全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(10): 17481755 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA101107-3)和湖南农业大学作物学开发基金项目(ZWKF201303)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 熊兴华, E-mail: ndxiongene@yahoo.com, Tel: 13508487613
第一作者联系方式: E-mail: 1045790170@qq.com
Received(收稿日期): 2014-03-10; Accepted(接受日期): 2014-07-06; Published online(网络出版日期): 2014-07-25.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140725.1048.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01748
甘蓝型油菜 LPAT4基因的克隆与表达
肖旦望 1 刘 聪 1 胡学芳 1 陈社员 2 官春云 2 熊兴华 1,2,*
1湖南农业大学 / 作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128; 2 湖南农业大学 / 国家油料改良中心湖南分中心, 湖南长沙
410128
摘 要: 植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid actyltransferase, LPAT)是三酰甘油生物合成过程中的一个
关键酶, 在脂质的合成、种子的发育以及生物膜的流动性等方面有重要作用。本研究采用同源克隆的方法, 获得
LPAT4基因的 2条全长 CDS, 长度分别为 1143 bp和 1140 bp。生物信息学分析表明, 它们均具有 LPLAT_LCLAT1样
结构域, 同属于 LPLAT 超基因家族, 并分别被命名为 BnLPAT4-1 和 BnLPAT4-2。时空表达分析表明, 它们均为组成
型表达基因, 其中 BnPAT4-1 在叶中的表达量最高, 而 BnLPAT4-2 在胚中的表达量最高。逆境分析表明, BnLPAT4-1
和 BnLPAT4-2 在 NaCl、PEG-4000、水渍、6BA 和 ABA 的胁迫下呈现出不同的表达模式。极差分析显示, ABA 对
BnLPAT4-1 的表达影响较大, 而 BnLPAT4-2 的表达对 PEG-4000 更敏感。本试验为进一步研究油菜 BnLPAT4 基因功
能奠定了基础。
关键词: LPAT4; 甘蓝型油菜; 时空表达; 非生物逆境; 表达分析
Cloning and Expression of LPAT4 Genes from Brassica napus
XIAO Dan-Wang1, LIU Cong1, HU Xue-Fang1, CHEN She-Yuan2, GUAN Chun-Yun2, and XIONG
Xing-Hua1,2,*
1 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province / Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Hunan Branch of National
Oilseed Crops Improvement Centre / Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: Lysophospholipid acid actyltransferase (LPAT) is a pivotal enzyme of triacylglycerol biosynthesis and plays a key role
in lipid synthesis, development of plant seeds and bio-membrane fluidity. Two LPAT4 full-length coding sequences (1143 bp and
1140 bp) were obtained by homology-based cloning, designated BnLPAT4-1 and BnLPAT4-2, respectively. Bioinformatics analysis
revealed that they share the LPLAT_LCLAT1 like domain and belong to the LPLAT super family. Temporal and spatial expression
results showed that BnLPAT4-1 and BnLPAT4-2 are genes of constitutive expression, with the highest expression in leaf and em-
bryo, respectively. BnLPAT4-1 and BnLPAT4-2 showed different expression patterns under NaCl, PEG-4000, waterlogging, 6BA
and ABA stresses. Pole difference analysis indicated that BnLPAT4-1 was regulated greatly by ABA, while BnLPAT4-2 was more
sensitive to PEG-4000. These results are informative for function study of BnLPAT4 genes in Brassica napus.
Keywords: LPAT4; Brassica Napus; Temporal and spatial expression; Abiotic stress; Expression analysis
高等植物中甘油脂的合成存在真核途径与原核
途径[1]。通过原核途径形成的脂质称为原核脂质, 原
核脂质在质体中合成。同理, 由真核途径形成的脂
质称为真核脂质, 真核脂质的合成却是在内质网。
真核脂质与原核脂质的主要区别在于sn-2位置上脂
肪酸的组成, 原核脂质sn-2位置上主要为C16脂肪酸,
而真核脂质sn-2位置上却主要为C18不饱和脂肪酸[2]。
溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT; EC 2.3.1.51)作为TAG
组装过程中介导sn-2位置上酰基化反应的一个关键
酶, 具有催化溶血磷脂酸转变成磷脂酸的功能[3]。因
此LPAT对于甘油脂的立体分布 (stereospecific dis-
tribution)具有重要意义。
现已从拟南芥[4]、椰子[5-7]、油菜[8-9]、甘蓝[10]、
绣线菊[11-12]、棕榈[13]、玉米[14]、红花[15-16]、蓖麻[17]
第 10期 肖旦望等: 甘蓝型油菜 LPAT4基因的克隆与表达 1749
和花生[18]等植物中分离LPAT。研究表明, LPAT存在
多种异构酶, 如拟南芥中至少存在6种异构酶, 其中
LPAT1定位于质体, 与胚胎发育密切相关[19]; LPAT2
定位于内质网, 影响雌配子的发育; LPAT3定位未知,
却主要在花粉中表达 [4]; 而在体外检测不到LPAT4
和LPAT5的溶血磷脂酸酰基转移酶活性, 它们可能
与心磷脂合成有关 [2]。最近又发现了一个由At4g
24160编码的可溶性LPAT, 兼具脂酶和水解酶活性,
推测其在维持膜脂稳定性上具有重要作用[20]。
LPAT与含油量的关系是前人研究LPAT的主要
出发点。Maisonneuve等[21]研究表明, 拟南芥中2个
油菜LPAT异构酶, 都能够以增加油含量和种子质量
的形式来增加产量。Suryadevara等[22]利用菜豆球蛋
白启动子介导酵母SLC1基因在大豆中表达, 其体细
胞胚、T2代和T3代种子的含油量均增加。戚维聪等[23]
研究油菜种子发育过程中Kennedy途径的各种酶的
活性变化 , 发现 1-酰基甘油 -3-磷酸酰基转移酶
(LPAAT)活性最高 , 且高含油量品系中LPAAT活性
高于低含油量品系。陈四龙等 [24]研究发现 , 花生
LPAT4的表达量与种子含油量积累速率一致。
非生物逆境作为一个外在影响因素, 对LPAT的
表达具有调控作用。目前 , 关于非生物逆境对于
LPAT的影响主要集中在高盐、干旱、低温、渗透压
和生长素类似物等5个方面。研究显示, 低温能够抑
制拟南芥LPAT1的表达 , 降低含高熔点脂肪酸的磷
酯酰甘油比例, 从而适应低温条件下的生长[25]。但
有趣的是 , 低温条件下 , 拟南芥可溶性LPAT基因
(At4g24160)的表达上调, 且在高盐、缺氧和渗透压
的条件下, 该基因的表达呈相同趋势。而玉米素和
高温却抑制该基因的表达。
目前 , 油菜中已经克隆了 4个LPAT基因 , 即
BAT2 (或ACT2)[8]、BAT1.5、BAT1.12和BAT1.13[21], 其
中 , BAT2为LPAT1, BAT1.5、BAT1.12和BAT1.13为
LPAT2, 其余油菜LPAT异构酶基因均未见报道。本研
究从甘蓝型油菜湘油15中克隆了2个LPAT4基因, 并
进行了核苷酸和蛋白质的聚类分析以及时空表达与
逆境表达分析, 为进一步研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
湘油15 (本实验室保存), pMD-19T载体购自宝
生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。反转录试剂盒、
TransZol UP植物总RNA提取试剂盒、DNA胶回收试
剂盒、DEPC、高保真DNA聚合酶、dNTPs、100 bp
DNA Marker、DNase I等均购自北京全式金生物技术
有限公司 (TransGen)。非生物逆境处理试剂PEG-
4000、ABA、6BA和NaCl等购自索莱宝科技有限公
司(Solarbio)。
1.2 LPAT4基因克隆
从拟南芥数据库(http://www.arabidopsis.org/)获
取AtLPAT4基因序列。然后在Bioinformatics at Geboc
数据库 (http://122.205.95.67/blast/blast.php/)检索获
得白菜(AA)和甘蓝(CC)的同源基因序列以及甘蓝型
油菜与AtLPAT4基因同源的EST序列。用Vector软件
拼接获得的油菜EST序列, 并将拼接后的序列与白
菜和甘蓝LPAT4基因序列进行比对, 用Primer 5设计
引物(表1)。将上述引物送交北京鼎国昌盛生物技术
有限责任公司合成。
表 1 PCR引物与参数
Table 1 PCR primers and parameters
引物名称
Primer name
上游引物
Forward primer (5–3)
下游引物
Reverse primer (5–3)
退火温度
Annealing temperature (℃)
循环数
No. of cycles
LPAT4 GGTTTTATCTGGAAAAGATGGAAG ATGTATGTACAACAGAGTTAATGG 54 35
BnE4.1 TGGCCTTACCTCTTCGAAACGA GCAGCGAGGCTTATACGCTATA 64 27
BnE4.2 TGGCCTTACCTCTTCGAAAAAG AGCGAGGCTTGTATGCGATG 60 27
ACTIN CGAGCAGGAGATGGAGACT GCTGAGGGAAGCAAGAATG 58 28
在22℃、光周期为16 h/8 h条件下培养至2片真
叶 , 取幼苗50~100 mg, 加液氮充分研磨后 , 按照
Trans UP试剂盒提供的方法, 提取总RNA的。总RNA
的提取以及第1链cDNA的合成的具体方法, 分别参
见TransGen TRIzol RNA提取试剂盒和EasyScript
First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书。
以上述 cDNA为模板进行 PCR扩增。PCR体系
含模板 1 μL、10 mmol L–1 dNTPs 0.5 μL、2 μmol L–1
LPAT4-Fw 0.75 μL、2 μmol L–1 LPAT4-Rv 0.75 μL、
10×反应缓冲液 1 μL、HiFi高保真DNA聚合酶 0.5 μL
和 ddH2O 5.5 μL。程序为预变性 94 3℃ min, 94 ℃
45 s, 54 45℃ s, 72 90℃ s, 35个循环 , 72℃延伸
1750 作 物 学 报 第 40卷
10 min。PCR 扩增产物经 1.5%的琼脂糖凝胶检测,
并回收目标带。将回收产物克隆至 pMD19-T 载体,
经菌落 PCR鉴定后, 挑取 10个阳性克隆送北京六合
华大分公司测序。
1.3 LPAT4序列分析
利用NCBI数据库分别对BnLPAT4-1和BnLPAT4-
2进行BlastN和BlastP序列比对分析。使用Mega5.2进
行油菜、拟南芥、白菜和甘蓝的LPAT4的相似性以及
多态性分析。利用Expasy数据库进行理化性质预测、
氨基酸二级结构预测、保守结构域和同源建模分析
以及氨基酸功能预测。
1.4 LPAT4聚类分析
将拟南芥、白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜的核苷
酸序列, 经Mega5.2进行UPGMA聚类。从NCBI数据
库中检索其他已知植物的LPAT4氨基酸序列, 与拟
南芥LPAT家族氨基酸序列用Mega5.2进行UPGMA
分析。
1.5 时空表达分析
分别提取湘油 15开花期植株的根、茎、叶、花
以及开花后 1、2和 3周的胚和果荚的总 RNA, 进行
半定量 RT-PCR 分析。以甘蓝型油菜 ACTIN
(FJ529167.1)基因为内参进行半定量 RT-PCR, 检测
甘蓝型油菜 BnLPAT4-1 和 BnLPAT4-2 基因表达。
RT-PCR体系 10 μL, 含 5 U μL–1 DNA聚合酶 0.2 μL、
10 mmol L–1 dNTPs 0.1 μL、10×PCR缓冲液 1 μL、
50 ng μL–1模板 1 μL、2 μmol L–1正反引物各 0.5 μL
和 ddH2O 6.7 μL。PCR程序为 94℃变性 3 min, 94℃
变性 30 s, 复性 30 s, 72℃延伸 40 s, 循环 27~35次,
72℃延伸 10 min, 4℃恒温保存。所用引物、退火温
度及循环次数信息见表 1。
1.6 非生物逆境胁迫表达分析
将油菜种于育苗盆中 , 待长出4~5片真叶时用
于NaCl、PEG-4000、水渍、6BA和ABA处理。分别
提取处理后油菜叶片RNA进行半定量RT-PCR分析,
各处理取样时间段分别为处理后0、3、6、12和24 h。
PCR体系及条件同1.5。处理方法参照文献[25]、[26]
和[27], 略有改变。水渍处理是将育苗钵浸泡至清水
中 , 水面淹没油菜根部 ; 干旱胁迫是用20% PEG-
4000溶液喷洒油菜叶面浇灌根部 ; 盐胁迫是以
300 mmol L–1 NaCl溶液喷洒叶面和浇灌根部; 植物
生长调节剂处理是分别将浓度为0.1 mg L–1 6BA和
3 mg L–1 ABA溶液喷洒叶面和浇灌根部。叶面喷洒
量为每株2 mL, 根部浇灌量即将育苗钵中土壤浇透,
约每钵50 mL。
1.7 极差分析
以极差比较 NaCl、PEG-4000、水渍、6BA 和
ABA对 BnLPAT4-1及 BnLPAT4-2表达的影响, 极差
= (最大值表达值–最小值表达值)/初始表达值, 进行
极差分析前, 将所有处理的初始表达值定义为“1”。
2 结果与分析
2.1 LPAT4全长 CDS序列的克隆
从湘油15幼苗中提取总RNA, 以反转录合成的
cDNA为模板 , 扩增出长度约为1200 bp的cDNA片
段。测序结果显示, 获得2条表达序列(CDS), 长度分
别为 1143 bp和 1140 bp, 并将其分别命名为
BnLPAT4-1和BnLPAT4-2。
2.2 LPAT4基因序列比对与聚类分析
经Blast分析, BnLPAT4-1、BnLPAT4-2与拟南芥
LPAT4全长CDS (NM_202415.1)的相似度最高, 分别
为86%和85%, 序列的覆盖度分别为93%和98%。
BlastX分析发现, 氨基酸序列的比对结果与核苷酸
序列的比对结果基本相同。BnLPAT4-1与拟南芥
LPAT4 (NP_565098.1)氨基酸序列相似度为 85%,
BnLPAT4-2与拟南芥LPAT4 (NP_565098.1)氨基酸序
列相似度为86%。BnLPAT4-1与BnLPAT4-2氨基酸序
列的相似度为96%。
以 Mega5.2对拟南芥、白菜、甘蓝、BnLPAT4-1
和 BnLPAT4-2 比对 (图 1)表明 , BnLPAT4-1 与
BolLPAT4-2 序列非常相似, 相似度为 99.6%, 多态
性为 0.4%。而 BnLPAT4-2 与 BraLPAT4-2 序列相似
度 为 99.9%, 多 态 性 为 0.1%。 BnLPAT4-1 与
BnLPAT4-2的相似度为 96.8%, 说明序列具有高度一
致, 证明扩增所得的 2条 CDS为 LPAT4基因, 属于
甘蓝型油菜湘油 15 LPAT4基因的 2个拷贝。
2.3 LPAT4氨基酸序列分析及其结构功能预测
通过 Expasy 蛋白质数据库(http://www.expasy.
org/)对 BnLPAT4-1 和 BnLPAT4-2 的理化性质预测分
析显示, BnLPAT4-1共编码 380个氨基酸, 其相对分
子质量为 43.29 kD, 等电点为 8.74。其带正电荷氨
基酸为 Lys 和 Arg, 占氨基酸总数的 11.1%, 带 42
个单位的正电荷。带负电的氨基酸为Asp和Glu, 占
氨基酸总数的 9.4%, 带 36 个单位的负电荷。
BnLPAT4-2 共编码 379 个氨基酸, 其相对分子质量
为 43.16 kD, 等电点为 8.93。其带正电荷氨基酸为
Lys和 Arg, 占氨基酸总数的 11.3%, 带 43个单位的
第 10期 肖旦望等: 甘蓝型油菜 LPAT4基因的克隆与表达 1751
图 1 拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜 LPAT4基因核苷酸序列聚类分析
Fig. 1 Phylogenetic tree of LPAT4 genes CDS from A. thaliana, B. rapa, B. oleracea, and B. napus
BraLPAT4-1和 BraLPAT4-2来自白菜, 分别定位于 A02和 A07染色体; BolLPAT4-1和 BolLPAT4-2来自甘蓝, 分别定位在 C02和 C07
染色体(来源于 Bioinformatics at Geboc数据库); ●标记的 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2表示从甘蓝型油菜克隆的 LPAT4基因序列。
BraLPAT4-1 and BraLPAT4-2 from B. rapa were located on chromosome A02 and A07, respectively; BolLPAT4-1 and BolLPAT4-2 from B.
oleracea, were located on chromosome C02 and C07, respectively; the BnLPAT4-1 and BnLPAT4-2 marked with
● mean LPAT4 gene sequences from B. napus.
正电荷。带负电的氨基酸为Asp和Glu, 占氨基酸总
数的9.2%, 带35个单位的负电荷。这2个基因所编码
的蛋白均为不稳定蛋白 , 其稳定性在46%左右 , 在
酵母细胞内的半衰期约为20 h, 在大肠杆菌细胞内
的半衰期约为10 h。它们均具有很高的脂肪族性质,
脂肪族指数高达0.97, 同时具有较高的缩水性, 缩水
性指数约为0.11。
以 SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_
automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)氨基酸二
级结构分析工具, 对 BnLPAT4-1 及 BnLPAT4-2 所编
码的氨基酸分析结果如图 2所示, BnLPAT4-1所编码
蛋白的二级结构中 48.95%为 α螺旋, 14.47%为 β折
叠, 4.74%为 β转角, 31.83%为无规卷曲。BnLPAT4-2
所编码蛋白的二级结构中, α 螺旋、β 折叠、β 转角
以及无规卷曲所占的比例依次为 42.22%、15.57%、
3.17%和 39.05%。
图 2 湘油 15 LPAT4基因编码产物的二级结构
Fig. 2 Secondary structure of protein coded by LPAT4 of Xiangyou 15
通 过 NCBI 的 Blast 工 具 对 BnLPAT4-1 和
BnLPAT4-2蛋白的保守结构域分析显示 , 它们均具
有LPLAT_LCLAT1样结构域, 属于LPLAT超基因家
族。通过Swiss-Model (http://expasy.hcuge.ch/swissmod/
SWISS-MODEL.html)同源建模数据显示, BnLPAT4-
1和BnLPAT4-2蛋白均适用溶血磷脂酸酰基转移酶
模型。进一步说明BnLPAT4-1和BnLPAT4-2是LPLAT
基因家族中的2个成员。
2.4 LPAT氨基酸聚类分析
以 BnLPAT4-1 氨基酸序列为参考序列 , 经
BlastP, 从数据库中获取其他已知植物的 LPAT4 氨
基酸序列。以 Mega 5.2将 BnLPAT4-1 (AHV90568.1)
和 BnLPAT4-2 (KJ184846AHV90569.1)的氨基酸序
列同白菜(Bra003775和 Bra008174)、甘蓝(Bol1039918
和 Bol1039918)、鹰嘴豆(XP_004499122.1)、大豆
(XP_003550365.1)、玉米(NP_001151948.1)、番茄
(XP_004238219.1)、黄瓜(XP_004152713.1)、葡萄
(XP_002281838.2)、野草莓(XP_004293226.1)、可可
树(EOY14678.1)、甘蓝型油菜已知 LPAT (AEE01048.1、
AAF73736.1、ADC97479.1、ADC97480.1和ADC97478.1)
以及拟南芥 LPAT家族[ATS2或 LPAT1(NP_194787.2),
LPAT2(NP_567052.1), LPAT3(NP_175537.1), LPAT4
(NP_565098.1 和 NP_974144.1)和 LPAT5(NP_
001078184.1、NP_188515.1、NP_001030724.2、NP_
1752 作 物 学 报 第 40卷
974335.1 和 NP_001078183.1)]的氨基酸序列进行
UPGMA聚类分析(图 3)。以 0.4为节点, 29条氨基酸
序列大致可以分成以拟南芥 LPAT 家族 5 个成员为代
表的 5大类。第 I类为 LPAT1, 包括拟南芥 ATS2和油
菜 ACT2-1和 ACT2-2; 第 II类为 LPAT2, 包括拟南芥
LPAT2 和油菜 BAT1.5、BAT1.12 和 BAT1.13; 第 III
类为 LPAT3, 仅含拟南芥 LPAT3; 第 IV 类为 LPAT4,
包括拟南芥 LPAT4-1 和 LPAT4-2、鹰嘴豆(XP_
004499122.1)、大豆(XP_003550365.1)、玉米(NP_
001151948.1)、番茄(XP_004238219.1)、黄瓜(XP_
004152713.1)、葡萄(XP_002281838.2)、野草莓(XP_
004293226.1)、可可树(EOY14678.1)、白菜(Bra003775
和 Bra008174)、甘蓝(Bol1039918和 Bol1039918)和甘
蓝型油菜 (BnLPAT4-1 和 BnLPAT4-2); 第 V 类为
LPAT5, 主要为拟南芥LPAT5-1至LPAT5-5。BnLPAT4-
1 和 BnLPAT4-2 属于第 IV 类, 且 BnLPAT4-1 同
BolLPAT4-2亲缘关系较近, BnLPAT4-2与 BraLPAT4-2
亲缘关系较近, 而 BraLPAT4-1 和 BolLPAT4-1 的亲缘
关系较近。故而, 从氨基酸聚类上也可认为, BnLPAT4-
1和BnLPAT4-2是甘蓝型油菜LPAT4家族的2个成员。
2.5 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2的时空表达
半定量 RT-PCR 结果表明 , BnLPAT4-1 和
BnLPAT4-2 在根、茎、叶、花、胚以及果荚中均表
达, 并且表达模式不同。其中 BnLPAT4-1 在叶中表
图 3 不同植物可能的 LPAT4及拟南芥 LPAT家族氨基酸聚类图
Fig. 3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of probable LPAT4 of the other species and Arabidopsis thaliana LPAT family
具♦标记的 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2表示从甘蓝型油菜克隆的 LPAT4氨基酸序列; ●表示已报道的甘蓝型油菜 LPAT氨基酸序列。
The BnLPAT4-1 and BnLPAT4-2 marked with ♦ indicates mean LPAT4 amino acid sequences from B. napus, and the reported LPAT
amino acids sequences of B. napus were marked with ●.
第 10期 肖旦望等: 甘蓝型油菜 LPAT4基因的克隆与表达 1753
达量最高, 在茎中表达量次之, 在根中的表达量最
低; 而 BnLPAT4-2 在胚中的表达量普遍比其他组织
中的表达量高, 其中以 4 周胚中表达量最高, 同样,
在根中的表达量最低。BnLPAT4-1 在胚及果荚中表
达量随时间的变化趋势基本相同, 都是先升高后降
低, 在胚及果荚中的最大表达值, 均出现在第 3 周
前后。BnLPAT4-2 在胚和果荚中呈现不同的变化趋
势, BnLPAT4-2 在胚中的表达模式为先降低后升高
再降低, 在果荚中却是先升高后降低再升高(图 4)。
图 4 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2的时空表达
Fig. 4 Temporal and spatial expression of BnLPAT4-1 and
BnLPAT4-2
1~4: 根、茎、叶和花; 5~9: 花后 1~5周胚; 10~13: 花后 1~4周
果荚。
1–4: root, stem, leaf and flower; 5–9: embryos at 1 to 5 weeks after
pollination; 10–13: capsules at 1 to 4 weeks after pollination.
2.6 BnLPAT4-1 和 BnLPAT4-2 逆境胁迫下的表
达模式
BnLPAT4-1在NaCl、PEG-4000和水渍的处理下,
基本上均呈现出先降低后升高的表达模式 , 而在
6BA及ABA的处理下却呈现出先升高后降低再升高
的表达模式。在上述5种处理条件下, BnLPAT4-1表达
的最小值分别出现在6、6、3、6和12 h, 其对应的最
小值分别为空白组的0.20、0.12、0.08、0.12和0.17倍。
BnLPAT4-2的表达较BnLPAT4-1而言, 存在一定
的差异。在NaCl及PEG-4000的处理下, BnLPAT4-2呈
现先降低后升高再降低, 且最大表达值超过对照组,
其对应的最小值分别出现在3 h和6 h, 且其对应的
表达值是对照组的0.74倍和0.25倍。在水渍处理时,
虽与NaCl和PEG-4000处理下呈现相同的趋势, 但其
在整个试验过程中表达量却始终低于对照组。在
6BA和ABA的处理下, BnLPAT4-2的表达呈现先降低
后升高的趋势。相应处理下, BnLPAT4-2的最低表达
值均出现在12 h, 其表达量分别为空白组的0.55倍
和0.15倍。
利用极差评估 NaCl、PEG-4000、水渍、6BA和
ABA对 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2表达的影响, ABA
对 BnLPAT4-1的影响最大, NaCl对 BnLPAT4-1的影
响最小, PEG4000对 BnLPAT4-2的影响最大, 6BA对
BnLPAT4-2的影响最小。
3 讨论
无论是从核苷酸聚类还是从氨基酸聚类, 都显
示出相同的结果 , BraLPAT4-1与BolLPAT4-1的亲缘
关系较近 , 而BraLPAT4-2与BolLPAT4-2亲缘关系较
近。这与芸薹属A、B、C染色体组间的异源配对的
频率高于每个染色体组内的同源配对频率, 染色体
组组间的同源性高于染色体组内的同源性的结论相
一致[21]。基于A、B、C基因组间亲缘关系存在这样
的特点, 所以仅凭一般的聚类和序列分析很难对甘
蓝型油菜的A/C基因组分型。通过对BnLPAT4-1和
BnLPAT4-2所编码蛋白的理化性质预测分析表明, 这
2个基因所编码的蛋白均为不稳定蛋白, 其稳定性在
46%左右, 在酵母细胞内的半衰期约为20 h, 在大肠
杆菌细胞内的半衰期约为10 h。半衰期较短可能是在
体外检测不到LPAT4酶活性[17]的原因之所在。
对所得的2个CDS分析发现 , BnLPAT4-2同A基
因组BraLPAT4-2亲缘关系较近, BnLPAT4-1同C基因
组BolLPAT4-2亲缘关系较近, 说明在油菜中存在2个
亲本的基因组。从染色体定位来说, BraLPAT4-1和
BolLPAT4-1 分 别 位 于 A07 和 C07 染 色 体 , 而
BraLPAT4-2和BolLPAT4-2分别定位在A02和C02染
色体。说明同一物种的2个LPAT4之间仍具有一定的
辨识度。这些结果与基因组原位杂交所得结果一致,
杂交结果显示, 在油菜基因组中仍然保留着亲本的
2个基因组 , 并且基因组之间没有显著的均一化现
象和大规模转座现象发生[28]。
时空表达分析表明, BnLPAT4-1和BnLPAT4-2在
根、茎、叶、花、各时期的胚以及果荚中均表达, 说
明BnLPAT4-1和BnLPAT4-2为组成型表达基因, 结果
与文献 [ 4 ]相同 , 并且二者呈现不同的表达谱。
BnLPAT4-1在叶中表达量比较高, 而BnLPAT4-2在胚
中的表达量普遍偏高, 故而推测BnLPAT4-2可能与
油菜含油量有关。本研究B n L PAT 4 - 1在NaCl、
PEG-4000和水渍3个影响渗透压的逆境胁迫下, 其
表达被抑制, 而在生长素类似物6BA和ABA的胁迫
下, 则促进BnLPAT4-1的表达。说明BnLPAT4-1对外
界渗透压的抵抗能力比较弱, 而对生长素类似物的
影响则比较敏感, 尤其是对ABA的响应。在高盐和
干旱胁迫下, BnLPAT4-2的转录水平升高, 但都具有
后时性, 结果与文献[21]相同。但在水渍、6BA和
ABA的胁迫下, BnLPAT4-2的表达下降, 呈抑制状
态。说明在高盐和干旱的胁迫下, 油菜可能通过调
控BnLPAT4-2的表达, 来缓解不利环境对其自身的
1754 作 物 学 报 第 40卷
图 5 逆境胁迫下 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2的表达模式与极差分析
Fig. 5 Express pattern and pole difference analysis of BnLPAT4-1 and BnLPAT4-2 under abiotic stresses
Range analysis: 1: NaCl; 2: PEG-4000; 3: H2O; 4: 6BA; 5: ABA.
伤害。ABA 严格抑制 BnLPAT4-2 的表达 , 与
BnLPAT4-1的情况相反。从而进一步说明, 本试验已
成功的地区分了甘蓝型油菜 LPAT4的 2个拷贝。
4 结论
从甘蓝型油菜湘油 15中分离得到 LPAT4基因的
2个拷贝, 分别命名为 BnLPAT4-1和 BnLPAT4-2。分
别对其序列特征、遗传进化、时空表达与逆境表达
进行了分析。它们属于组成型表达基因, 且 BnLPAT4-
1 和 BnLPAT4-2 呈现不同的表达模式 , 其中
BnLPAT4-2可能与含油量有关。
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