全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (2) : 81～ 84
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
基因组原位杂交鉴定栽培稻与广西
药用野生稻杂交后代染色体构成Ξ
胡文辉　舒理慧　宋运淳　祝莉莉　何光存ΞΞ
(武汉大学生命科学学院　武汉　430072)
提　要　广西药用野生稻 (O ry z a of f icina lis) 具有多种优良特性, 是水稻遗传育种的重要种
质资源之一。本实验以B io tin 标记的药用野生稻总DNA 作探针, 未标记的栽培稻 (O ry z a
sa tiva)总DNA 作封阻, 以HR P2DAB 系统进行信号检测, 对栽培稻与广西药用野生稻的杂种
F1 植株的根尖染色体制片进行基因组原位杂交。采用封阻比例 1∶20～ 30 时, 杂交效果较为
理想, 药用野生稻的 12 条染色体显深棕色, 而栽培稻的 12 条染色体着色很浅。在有丝分裂间
期的细胞核中, 也检测到大量杂交信号分布于核的周边。
关键词　广西药用野生稻, 远缘杂种, 基因组原位杂交
CHROMOSOM E ID ENT IF ICAT ION IN A HY BR ID OF
OR YZA SA T IVA ×O. O F F IC IN AL IS BY GENOM IC
IN S ITU HY BR ID IZAT ION3
H u W enhu i　Su L ihu i　Song Yunchun　Zhu L ili　H e Guangcun33
(Colleg e of L if e S ciences, W uhan U niversity　W uhan　430072)
Abstract　O ry z a of f icina lis found in Guangxi P rovince, Ch ina is an impo rtan t germp lasm that
po ssesses m any valuab le characterist ics such as resistance to b io tic and ab io tic stresses. W ith
b io tin2labelled to ta l genom ic DNA from O. of f icina lis as p robe, un labelled O. sa tiva to ta l
genom ic DNA as b lock ing and HR P2DAB fo r detection, w e app lied genom ic in situ
hybridization to som atic ch romo som e p reparat ions of O. sa tiva × O. of f icina lis F 1 hybrid.
W hen block ing ratio being 1∶20～ 30, 12 O. of f icina lis ch romo som es w ere clearly iden tified
from 12 O. sa tiva ch romo som es. O. of f icina lis ch romo som es appeared deep brow n, bu t O.
sa tiva ch romo som es co lo red ligh tly on ly. In in terphase nuclei, m any spo t2like hybridizat ion
signals w ere detected, distribu ting m ain ly along nucleus side.
Key words　O ry z a of f icina lis, W ide hybrid, Genom ic in situ hybridization
野生稻由于保存有多种栽培稻没有或已消失的优良性状, 是对栽培稻进行遗传改良ΞΞΞ 通讯联系人。收稿日: 1999207201, 修回日: 2000201210。第一作者: 男, 1972 年出生, 在读硕士生, 研究方向为植物分子遗传。本研究受国家“九五”攻关项目资助 (编号: 96200220220121)。
的重要物质基础。随着水稻育种工作的发展, 野生稻优良种质资源的利用上升到了突出位
置, 成为这一工作进一步取得突破的希望所在〔1, 2〕。通过有性杂交、组织培养和原生质体融
合等手段将野生稻的优良性状导入栽培稻的工作取得了重要进展〔1, 3, 4〕。在这一过程中,
将野生稻的染色体、染色体片断或特定DNA 序列从栽培稻遗传背景中鉴别出来并跟踪
其变化, 可以帮助我们了解野生稻基因转移过程中异种遗传物质之间的相互作用及其交
换重组规律, 并有助于了解特定染色体、染色体片段以及特定DNA 序列的功能及作用,
对野生资源基因利用的理论和实践具有重要意义。基因组原位杂交 (Genom ic in situ
hyb rid iza t ion) 是近年来原位杂交技术的一个新发展, 它能快速、准确、直观地将外源染色
体或外源染色体片段鉴别出来, 因而成为鉴定外源遗传物质的极为有效的手段。目前, 基
因组原位杂交技术已经在小麦、大麦等许多重要作物中获得成功应用〔5～ 7〕。在水稻中, 这
一技术的应用刚刚开始〔8, 9〕。本实验将这一技术应用于水稻的远缘杂种——栽培稻与广西
药用野生稻的杂交一代染色体的鉴定, 获得了较理想的效果, 展示了基因组原位杂交技术
在水稻遗传学研究和育种工作中的应用前景。
1　材料和方法
1. 1　实验材料
原产中国广西的药用野生稻 (O ry z a of f icina lis, CC, 2n = 24)、栽培稻珍汕 97B
(O ry z a sa tiva , AA , 2n= 24) 为本实验室保存, 二者的杂交一代 (A C, 2n= 24) 为本实验室
杂交获得。
1. 2　染色体制片
按姚青、宋运淳等的方法〔10〕略加改进。取生长旺盛的 F 1 植株的根尖在蒸馏水中处理
30 m in, 卡诺固定液 (甲醇∶冰乙酸= 3∶1) 固定 2 h 以上, 水洗后在 1% 纤维素酶21% 果
胶酶中 30～ 32℃酶解 315～ 410 h, 用蒸馏水洗净后浸于卡诺固定液中。用尖嘴吸管吸取 2
～ 3 个根尖置于经处理的干净载玻片中央, 捣碎后加 2～ 3 滴固定液, 火焰干燥法制片, 玻
片经显微镜镜检后- 20℃保存备用。
1. 3　基因组D NA 提取及探针的制备
采用CTAB 法提取药用野生稻和珍汕 97B 的总DNA〔11〕。药用野生稻总DNA 经机
械处理打断后, 用B io2112dU T P 以缺刻平移法进行标记。标记试剂盒购自华美生物工程
公司, 按试剂盒规定程序进行标记。探针制备好后经 Sepharo seCL 26B 凝胶离心柱纯化。
1. 4　原位杂交
参照L eitch 等〔12〕和M uku i 等〔6〕的方法进行。取出- 20℃保存的制片, 60℃烤片 1 h,
1 ΛgömL RN aseA 37℃处理 1 h, 70% 去离子甲酰胺 70℃变性 315 m in, 再经- 20℃的
70%、95%、100% 梯度酒精系列脱水, 各处理 5 m in, 然后置于空气中晾干。杂交液含 50%
去离子甲酰胺, 10% 硫酸葡聚糖, 2×SSC, 300 ΛgömL ssDNA , 3 ngöΛL 标记探针, 封阻
DNA (珍汕 97B 总DNA ) 60～ 90 ngöΛL (封阻比例为 1∶20～ 30)。上述杂交液于沸水中
变性处理 10 m in, 迅速转至冰上保持 5 m in 以上, 然后按每张制片 40 ΛL 将杂交液加在已
完全晾干的制片上, 盖上盖玻片, 置于保湿皿中, 在 88℃烘箱中加热 10 m in, 然后于 37℃
杂交 6～ 21 h。
28 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　
1. 5　杂交信号的检出
采用酶联免疫和HR P2DAB 显色系统检测杂交信号。杂交后的制片经 42℃下 20% 去
离子甲酰胺、2×SSC、011×SSC 浸洗各 15 m in, 室温下 011% T ritonX2100 浸洗 4 m in,
PBS 中浸洗 5 m in; 然后加羊抗生物素抗体 37℃保温 30 m in, PBS 洗片, 加生物素偶联的
兔抗羊抗体 37℃保温 30 m in, PBS 洗片, 再加链抗生物素2辣根过氧化物酶偶联物 (SA 2
HR P) 37℃反应 30 m in, 再经室温下 2×SSC 浸洗 5 m in、011% T ritonX2100 中 4 m in、
PBS 中 5 m in, 最后室温下加H 2O 22DAB (1, 22diam inobenzid ine)显色 10～ 20 m in, 自来水
漂洗 30 秒, 晾干后, 显微镜下观察并照相。
2　结果与讨论
本实验的材料为原产我国广西的药用野生稻 (染色体组CC, 2n= 24) 与栽培稻珍汕
97B (染色体组AA , 2n= 24) 的杂交一代, 其染色体数目为 24 条, 其中药用野生稻与栽培
稻来源的染色体各占 12 条。实验结果显示, 在中期分裂相中 12 条染色体着色较深, 呈棕
红或红褐色, 而其余的染色体着色很淡或基本不着色 (图 1、图 2)。着色较深的染色体是探
针杂交上去后, 酶联免疫显色的结果, 因此这些染色体应为药用野生稻来源的染色体; 其
它着色很浅的染色体则为栽培稻的染色体。
图 1　有丝分裂中期染色体(2n= 24) (12 条药用野生
稻染色体着色较深, 12 条栽培稻染色体着色较浅)
F ig. 1　M atephase ch romo som es of F1 of
O. of f icina lis×O. sa tiva (2n= 24)
after genom ic in situ hybrid ization
图 2　有丝分裂早中期染色体(2n= 24)
(其中 12 条染色体信号明显, 为药用野生稻
染色体, 染色体上信号分布不均一)
F ig. 2　Early m atephase ch romo som es of F1 of
O. of f icina lis×O. sa tiva after G ISH
　　在图 2 中, 药用野生稻染色体上信号的分布不均一, 染色体的某些区段或部位呈现较
强的信号。图 2 的分裂相正处在早中期, 因此这可能是由于早中期染色体在集缩过程中集
缩程度不一致造成的。
在间期核中也可以看见大量点状的杂交信号, 这些信号相对集中地分布于核周边的
一定区域, 显示了这些区域药用野生稻染色质的分布 (图 3)。
本实验对 1∶0、1∶10、1∶20、1∶30 这几种封阻比例进行了比较, 发现当封阻比例为
1∶20～ 30 时杂交结果较好, 信号染色体与背景染色体反差明显 (图 1、图 2)。颜辉煌等
(1999) 对栽培稻与原产马来西亚的药用野生稻的杂种 F 1 及回交后代进行基因组原位杂
38　第 2 期　　　　　　胡文辉等: 基因组原位杂交鉴定栽培稻与广西药用野生稻杂交后代染色体构成
图 3　有丝分裂间期核中分布着大量
点状杂交信号(这些信号点相对集中
于核的周边, 在核中央分布较少)
F ig. 3　D etects of m any spo t2like
hybrid ization signals in in terphase
nucleus after G ISH
交研究时, 比较了 1÷0、1÷4、1÷ 16 这几种封阻比例, 发现
1÷16的封阻比例效果较好, 这与本实验结果相近。本实验
未用 Giem sa 进行复染, 因为在实验中发现, Giem sa 复染
后往往造成信号染色体与背景染色体之间反差降低。现
在荧光检测系统 (F ISH ) 采用较多, 这可能是更为有效的
手段〔8, 9〕。
基因组原位杂交技术在远缘杂种中外源染色质的鉴
定方面是一个强有力的工具〔13～ 15〕。一些研究者已有的工
作〔8, 9〕以及本实验的工作说明, 对于水稻这种染色体很小
的物种, 这一技术也是非常有效的。事实上由于水稻染色
体很小, 通过传统的核型或带型分析鉴别远缘杂种中携带
的外源染色体或染色体片段很困难〔16〕, 因而在这一领域
基因组原位杂交技术的应用具有更明显的优势。
致谢　本实验得到武汉大学植物分子细胞遗传学实验室覃瑞等的大力支持和帮助, 在此表示感谢。
参 考 文 献
1　何光存. 野生稻优异种质资源利用的有效途径. 生物工程进展, 1998, 18 (2) : 41～ 45
2　T ank sley S D ,M cCouch S R. Seed bank s and mo lecu lar m ap s: U nlock ing genetic po ten tial from the w ild. S cience,
1997, 277: 1 063～ 1 066
3　何光存, 舒理慧, 廖兰杰等. 疣粒野生稻体细胞超低温保藏与原生质体培养体系的确立. 中国科学 (C 辑) , 1998, 28
(5) : 444～ 449
4　B rar D S, Khush G S. A lien in trogression in rice. P lan t M ol B iol, 1997, 35: 35～ 47
5　Schw arzacher T , A nam thaw at2Jonsson K, H arrison G E et a l. Genom ic in situ hybrid ization to iden tify alien
ch romo som es and ch romo som e segm ents in w heat. T heor A pp l Genet, 1992, 84: 778～ 786
6　M ukai Y, Gill B S. D etection of barley ch rom atin added to w heat by genom ic in situ hybrid ization. Genom e, 1991,
34: 448～ 452
7　马有志, 富田因则, 中田升等. 应用分子原位杂交技术解析小麦2天兰冰草部分双二倍体——远中二号的染色体
构成. 遗传学报, 1997, 24 (4) : 344～ 349
8 　 Fuku i K, Sh ish ido R , Kino sh ita T. Iden tification of the rice D 2genom e ch romo som es by genom ic in situ
hybrid ization. T heor A pp l Genet, 1997, 95: 1 239～ 1 245
9　颜辉煌, 程祝宽, 刘国庆等. 栽培稻2药用野生稻杂种F1 及回交后代的基因组原位杂交鉴定. 遗传学报, 1999, 26
(2) : 157～ 162
10　姚青, 宋运淳, 刘立华. 水稻染色体G2带的研究. 遗传学报, 1990, 17 (4) : 301～ 307
11　M urray M G, T homp son W F. Rap id iso lation of h igh w eigh t p lan t DNA. N ucleic A cid s R es, 1980, 8: 4 321～ 4 325
12 　L eitch A R , M o sgo ller W , Schw arzacher T et a l. Genom ic in situ hybrid ization to sectioned nuclie show s
ch romo som e dom ains in grass hybrids. J Cell S ci, 1990, 95: 335～ 341
13　H eslop2H arrison J S, Bennett M D. N uclear arch itectu re in p lan t. T rend s Genet, 1990, 6: 401～ 405
14　Schw arzacher T , L eitch A R , BennettM D et a l. In situ localization of paren tal genom es in a w ide hybrid. A nn B ot,
1989, 64: 315～ 324
15　Bennett S T , Ken ton A Y, Bennett M D. Genom ic in situ hybrid ization reveals the allopo lyp lo id natu re of M ilium
m on tianum (Gram ineae). Ch rom osom a, 1992, 101: 420～ 424
16　角田重三郎, 高桥成人. 水稻生物学. 武汉: 武汉大学出版社, 1988. 401～ 418
48 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷