Batistic O, Pandey G K, Cheong Y H,
Schultke S, Albrecht V, Ehlert B, Schulz B, Harter K, Luan S,
Bock R, Kudla J. Altrnative complex formation of the
Ca+-regulated protein kinase CIPK1 controls abscisic acid de-
pendent and independent stress responses in Arabidopsis. Plant J,
506 作 物 学 报 第 41卷
2006, 48: 857–872
[21] Yu Q Y, An L J, Li W L. The CBL-CIPK network mediates dif-
ferent signaling pathways in plants. Plant Cell Rep, 2014, 33:
203–214
[22] 李率帅, 阚国仕, 魏建华, 李瑞芬. 野大麦 CIPK 基因的亚细
胞定位. 辽宁农业学报, 2011, (4): 1–5
Li S S, Kan G S, Wei J H, Li R F. The subcellular localization of
wild barley CIPK gene. J Liaoning Agric, 2011, (4): 1–5 (in Chi-
nese with English abstract)
[23] 赵晋锋, 余爱丽, 王寒玉, 杜艳伟, 王高鸿, 常海霞. 非生物
逆境胁迫下 ZmCIPK10 基因表达分析. 生物技术进展, 2011,
1(2): 130–134
Zhao J F, Yu A L, Wang H Y, Du Y W, Wang G H, Chang H X.
Abiotic ZmCIPK10 gene expression under adversity stress analy-
sis. Biotechnol Adv, 2011, 1(2): 130–134 (in Chinese with Eng-
lish abstract)