全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 515523 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-09), 农业部作物种质资源保护子项目(NB2013-2130135-25-15), 中国农业科学
院科技创新工程(作物种质资源鉴定与发掘团队)和国家自然科学基金项目(31160304)项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 朱振东, E-mail: zhuzhendong@caas.cn, Tel: 010-82109609
第一作者联系方式: E-mail: wdtashwzy@163.com
Received(收稿日期): 2014-10-25; Accepted(接受日期): 2015-02-06; Published online(网络出版日期): 2015-03-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150303.1651.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00515
豌豆品系 X9002抗白粉病基因鉴定
王仲怡 1 付海宁 1,2 孙素丽 1 段灿星 1 武小菲 1 杨晓明 2 朱振东 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081; 2甘肃省农业科学院, 甘肃兰州
730070
摘 要: 白粉病是豌豆的主要病害之一, 在全球范围内引起严重经济损失。防治豌豆白粉病最有效、经济和环境友
好的方法是利用抗病品种。迄今, 2个隐性抗白粉病基因 er1、er2和一个显性抗白粉病基因 Er3已在豌豆中被鉴定, 其
中 er1 基因在世界上被广泛应用于抗病品种培育。er1 基因隶属 MLO 基因家族, 其抗性由豌豆 PsMLO1 基因座位功
能丧失产生。X9002 是甘肃省农业科学院培育的一个半无叶(afila)抗白粉病豌豆品系。本研究对 X9002 抗白粉病基
因进行鉴定, 开发用于抗白粉病基因选择的分子标记。遗传分析表明 X9002 对白粉病抗性由 1 个隐性单基因控制,
SSR标记将该基因定位到豌豆第 VI连锁群 er1座位区域, 标记 AD60和 c5DNAmet与其连锁。PsMLO1基因序列分
析发现, X9002存在一个未知大小和身份的片段插入, 该类型突变也发生在含有 er1-2等位基因的豌豆品种 Stratagem
和 Franklin, 表明 X9002抗白粉病基因为 er1-2。一个鉴定 er1-2等位基因的功能标记 PsMLO1-650被开发, 该标记为
互引相标记, 仅在感病植株中扩增, 可以有效用于分子辅助选择。
关键词: 豌豆; 白粉病; 抗病基因; PsMLO1基因; 功能标记
Identification of Powdery Mildew Resistance Gene in Pea Line X9002
WANG Zhong-Yi1, FU Hai-Ning1,2, SUN Su-Li1, DUAN Can-Xin1, WU Xiao-Fei1, YANG Xiao-Ming2, and
ZHU Zhen-Dong1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resource and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China; 2 Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China
Abstract: Powdery mildew is one of the major diseases in pea, causing severe economic loss worldwide. Planting resistant culti-
vars is the most effective, economical and eco-friendly method for controlling the disease. To date, two recessive resistance genes
(er1, er2) and one dominant resistance gene (Er3) have been identified in pea, and er1 has been utilized in breeding programs
worldwide. Gene er1 is a member of MLO gene family, and er1 resistance is caused by the loss of function at a PsMLO1 locus in
pea. X9002 with resistance to powdery mildew is an afila pea line bred by Gansu Academy of Agricultural Sciences. Here, we
identified the powdery mildew resistance gene in X9002, and developed molecular marker for the gene selection. Genetic analysis
for powdery mildew resistance showed that X9002 carries a recessive resistance gene. The resistance gene was mapped in a re-
gion carrying er1 locus on the pea linkage group VI using SSR markers, and was linked to SSR marker AD60 and gene marker
c5DNAmet. PsMLO1 sequence analysis revealed that X9002 carries an insertion of unknown size and identity. The same mutation
also existed in pea cultivars Stratagem and Franklin carrying er1-2 allele, indicating that the resistance gene is er1-2 in X9002. A
functional marker PsMLO1-650 for er1-2 was developed, and the marker was a coupling-phase marker that was detected only in
susceptible plants. PsMLO1-650 can be used effectively in marker-assisted selection.
Keywords: Pisum sativum L.; Powdery mildew; Resistance gene; PsMLO1 gene; Functional marker
豌豆(Pisum sativum L.)是世界上第三大豆类作
物, 在全世界有近90个国家种植 [1], 是人类和动物
的主要蛋白质来源之一。豌豆在中国已有 2000多年
的栽培历史, 作为蔬菜、粮食和饲料等原料广泛栽
516 作 物 学 报 第 41卷


培于全国各地 [2]。据联合国粮农组织 (FAO)统计 ,
2013 年我国豌豆干籽粒产量 138 万吨, 居世界第 2
位 , 仅次于加拿大; 此外 , 我国是世界上最大的菜
用豌豆生产国[3]。豌豆白粉病是制约豌豆生产的最
重要病害之一。该病由专性寄生真菌豌豆白粉菌
(Erysiphe pisi)引起, 在温带及亚热带地区普遍发生,
特别是在白天温暖、夜间冷凉的气候条件下为害严
重, 一般发生年份可造成 25%~50%的产量损失, 严
重流行时, 高度感病品种的产量损失可达 80%以上[4-5]。
白粉病还加速豌豆植株的成熟, 导致青豌豆的嫩度
值快速提高。豆荚被严重侵染可导致籽粒变色和苦
涩, 品质下降[5]。
化学防治是控制豌豆白粉病常用的方法, 但是
杀菌剂的防治效果受喷药时期、次数、环境条件、
病原菌抗药性等影响。此外, 使用杀菌剂不但增加
生产成本, 而且导致环境污染、残留、食品安全、
病原菌抗药性等问题[5]。迄今, 在所有病害防治方法
中, 利用寄主自然抗性是最有效、经济和环境友好
的方法。1943年 Harland[6]从秘鲁的一个豌豆地方品
种中发现了一些对白粉病免疫的植株并对这些植株
的抗性遗传进行分析, 发现豌豆白粉病抗性受一个
隐性基因 er控制。1969年 2个独立遗传的隐性抗白
粉病基因 er1和 er2被鉴定[7]。随后的遗传分析表明,
大量的豌豆抗性资源或品系含有 er1 基因[8-12], er2
只在少数几个品种中被鉴定 [6,8]。在细胞学水平上,
er1 抵抗白粉菌侵入表皮细胞, 表现为免疫或高抗;
er2 阻止已入侵病原菌在组织中的扩展, 但抗性只
在叶片上表现, 且抗性水平受温度、叶龄等条件的
影响[13]。最近, 西班牙科学家在豌豆野生种 Pisum
fulvum 中鉴定一个新的显性抗白粉病基因 Er3 [14]。
随着分子标记技术的应用, er1被定位到豌豆遗传图
谱的第 VI连锁群[15], er2被定位到第 III连锁群[16]。
由于大量的抗性豌豆资源或品种被鉴定含有 er1 基
因, 许多研究者开展了 er1基因分子作图, 不同类型
的连锁标记被开发[17-22], 这些连锁的分子标记为豌
豆抗白粉病分子辅助选择育种奠定了基础。er1基因
的隐性性质及完全、广谱和持久抗性的特点与大麦
抗白粉病 Mlo 基因相似[23], 也能够通过人工诱变获
得[24]。最近, 研究发现豌豆 er1基因座位是 1个MLO
同源基因 PsMLO1, PsMLO1功能丧失导致豌豆抗白
粉病表现型[25-26]。由于突变位点和方式的不同, 4个
er1 等位基因(er1-1、er1-2、er1-3、er1-4)分别在不
同的豌豆资源中被鉴定[25]。Santo等[27]通过化学诱变
获得一个新的 er1突变体 er1-5。基于不同分子标记
技术, Pavan等[28]建立了 5个 er1等位基因的功能标
记, 但这些标记的有效性尚未被验证。
er1基因在欧洲、北美洲和澳大利亚被广泛地应
用到商业育种中, 大量抗病品种的育成和推广, 成
功地控制了豌豆白粉病在这些地区的流行[5,8,12,29]。
自 20 世纪 80 年代以来, 我国相关研究人员开展了
豌豆抗白粉病资源的筛选, 鉴定了一批抗性地方豌
豆资源和国外引进资源[30-32]。然而, 迄今豌豆白粉
病的抗性在我国还没有被利用, 抗性资源的抗病基
因没有被鉴定。豌豆品系 X9002是甘肃省农业科学
院选育的半无叶皱粒型豌豆。我们前期的温室接种
鉴定和多年田间鉴定发现该品系对白粉病表现稳定
的抗性[30]。本研究对 X9002抗白粉病基因进行鉴定,
开发用于分子辅助选择育种的功能标记, 为有效利
用该抗病基因、培育优良的抗白粉病豌豆品种奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
豌豆品系 X9002由甘肃省农业科学院作物研究
所杨晓明研究员提供。豌豆白粉病感病品种坝豌 6
号由河北省张家口市农业科学院徐东旭副研究员提
供。以感病的坝豌 6号为母本、抗病的 X9002为父
本配制杂交组合, F1代群体自交产生 F2代群体, F2代
自交衍生 F2:3家系。F1代和 F2代群体均种植于本实
验室繁殖温室中。
豌豆白粉菌分离物 EPBJ 由本实验室分离, 用
坝豌6号活体保存于10℃光照培养箱。接种体的繁殖
采用分生孢子抖落法接种坝豌6号幼苗 , 接种后置
18~22℃温室培养10~12 d。
1.2 抗性鉴定
1.2.1 亲本抗性鉴定 将抗病亲本 X9002和感病
亲本坝豌 6号分别播种于以粗蛭石为基质的 250 mL
的纸杯中, 每份材料播种 30 粒, 每杯播种 5 粒, 播
后置 18~26℃的温室培养, 待豌豆苗第 3或第 4茎节
叶片展开时 , 采用分生孢子抖落法接种 , 其后于
18~22℃温室培养。采用 0~4 级的病情分级标准, 0
级为无病; 1级为病斑上有淡薄菌丝层, 可见绿色叶
面, 不产生孢子; 2 级为菌丝层较厚, 不透绿, 产生
一定量孢子; 3级为菌丝层厚, 产孢量较多; 4级为产
孢量多 , 病斑上的菌丝层全被孢子覆盖 [9,33]。接种
10 d后调查发病情况。抗性评价以 0~2级为抗病(R),
第 4期 王仲怡等: 豌豆品系 X9002抗白粉病基因鉴定 517


3~4级为感病(S)。
1.2.2 F1和 F2代抗性鉴定 采用离体叶片方法鉴
定 F1和 F2植株对白粉病的抗性。将 F1和 F2代播种
于繁殖温室内 , 苗期在每株相同位置取一片复叶 ,
将叶柄斜插入培养皿内 2%水琼脂培养基中, 用分生
孢子抖落法接种叶片, 盖上培养皿后用封口膜密封,
置 20℃光照培养室培养, 每天 14 h光照。10 d后调
查各单株叶片的发病情况, 病情分级同前。对表现
为免疫和抗病的单株进行重复鉴定。用 χ2 测验 F2
群体抗、感植株分离比。
1.2.3 F2:3 家系抗性鉴定 从每个 F2:3 家系中随
机取 24 粒种子 , 分别播种于以粗蛭石为基质的
250 mL纸杯中, 每杯播 6粒, 播后置 18~26℃的温室
培养, 待豌豆苗第三或第四茎节叶片展开时, 采用
分生孢子抖落法接种, 接种后置 18~22℃温室培养,
10 d后调查各家系的发病情况。病情分级同前。对
鉴定为纯合抗病和抗性分离的家系进行重复鉴定。
对 F2:3群体抗性分离比进行 χ2测验。
1.3 豌豆基因组 DNA提取及抗感池构建
取坝豌6号、X9002及 F2群体单株嫩叶用 CTAB
法提取基因组 DNA。在 F2群体中, 根据抗性鉴定结
果随机挑选 5个抗病单株和 5个感病单株基因组
DNA, 将浓度调至为40 ng μL–1, 分别取等量抗单株
DNA 或等量感单株 DNA 混合, 建立抗病基因池和
感病基因池[34]。
1.4 分子标记分析
用于多态性筛选的 SSR标记来源于 Loridon等[35]
绘制的豌豆 SSR连锁图谱。从每个连锁群均匀选取
10个 SSR标记, 在抗、感亲本以及抗、感池之间筛
选。用抗、感亲本和抗、感池之间均具有多态性标
记鉴定所有 F2代单株基因型。根据 SSR标记对抗病
基因初步定位结果, 在豌豆 SSR 连锁图谱和豌豆一
致性功能图谱(consensus functional map)的相应连锁
群上选择分子标记进行多态性鉴定[36-36], 随后用多
态性标记鉴定所有 F2代单株基因型。所用引物均由
生工生物工程(上海)有限公司合成。SSR标记及基因
标记的 PCR体系为 25 μL, 含 4 ng μL–1基因组DNA、
2 mmol L–1 buffer Mg2+、160 μmol L–1 dNTPs、
0.2 μmol L–1 M引物对、1.25 U Taq DNA聚合酶。采
用 Touch Down PCR扩增程序, 94℃预变性 3 min; 94
℃变性 30 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 循环 15
次, 每个循环退火温度降低 1℃; 接着 94℃变性 30 s,
45℃复性 30 s, 72℃延伸 2 min, 循环 25次; 最后 72
℃延伸 5.5 min。PCR扩增产物经 8%聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测, 硝酸银染色后观察记录。
1.5 PsMLO1候选基因分析及功能标记开发
用 RNAprep 植物总 RNA 提取试剂盒(离心柱
型)(天根生化)提取 X9002、坝豌 6号和奇珍 76的总
RNA。用BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒(两步法)
合成 mRNA第 1条 cDNA链, 用 PsMLO1特异性引
物对 PsMLO1F/PsMLO1R 进行 PCR 扩增[26]。纯化
PCR 产物并克隆到 pZeroBack 载体或 pMG-T 载体
(天根生化), 送北京六合华大基因科技股份有限公
司公司测序, 利用 ClustalX2 软件与 PsMLO1 序列
(FJ463618)比对分析获得的序列[25]。
根据 X9002和坝豌 6号的 PsMLO1候选基因序
列及 PsMLO1序列比对结果, 用 Primer Premier 5.0
设计功能性标记。由生工生物工程(上海)有限公司合
成引物。用 X9002 和坝豌 6 号基因组 DNA 为模板
进行 PCR 扩增, 检测引物有效性和多态性, 用抗、
感亲本间多态性引物鉴定 F2 群体单株的基因型。
PCR体系、程序及产物检测同 1.4。
1.6 抗白粉病基因作图
用 Mapmaker 3.0 分析 F2群体单株的基因型和表
型数据, 确定分子标记与抗病基因之间的连锁关系[37]。
将重组率用 Kosambi[38]作图方程转换成遗传距离。
似然率的十进制对数(LOD)被用作连锁可靠性的检
测尺度, 若标记的 LOD 阈值小于或等于 3.0 则被认
为连锁。用 Mapdraw绘制连锁标记与抗病基因的连
锁图谱。
2 结果与分析
2.1 抗性表现型
接种豌豆白粉菌分离物 EPBJ 后, 感病亲本坝
豌 6号叶片及卷须均被大量分生孢子覆盖, 发病严
重度为 4 级, 表现为感病; 抗病亲本 X9002 没有出
现感病症状, 病级为 0, 表现为抗病。以离体叶片接
种鉴定 9 个 F1代单株, 结果均为感病。选择含 137
个植株的 F2群体鉴定, 109个植株为感病, 28个植株
为抗病, 抗、感植株比经 χ2适合性检验符合 1∶3的
分离比; 在 137个 F2植株衍生的 F2:3家系中, 28个家
系为纯合抗病, 72个家系表现为抗、感分离, 37个家
系为纯合感病, 经 χ2 适合性检验, 纯合抗病、杂合
和纯合感病 F2:3家系比符合 1∶2∶1的分离比(表 1)。
抗性遗传分析结果表明, X9002的白粉病抗性由 1个
隐性基因控制。
518 作 物 学 报 第 41卷


表 1 坝豌 6号×X9002杂交组合对豌豆白粉菌分离物 EPBJ抗性分离分析
Table 1 Segregation analysis of resistance to isolate EPBJ of Erysiphe pisi in a cross of Bawan 6 × X9002
植株或家系数 No. of plants or families 亲本和组合
Parent or cross
世代
Generation 抗病 Resistance 分离 Segregation 感病 Susceptibility
期望比
Expected ratio
χ2
X9002 P1 30 0 0
坝豌 6号 Bawan 6 P2 0 0 30
F1 0 0 9
F2 28 0 109 1:3 1.775
坝豌 6号×X9002
Bawan 6 × X9002
F2:3 28 72 37 1:2:1 1.734

2.2 与抗病基因连锁的分子标记鉴定
在豌豆分子连锁图谱上均匀选取了 148 个 SSR
标记扩增亲本 X9002和坝豌 6号基因组 DNA, 结果
表明有 68个标记具有多态性。将这些标记用于抗池
和感池间多态性标记的筛选, 只有位于第 VI连锁群
的 SSR 标记 AD60 具有多态性, 推测该标记与抗病
基因连锁。用 AD60鉴定 136个 F2代植株的基因型,
有 36株为抗病基因型, 38株为感病基因型, 62株为
杂合基因型, 经 χ2适合性检验符合 1∶2∶1 的分离
比, 表明AD60为共显性标记。进一步连锁分析表明,
AD60与抗病基因连锁。由于 AD60位于豌豆遗传图
谱第 VI 连锁群且与 er1 座位连锁[20,35], 表明 X9002
抗白粉病基因可能是一个 er1座位的等位基因。
为进一步鉴定 X9002 抗白粉病基因连锁标记,
将已报道与 er1 座位连锁的 SCAR 标记和豌豆一致
性功能图谱第 VI 连锁群 SSR 标记 AD60 附近的标
记在亲本及抗感池之间进行多态性筛选, 发现 5-胞
嘧啶 DNA甲基转移酶基因(cytosine-5 DNA-methyl-
transferase)标记 c5DNAmet 在坝豌 6 号和 X9002 间
及抗、感池间存在多态性。进一步用 F2群体单株进
行标记 c5DNAmet 与抗病基因的连锁验证表明, 该
标记与抗病基因连锁, 并在群体中呈现出 1∶2∶1
的分离比, 为共显性标记。
2.3 X9002和坝豌 6号 PsMLO1候选基因
对 5个坝豌 6号 PsMLO1同源 cDNA克隆的测
序表明, 获得的序列与野生型 PsMLO1 cDNA 序列
完全相同, 长度为 1725 bp, 说明坝豌 6号含有白粉
病感病基因 Er1。10个 X9002的 PsMLO1同源 cDNA
克隆的测序表明, 获得了 3 种明显不同的 cDNA 序
列。与野生型序列比对发现, cDNA1 有一个大片段
插入和缺失突变 , 导致一个 155 bp 片段的增加 ;
cDNA2序列存在一个 129 bp片段缺失; cDNA3除缺
失一个 129 bp片外, 还缺失一个 5 bp的片段(图 1)。
X9002 的 PsMLO1 同源基因序列与抗白粉病豌豆品
种 Stratagem (JI 2302)和 Franklin相同, 这两品种被
鉴定含有豌豆抗白粉病等位基因 er1-2[25-26], 表明
X9002 抗白粉病基因为 er1-2, 其抗性是一个未知大
小和身份的片段插入导致 PsMLO1 基因功能丧失而
产生。
2.4 抗白粉病基因功能标记开发
根据 X9002、坝豌 6号 PsMLO1同源 cDNA序
列的差异设计 7对引物用于 X9002抗白粉病基因鉴
定。PCR扩增 X9002和坝豌 6号基因组 DNA, 引物
对 MLO1-5F/MLO1-5 R (5-TTTCAGAATGCCTTTC
AACT-3 / 5-CTAGAGCATAAAGAGGCAAA-3)在
坝豌 6 号中扩增出约 650 bp 的片段, 在抗病品种
X9002中不扩增。进一步用该引物对扩增 F2群体单
株基因组 DNA, 结果全部感病植株扩增一致的约
650 bp条带, 抗病植株中没有条带扩增(图 2), 表明
感病品种或单株中扩增的条带是一个与 X9002抗白
粉病基因互引相共分离的显性标记, 我们将其命名
为 PsMLO1-650。该标记可以用于等位基因 er1-2的
鉴定。
2.5 抗病基因的作图
用MapMaker 3.0分析X9002抗白粉病等位基因
er1-2 和连锁标记之间的遗传距离, 用 MapDraw 构
建遗传连锁图。在构建的连锁图中, 标记 AD60 和
c5DNAmet 均位于 er1-2 的一侧, 遗传距离分别为
11.9 cM和 9.0 cM, 功能标记 PsMLO1-650与 er1-2
共分离(图 3)。
3 讨论
迄今, 除发现一份豌豆近缘种 P. fulvum资源对
白粉病抗性为显性单基因控制外[14], 几乎所有豌豆
抗白粉病遗传分析都表明, 豌豆对白粉病的抗性由
一个隐性基因控制[4,6-12]。1969 年 Heringa 等[7]在豌
豆中鉴定 2 个独立遗传的隐性抗白粉病基因 er1 和
er2, 其中 SVP950和Mexique 4同时含有 er1和 er2。
然而, 随后的研究表明, SVP950 和 Mexique 4 对白
粉病的抗性仅由单个隐性基因 er1 控制[8-9]。除已证
第 4期 王仲怡等: 豌豆品系 X9002抗白粉病基因鉴定 519



图 1 部分野生型 PsMLO1编码序列与豌豆品系 X9002中鉴定的 3个 PsMLO1 cDNA同源区域的多重比对
Fig. 1 Multiple alignment among partial wild-type PsMLO1 coding sequence and homologous regions of three PsMLO1 cDNA
sequences identified in line X9002
520 作 物 学 报 第 41卷



图 2 功能标记 PsMLO1-650对部分坝豌 6号×X9002 F2代单株基因型鉴定结果
Fig. 2 Genotyping partial F2 plants derived from the cross of Bawan 6 × X9002 by functional marker PsMLO1-650
M: 100 bp DNA marker; X: X9002; B: 坝豌 6号; S: 感病单株; R: 抗病单株。
M: 100 bp DNA marker; X: X9002; B: Bawan 6; S: susceptible plants; R: resistant plants.


图 3 豌豆品系 X9002抗白粉病基因 er1-2和分子标记连锁图
Fig. 3 Linkage map of powdery mildew resistance gene er1-2
in pea line X9002 with molecular markers

明 SVP951、SVP952和 JI 2480中含有抗白粉病基因
er2 外, 大量不同地理起源的抗白粉病豌豆资源及
近缘种 P. sativum ssp. arvense和 P. fulvum的抗性均
由 er1 控制 [8-12,39]。er1 基因是大麦感白粉病基因
MLO家族成员, 其抗性由感病的野生型 PsMLO1功
能丧失获得。自然选择或化学诱变导致豌豆 er1 座
位发生碱基缺失、插入、代换、颠换等, 从而产生
不同的 er1等位基因。迄今已在 er1座位鉴定 5个等
位基因, 即 er1-1、er1-2、er1-3、er1-4和 er1-5[25-27]。
X9002 是甘肃省农业科学院最近选育的豌豆品系 ,
高抗白粉病。本研究表明, X9002对白粉病的抗性也
是由一个隐性基因控制, SSR 标记分析将该基因定
位到豌豆第 VI 连锁群上抗白粉病基因 er1 区域,
P00sMLO1 候选基因分析和功能标记鉴定确定该基
因为 er1 座位的等位基因 er1-2。法国皱粒型豌豆
Stratagem 是世界上最早鉴定的抗白粉病品种, 作为
抗源在欧洲、北美洲、印度等地区和国家被广泛利用,
大量的抗白粉病商业皱粒豌豆品种被育成 [29,40-41]。
1969年 Heringa等[7]将 Stratagem抗白粉病基因定名
为 er1。2011年 Humphry等[25]通过基因克隆技术进
一步确定 Stratagem 含有 er1-2 等位基因, 一个未知
大 小 和 身 份 的 大 片 段 插 入 感 白 粉 病 基 因
PsMLO1(Er1)序列导致严重变异的转录子产生 , 从
而获得对白粉病抗性。X9002为半无叶皱粒型豌豆,
其亲本之一可能来自法国的品系 90-PE-10。
90-PE-10 为半无叶皱粒型豌豆, 抗褐斑病、白粉病
等[42-43], 因此, 我们推测 X9002的 er1-2等位基因可
能来源于 Stratagem。
Marx[44]发现豌豆抗白粉病基因 er 与豌豆第 III
连锁群上的形态学标记 Gty 具有明显的连锁关系,
据此首先将 er 基因指派到第 III 连锁群。1990 年
Wolko 和 Weeden[45]将标记 Gty 放在了豌豆第 VI 连
锁群, 因此 er基因也应该位于第 VI连锁群。随着分
子标记技术发展, 不同类型的分子标记被应用到与
er 基因的连锁分析和作图。Dirlewanger 等[15]利用
RFLP标记构建了 er1基因第 1张分子连锁图, 证明
了该基因位于第 VI 连锁群。随后许多研究者对 er1
基因进行了分子作图和连锁标记的开发, 但不同研
究者获得的 er1 基因连锁标记不尽相同, 且相同连
锁标记与 er1 基因的遗传距离也存在较大差异[4]。
Timmerman等[17]开发了与 er1共分离的 SCAR标记
ScOPD10650, 但 Tiwari 等[18]发现该标记不能有效地
鉴定加拿大豌豆种质。用 RAPD 标记和 Highlight
(R)× Radley(S)组合衍生的 F3群体作图, Tiwari等[18]
获得了 3 个与 er1 连锁的 RAPD 标记, 其中标记
O P O 1 8 1 2 0 0 与 e r 1 基因互引相连锁且共分离 ,
OPE161600和 OPL61900与 er1 基因互斥相连锁, 遗传
距离分别为 4±2 cM 和 2±2 cM。随后 , 他们将
O P O 1 8 1 2 0 0 和 O P E 1 6 1 6 0 0 转换为 S C A R 标记
ScOPO181200和 ScOPE161600并成功用于豌豆资源的
鉴定。Janila和 Sharma[19]用 ScOPD10650、ScOPO181200
和 ScOPE161600 鉴定印度起源的豌豆种质 , 发现
ScOPD10650只有 80%的可靠性, 而 ScOPO181200和
ScOPE161600 不能区分抗、感品系, 连锁作图表明
ScOPD10650与 er1基因的遗传距离为 3.4 cM。Ek等[20]
以 Majoret(S)× 955180(R)组合 F2群体为材料, 获得
了 5个与 er1基因连锁的 SSR标记, 其中 SSR标记
AD60 与 er1 基因的距离最近, 为 10.4 cM。Pereira
等[21]利用 ISSR、RADPs 和 AFLPs 技术鉴定化学诱
第 4期 王仲怡等: 豌豆品系 X9002抗白粉病基因鉴定 521


变等位基因 er1mut2 的连锁分子标记, 所用标记还
包括 3 个 SCAR 标记 ScOPD10650、ScOPO181200、
ScOPE161600和 5个 SSR标记 A5、AA369、AA374、
AD51和AD60, 利用近等基因系和 BSA方法共获得
16个连锁分子标记, 但 3个 SCAR标记和 5个 SSR
标记中只有 ScOPE161600和 A5 与 er1mut2 连锁, 且
距离都大于 15 cM, 而其他标记不具多态性或不能
有效扩增。最近, Srivastava 等[22]开发了一个与 er1
基因紧密连锁的互引相 SCAR 标记 ScOPX04880, 该
标记和 SCAR标记 ScOPD10650分别位于 er1基因两
侧, 遗传距离为 0.2 cM和 2.2 cM。在本研究中, 首
先用 SSR 标记鉴定 X9002 抗白粉病基因连锁标记,
基于连锁的 SSR标记 AD60将抗病基因定位到第 VI
连锁群。由于 SSR 标记 AD60 已被 Ek 等[20]鉴定与
er1连锁, 遗传距离为 10.4 cM, 而本研究获得 AD60
与X9002抗白粉病基因遗传距离为 11.9 cM, 因此推
测 X9002抗白粉病基因为 er1座位等位基因。之后,
用前人开发的 4 个 SCAR 标记 ScOPD10650、
ScOPO181200、ScOPE161600和 ScOPX04880对亲本进
行鉴定, 但 4 个标记不能有效扩增或在亲本间扩增
单一条带。最后, 选择豌豆一致性功能连锁图谱第
VI连锁群上 SSR标记 AD60附近区域的功能基因标
记进行 X9002 抗白粉病基因连锁标记鉴定, 发现 5-
胞嘧啶 DNA 甲基转移酶基因 (cytosine-5 DNA-
methyltransferase)标记 c5DNAmet 为抗病基因连锁
标记。遗传作图表明, SSR 标记 AD60 和基因标记
c5DNAmet 位于 X9002 抗病基因一侧, 遗传距离分
别为 11.9 cM 和 9.0 cM。不同研究者开发的与 er1
基因连锁标记的通用性很差, 其中可能的原因是研
究材料的遗传背景存在较大差异。
基于 er1 座位等位基因间的序列差异和不同分
子标记技术, Pavan等[28]开发了用于 5个 er1等位基
因鉴定功能标记, 其中 er1-2的功能标记 er1-2/MGB
是基于基因内部一个未知大小和身份的插入片段设
计的 STS标记, 该标记在含 er1-2豌豆品种 Franklin
中扩增大约 2700 bp片段, 在感病品种 Sprinter中不
扩增。我们用功能标记 er1-2/MGB鉴定 X9002和坝
豌 6 号, 发现该标记在这 2 个品种中不能有效扩增,
其原因可能是 X9002 与 Franklin 在基因组水平上存
在较大的遗传差异。Pavan 等[28]用 er1-2/MGB 仅鉴
定了 Franklin一个品种, 并没有在其他含有 er1-2品
种或作图群体中进行验证。基于 PsMLO1cDNA序列
差异, 我们重新设计了 7对引物开发 er1-2功能标记,
获得一个能够在坝豌 6号基因组DNA有效扩增而在
X9002基因组 DNA不能扩增的引物对 PsMLO1-5F/
PsMLO1-5R。PsMLO1-5F 序列为 PsMLO1 基因组
DNA序列(KC466597)第 13外显子和第 13内含子的
一部分, PsMLO1-5R为 PsMLO1基因组DNA序列第
14 外显子一部分, 预期扩增 607 bp, 而在坝豌 6 号
中实际扩增 650 bp左右, 表明坝豌 6号 PsMLO1同
源基因组 DNA序列与 KC466597存在差异。功能标
记 PsMLO1-650 能够准确区分 F2群体抗感植株, 可
用于以 X9002为抗源的豌豆抗白粉病分子辅助选择
育种。
4 结论
豌豆品种 X9002对白粉病的抗性是由单隐性基
因控制, 遗传作图将该抗病基因定位于豌豆连锁图
谱第 VI 连锁群, SSR 标记 AD60 和 5-胞嘧啶 DNA
甲基转移酶基因标记 c5DNAmet 与抗病基因连锁。
X9002抗白粉病基因为 er1座位等位基因 er1-2。功
能标记 PsMLO1-650能够有效区分 F2群体抗病和感
病植株。
References
[1] Smýkal P, Aubert G, Burstin J, Coyne C J, Ellis N T H, Flavell A
J, Ford R, Hýbl M, Macas J, Neumann P, McPhee K E, Redden R
J, Rubiales D, Weller J L, Warkentin T D. Pea (Pisum sativum L.)
in the genomic era. Agronomy, 2012, 2: 74–115
[2] Li L, Redden R J, Zong X X, Berger J D, Bennett S J. Eco-
geographic analysis of pea collection sites from China to deter-
mine potential sites with abiotic stresses. Genet Resour Crop Evol,
2013, 60: 1801–1815
[3] FAOSTAT 2013. Available online: http://faostat3.fao.org/(ac-
cessed on 13 October 2014)
[4] Ghafoor A, McPhee K. 2012. Marker assisted selection (MAS)
for developing powdery mildew resistant pea cultivars. Euphytica
2012, 186: 593–607
[5] Fondevilla S, Rubiales D. Powdery mildew control in pea: a re-
view. Agron Sust Dev, 2012, 32: 401–409
[6] Harland S C. Inheritance of immunity to mildew in Peruvian
forms of Pisum sativum. Heredity, 1948, 2: 263–269
[7] Heringa R J, Norel A, Tazelaar M F. Resistance to powdery mil-
dew (Erysiphe polygoni DC.) in peas (Pisum sativum L.).
Euphytica, 1969, 18: 163–169
[8] Tiwari K R, Penner G A, Warkentin T D. Inheritance of powdery
mildew resistance in pea. Can J Plant Sci, 1997, 77: 307–310
[9] Vaid A, Tyagi P D. Genetics of powdery mildew resistance in pea.
Euphytica, 1997, 96: 203–206
[10] Sharma B. The Pisum genus has only one recessive gene for
powdery mildew resistance. Pisum Genet, 2003, 35: 22–27
[11] Sharma B. Identification of recessive er gene for powdery mil-
dew resistance in a landrace of Pisum sativum. Pisum Genet,
2003, 35: 30–31
522 作 物 学 报 第 41卷


[12] Liu S M, O’Brien L, Moore S G. A single recessive gene confers
effective resistance to powdery mildew of field pea grown in
northern New South Wales. Aust J Exp Agric, 2003, 43: 373–378
[13] Fondevilla S, Carver T L W, Moreno M T, Rubiales D. Macro-
scopic and histological characterization of genes er1 and er2 for
powdery mildew resistance in pea. Eur J Plant Pathol, 2006, 115:
309–321
[14] Fondevilla S, Torres A M, MorenoM T, Rubiales D. Identification
of a new gene for resistance to powdery mildew in Pisum fulvum,
a wild relative of pea. Breed Sci, 2007, 57: 181–184
[15] Dirlewanger E, Isaac P G, Ranade S, Belajouza M, Cousin R, Vi-
enne D. Restriction fragment length polymorphism analysis of
loci associated with disease resistance genes and developmental
traits in Pisum sativum L. Theor Appl Genet, 1994, 88: 17–27
[16] Katoch V, Sharma S, Pathania S, Banayal D K, Sharma S K,
Rathour R. Molecular mapping of pea powdery mildew resistance
gene er2 to pea linkage group III. Mol Breed, 2010, 25: 229–237
[17] Timmerman G M, Frew T J, Weeden N F. Linkage analysis of er1,
a recessive Pisum sativum gene for resistance to powdery mildew
fungus (Erysiphe pisi DC.). Theor Appl Genet, 1994, 88:
1050–1055
[18] Tiwari K R, Penner G A, Warkentin T D. Identification of cou-
pling and repulsion phase RAPD markers for powdery mildew
resistance gene er-1 in pea. Genome, 1998, 41: 440–444
[19] Janila P, Sharma B. RAPD and SCAR markers for powdery mil-
dew resistance gene er1 in pea. Plant Breed, 2004, 12: 271–274
[20] Ek M, Eklund M, Von Post R, Dayteg C, Henriksson T, Weibull P,
Ceplitis A, Isaac P, Tuvesson S. Microsatellite markers for pow-
dery mildew resistance in pea (Pisum sativum L.). Hereditas,
2005, 142: 86–91
[21] Pereira G, Marques C, Ribeiro R, Formiga S, Dâmaso M, Sousa T
M, Farinhó M, Leitão J M. Identification of DNA markers linked to
an induced mutated gene conferring resistance to powdery mildew
in pea (Pisum sativum L.). Euphytica, 2010, 171: 327–335
[22] Srivastava R K, Mishra S K, Singh K, Mohapatra T. Develop-
ment of a coupling-phase SCAR marker linked to the powdery
mildew resistance gene er1 in pea (Pisum sativum L.). Euphytica,
2012, 186: 855–866
[23] Jørgensen J H. Discovery, characterization and exploitation of
Mlo powdery mildew resistance in barley. Euphytica, 1992, 63:
141–152
[24] Pereira G, Leitão J. Two powdery mildew resistance mutations
induced by ENU in Pisum sativum L. affect the locus er1.
Euphytica, 2010, 171: 345–354
[25] Humphry M, Reinstädler A, Ivanov S, Bisseling T, Panstruga R.
Durable broad-spectrum powdery mildew resistance in pea er1
plants is conferred by natural loss-of-function mutations in
PsMLO1. Mol Plant Pathol, 2011, 12: 866–878
[26] Pavan S, Schiavulli A, Appiano M, Marcotrigiano A R, Cillo F,
Visser R G F, Bai Y, Lotti C, Luigi Ricciardi L. Pea powdery
mildew er1 resistance is associated to loss-of-function mutations
at a MLO homologous locus. Theor Appl Genet, 2011, 123:
1425–1431
[27] Santo T, Rashkova M, Alabaca C, Leitao J. The ENU-induced
powdery mildew resistant mutant pea (Pisum sativum L.) lines
S(er1mut1) and F(er1mut2) harbour early stop codons in the
PsMLO1 gene. Mol Breed, 2013, 32: 723–727
[28] Pavan S, Schiavulli A, Appiano M, Miacola C, Visser R G F, Bai
Y L, Lotti C, Ricciardi L. Identification of a complete set of func-
tional markers for the selection of er1 powdery mildew resistance
in Pisum sativum L. Mol Breed, 2013, 31: 247–253
[29] Ondřej M, Dostálová R, Hýbl M, Odstrčilová L, Tyller R, Trojan
R. Utilization of afila types of pea (Pisum sativum L.) resistant to
powdery mildew (Erysiphe pisi DC.) in the breeding programs.
Plant Soil Environ, 2003, 49: 481–485
[30] 曾亮, 李敏权, 杨晓明. 豌豆种质资源白粉病抗性鉴定. 草原
与草坪, 2012, 32: 35–38
Zeng L, Li M Q, Yang X M. Identification of resistance of peas
resources to powdery mildew. Grassland & Turf, 2012, 32(4):
35–38 (in Chinese with English abstract)
[31] 王仲怡, 包世英, 段灿星, 宗绪晓, 朱振东. 豌豆抗白粉病资
源筛选及分子鉴定. 作物学报, 2013, 39: 1030–1038
Wang Z Y, Bao S Y, Duan C X, Zong X X, Zhu Z D. Screening
and molecular identification of resistance to powdery mildew in
pea germplasm. Acta Agron Sin, 2013, 39: 1030−1038 (in Chi-
nese with English abstract)
[32] 付海宁, 孙素丽, 朱振东, 段灿星, 杨晓明. 加拿大豌豆品种
(系)抗白粉病表型和基因型鉴定. 植物遗传资源学报, 2014, 15:
1028−1033
Fu H N, Sun S L, Zhu Z D, Duan C X, Yang X M. Phenotypic
and genotypic identification of powdery mildew resistance in pea
cultivars or lines from Canada. J Plant Genet Resour, 2014, 15:
1028−1033 (in Chinese with English abstract)
[33] Rana J C, Banyal D K, Sharma K D, Sharma M K, Gupta S K,
Yadav S K. Screening of pea germplasm for resistance to pow-
dery mildew. Euphytica, 2013, 189: 271–282
[34] Michelmore R W, Paran I, Kesseli R V. Identification of markers
linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a
rapid method to detect markers in specific genomic regions by
using segregating population. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:
9828–9832
[35] Loridon K, McPhee K, Morin J, Dubreuil P, Pilet-Nayel M L,
Aubert G, Rameau C, Baranger A, Coyne C, Lejeune-Henaut I,
Burstin J. Microsatellite marker polymorphism and mapping in
pea (Pisum sativum L.). Theor Appl Genet, 2005, 111: 1022–1031
[36] Bordat A, Savois V, Nicolas M, Salse J, Chauveau A, Bourgeois
M, Potier J, Houtin H, Rond C, Murat F, Marget P, Aubert G,
Burstin J. Translational genomics in legumes allowed placing in
silico 5460 unigenes on the pea functional map and identified
candidate genes in Pisum sativum L. Genes Genome Genet, 2011,
1: 93–103
[37] Lander E S, Green P, Abrahamson J, Barlow A, Daly M J, Lin-
coln S E, Newburg L. MAPMAKER: an interactive computer
package for constructing primary genetic maps of experimental
and natural populations. Genomics, 1987, 1: 174–181
[38] Kosambi D D. The estimation of map distances from recombina-
tion values. Ann Eugen, 1944, 12: 172–175
[39] Sharma B, Yadav Y. Pisum fulvum carries a recessive gene for
powdery mildew resistance. Pisum Genet, 2003, 35: 31
[40] Pierce W H. Resistance to powdery mildew in peas. Phytopa-
thology, 1948, 38: 21
[41] Cousin R. Resistance to powdery mildew in pea. Ann Amélior
第 4期 王仲怡等: 豌豆品系 X9002抗白粉病基因鉴定 523


Plantes, 1965, 15: 93–97
[42] 王凤宝, 董立峰, 付金锋, 郑桂茹, 张柏昌, 梁润波, 聂亚琴,
宗云生, 李守训. 超高产豌豆新品种引种及配套栽培技术研
究. 河北农业技术师范学院学报, 1998, 12(4): 17–22
Wang F B, Dong L F, Fu J F, Zheng G R, Zhang B C, Liang R P,
Nie Y Q, Zong Y S, Li S X. Studies on introduction and culture
techniques of a new super high yielding pea variety. J Hebei
Agrotech Teachers College, 1998, 12(4): 17–22 (in Chinese with
English abstract)
[43] 董立峰, 王凤宝, 付金锋. 半无叶型甜豌豆新品种须菜 1 号的
选育. 长江蔬菜, 2008, (8): 45–46
Dong L F, Wang F B, Fu J F. Development of a new semi-leafless
sweet pea “Xucai No.1”. J Changjiang Vegetables, 2008, (8):
45–46 (in Chinese)
[44] Marx G A. Location of er proving elusive. Pisum Newsl, 1986,
18:39–41
[45] Wolko B, Weeden N F. Additional markers for chromosome 6.
Pisum Newsl, 1990, 22: 71–74