全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(11): 16631670 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由湖南省科技创新基金项目 (CX2013A012)和湖南省科技重大专项 (2014FJ1006)资助。
 通讯作者(Corresponding author): 官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com
第一作者联系方式: 刘芳, E-mail: g5n2a5f@163.com  同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2015-04-04; Accepted(接受日期): 2015-07-20; Published online(网络出版日期): 2015-08-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150811.1728.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01663
甘蓝型油菜 BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件
分析
刘 芳 刘睿洋 彭 烨 官春云
湖南农业大学农学院 / 国家油料改良中心湖南分中心, 湖南长沙 410128
摘 要: 脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制植物体中油酸含量的关键基因, 在甘蓝型油菜中有 4个 FAD2基因的拷贝,
分别定位在 A1、C1、A5、C5染色体上。本文克隆了 1个 FAD2拷贝基因, 依据油菜基因组数据库信息, 将其定位到
C1染色体上, 命名为 BnFAD2-C1, 其开放阅读框为 1155 bp。采用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技术获得
了 175 bp的 5 UTR序列和 212 bp的 3 UTR序列。采用荧光定量 PCR技术研究发现, BnFAD2-C1在根、花和角果皮
中仅保持本底水平的表达, 在种子发育中期呈现高效表达, 具有种子特异性诱导表达的特征。根据甘蓝和油菜基因组
数据库信息, 同源克隆到 BnFAD2-C1基因的启动子(promoter)和内含子(intron)序列, 并通过 PLACE和 PlantCARE网
站分析, 初步预测到调控该基因转录的潜在顺式作用元件。通过茉莉酸诱导处理, BnFAD2-C1 基因表达量发生变化,
推断茉莉酸在 BnFAD2-C1基因的表达过程中可能发挥一定的调控作用。
关键词: 甘蓝型油菜; BnFAD2-C1基因; RACE; 生物信息学分析; 茉莉酸
Cloning and Expression of BnFAD2-C1 Gene Involved in Brassica napus and
Analysis of Transcription Regulation Elements
LIU Fang, LIU Rui-Yang, PENG Ye, and GUAN Chun-Yun
College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan, Changsha 410128, China
Abstract: Fatty acid desaturase gene (FAD2) is a key factor in regulating oleic acid content. There are four copies of FAD2 lo-
cated on chromosomes A1, C1, A5, and C5 in Brassica napus. One copy containing 1155 bp open reading frame was cloned with
previous research method and named as BnFAD2-C1, which was location on chromosome C1 based on the genome database in-
formation of oleracea and oilseed. The untranslated regions (UTR) of 5′ and 3′ end with 175 bp and 212 bp length respectively
were cloned by RACE (rapid-amplification of cDNA ends) technique. The expression pattern of BnFAD2-C1 gene was identified
using quantity PCR technique, showing a seed-specific inducible expression in mid developmental seeds and a background-level
expression in root, flower and siliqua wall. The promoter and intron region were also cloned and analyzed using PLACE and
PlantCARE websites to predict some potential cis-elements in regulating BnFAD2-C1 gene transcription. At the same time, jas-
monic acid (JA) was inferred to make certain contributions to regulate BnFAD2-C1 gene expression showing a changeable ex-
pression quantity when treated with jasmonic acid.
Keywords: Brassica napus; BnFAD2-C1; RACE; Bioinformatics analysis; Jasmonic acid
一般植物种子中多不饱和脂肪酸 (polyunsatu-
rated fatty acid, PUFA), 例如亚油酸(18:29,12), α-亚
麻酸(18:39,12,15)含量普遍较高。亚油酸是亚麻酸的
合成前体, 由脂肪酸去饱和酶 2 (FAD2; EC1.3.1.25)催
化油酸脱氢形成[1]。油酸可以降低血脂与血压, 防止
动脉硬化的出现 [2]; 同时 , 富含油酸的菜籽油因含
有较少的多不饱和脂肪酸(主要为亚油酸和亚麻酸),
而更利于存储, 货架期更长[3]。
FAD2 基因能够将油酸磷脂胆碱去饱和成亚油
酸磷脂胆碱, 是控制种子中油酸含量的关键基因[4]。
1664 作 物 学 报 第 41卷


FAD2基因首先发现于拟南芥(Arabidopsis thaliana) [1],
并相继在大豆[5]、棉花[6]、花生[7]、芝麻[8]和白菜[9]
中被克隆。该基因一般存在多个的拷贝, 拷贝基因
间的功能有着较大差异 [10]。甘蓝型油菜 (Brassica
napus, AACC)源于白菜(Brassica rapa, AA)和甘蓝
(Brassica oleracea, CC)的天然杂交, 经两倍化之后
形成[11], 因此甘蓝型油菜中存在多个 FAD2 基因的
拷贝。借助于油菜与白菜、甘蓝的同源性, Yang等[12]
从甘蓝型油菜中克隆了4个FAD2基因, 分别定位在油
菜 A、C基因组上。Lee等[13]也克隆了 4个 FAD2基因
拷贝, 并预测了 4个拷贝在基因组上的分布结构。
前人研究表明[14], FAD2基因的表达量对油菜种
子中油酸含量有着重要影响。本研究针对 BnFAD2-
C1 基因, 克隆了其全长 cDNA 序列, 分析 BnFAD2-
C1 基因在不同组织中的表达规律; 克隆目的基因启
动子及内含子序列, 并预测到可能调控该基因表达
的潜在元件; 对该基因进行茉莉酸诱导分析, 初步
阐明 BnFAD2-C1 基因的功能, 以及在转录水平调控
该基因表达的元件, 并证明该基因的表达确实受到
茉莉酸的诱导调控, 为 BnFAD2-C1 基因转录调控规
律的深入研究提供依据, 进而为高油酸油菜分子育
种提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝型油菜湘油15来源于国家油料改良中心湖
南分中心; 本试验中所用到的引物均由南京金斯瑞
合成。
1.2 BnFAD2-C1 基因克隆及全长 cDNA 序列扩
增
取幼嫩的油菜叶片, 参照 DNA 提取试剂盒(购
于天根公司)说明书提取油菜基因组 DNA。使用肖钢
等[15]设计的 FAD2 基因编码区保守序列的扩增引物
P1/P2, 以基因组 DNA 为模板采用 PrimeSTAR HS
DNA聚合酶(TaKaRa, Japan)进行高保真扩增。扩增
体系包含 10×buffer 5 µL, dNTP (2.5 µmol L–1) 4 µL,
正、反向引物各 1 µL, DNA 1 µL, PrimeSTAR HS
DNA聚合酶 1 µL, 用 ddH2O补足 50 µL。反应条件
为 95℃ 5 min; 95℃ 50 s, 58℃ 50 s, 72℃ 2.5 min,
28个循环; 72℃ 10 min。用 1.5% 琼脂糖凝胶检测
PCR结果。将 PCR产物纯化回收后, 进行加 A反应,
然后将其连接到 pMD18-T载体(TaKaRa, Japan), 转
化到大肠杆菌中, 由铂尚公司完成测序工作。
参考 Kiefer等[16]的方法采用 CTAB法提取油菜
总 RNA, 按照消化试剂盒(TaRaKa, Japan)说明书操
作, 去除 RNA 中的基因组 DNA。将消化后的 RNA
按照 SMATERTM RACE cDNA 扩增试剂盒说明扩
增 BnFAD2-C1 基因全长 cDNA, 并由铂尚生物技术
(上海)有限公司测序。
1.3 BnFAD2-C1基因的表达量分析
根据已获得的全长 cDNA 序列 , 在该基因
3′UTR 序列区域设计特异性引物进行定量 PCR 检
测。引物序列为, C1-FAD2-F (正向): 5′-TTTCTCTTG
GTCTGGTTTAGTCTTT-3′, C1-FAD2-R (反向): 5′-A
TAACACAACAAAATGAGACAATAA-3′; 采用上述
方法提取油菜不同组织及不同发育时期种子的RNA,
包括根、花、角果皮(开花后 10、15、20、25、30、
35和 40 d), 种子(开花后 10、15、20、25、30、35
和 40 d)。将 RNA 按照上述方法消化后 , 按照
PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit)说明书
(TaKaRa, Japan)进行 cDNA 第 1 链的合成, 选择
2Actin 作为内参基因, 进行定量 PCR 检测。反应体
系为 20 µL, 2× SYBR Premix ExTaq 10 μL, 正、反向
引物各 0.5 μL, 第 1链 cDNA 0.5 μL, ddH2O 8.5 μL。
在 Bio-Rad CFX 96 定量 PCR仪上扩增, 程序为 95
℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环。
1.4 BnFAD2-C1 基因启动子及内含子的克隆及
生物信息学分析
根据油菜基因组和甘蓝基因组的同源性分析 ,
与甘蓝相比, 油菜 BnFAD2-C1基因的 5UTR序列内
部缺失很长一段序列, 该序列是甘蓝的内含子区域,
那么以油菜基因组 DNA 和 cDNA 为模板进行 PCR
扩增, 根据油菜与甘蓝的同源性, 在甘蓝 BnFAD2-
C1 基因 5UTR 上游约 2000 bp 处设计特异性引物
C1-QF (正向): 5′-GGTGGTGACTAATTGGTTCCTT
GTG-3′与位于 BnFAD2-C1 基因编码区内部的反向
引物 C1-R: 5′-GATTGCTTTCTTGAGGTCTCCGAG-
3′共同扩增。然后将 PCR产物克隆到大肠杆菌中, 测
序。利用 PLACE 和 PlantCARE 网站对 BnFAD2-C1
启动子及内含子序列进行预测分析。
1.5 茉莉酸诱导处理及 qPCR检测
取开花后 25 d的油菜角果, 嵌入含有不同浓度
茉莉酸的 MS培养基中(pH 6.0)处理 48 h, 茉莉酸浓
度依次为 0、25、50、75、100、125和 150 µmol L–1。
然后提取种子的 RNA, 并进行反转录和定量 PCR检
测, 具体方法分别参照 1.2和 1.3。
第 11期 刘 芳等: 甘蓝型油菜 BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件分析 1665


2 结果与分析
2.1 BnFAD2-C1基因全长 cDNA序列的克隆
使用 P1、P2引物, 从油菜基因组中高保真扩增
得到一个 FAD2拷贝基因, 长度约 1100 bp (图 1)。
将其转化到大肠杆菌后测序, 获得 1155 bp 序列信
息(图 2), 该序列与油菜基因组数据库同源比对, 结
果发现该序列定位在 C1染色体上, 同源性为 100%,
因此将其命名为 BnFAD2-C1; 将其与甘蓝基因组数
据库同源比对, 同源性达到 100%。采用 RACE技术
扩增了 175 bp的 5 UTR序列和 212 bp的 3UTR序
列, 并确定了 BnFAD2-C1基因的转录起始位点。

图 1 BnFAD2-C1基因编码区序列高保真扩增结果
Fig. 1 Fidelity amplification of BnFAD2-C1 coding sequence

图 2 BnFAD2-C1基因编码区序列
Fig. 2 Coding sequence of BnFAD2-C1 gene

2.2 BnFAD2-C1基因表达分析
采用荧光定量 PCR 技术, 针对不同组织及不同
发育时期的种子进行定量分析(图 3), BnFAD2-C1基
因主要在种子中表达, 在其他组织中几乎不表达。
并且在油菜种子发育的前期, BnFAD2-C1 基因只有
本底表达的水平, 进入中期即油脂合成期时, 该基
因出现迅速高表达现象, 并且延续到种子成熟, 其
表达量一直持高不下。说明 BnFAD2-C1属于种子特
异性表达基因, 并且在种子发育的中期有诱导现象,
可以将其定义为诱导型种子特异表达基因。
2.3 启动子和内含子的克隆及结构分析
基因表达情况的变化主要取决于基因的转录调
控过程, 而转录调控过程中发挥关键作用的因素则
是启动子区域。为了研究启动子在转录过程中如何
发挥调控作用, 首先克隆了该基因的启动子序列。
根据甘蓝和油菜基因组数据库信息, 设计特异引物
C1-QF/C1-R, 分别以基因组 DNA 和 cDNA 为模板,
使用高保真酶 HS PrimerSTAR (TaKaRa, Japan)扩增
BnFAD2-C1基因 5端侧翼序列(图 4), 以 cDNA为模
板的扩增结果相对于以 DNA 为模板的扩增结果约
少 1000 bp, 即在基因组 DNA 中存在, 而在 cDNA
中并不存在; 同时, 测序结果显示, 在 5UTR 内部
穿插了 935 bp 核酸序列, 这段序列长度在以 cDNA
为模板扩增的测序结果中并未发现, 因此可证明这
段序列应为内含子序列。同时, 测序结果显示, 在
5UTR上游区域存在 1924 bp的核酸序列, 应为启动
1666 作 物 学 报 第 41卷



图 3 BnFAD2-C1基因在不同组织中的表达模式
Fig. 3 Expression pattern of BnFAD2-C1 gene in different tissues
a: 油菜种子不同发育时期 BnFAD2-C1基因表达模式; b: 油菜不同组织 BnFAD2-C1基因表达模式; c: 油菜角果皮不同发育时期
BnFAD2-C1基因表达模式。
a: Expression pattern of BnFAD2-C1 in developmental stages of rape seeds; b: Expression pattern of BnFAD2-C1 in different tissues of
rapeseed; c: Expression pattern of BnFAD2-C1 in developmental stages of rape siliqua walls.


图 4 BnFAD2-C1 5端侧翼序列高保真扩增结果
Fig. 4 Fidelity amplification of the 5 flanking sequence of
BnFAD2-C1 gene
1: 以 DNA为模板经引物 C1-QF/C1-R扩增所得电泳结果;
2: 以 cDNA为模板经引物 C1-QF/C1-R扩增所得电泳结果。
1: amplification using primer C1-QF/C1-R and taking DNA as
template; 2: amplification using primer C1-QF/C1-R and taking
cDNA as template.

子序列, 该基因全长序列的结构模式如图 5 所示,
内含子嵌入 5′UTR内部, 位于翻译起始位点 ATG上
游 8 bp 处, 转录起始位点位于内含子上游 167 bp
处。BnFAD2-C1 基因启动子区域与甘蓝的同源性很
高, 仅有一个碱基的差异, 5′UTR区域也只存在一个
碱基的差异, 但是油菜 BnFAD2-C1 基因的内含子区
域比甘蓝缺失了 37个碱基序列。
BnFAD2-C1 基因中内含子位于 5′UTR 内部, 这
一结构特征同样存在于拟南芥、棉花、大豆和芝麻
中, 且此类内含子序列均以 GT 开始, 以 AG 结束,
为 GT-AG结构模式, 序列长度从 420~3150 bp不等
(图 6)。
2.4 BnFAD2-C1 基因启动子及内含子序列的生
物信息学分析
基因的表达主要受转录水平的调控, 其中启动
子发挥关键作用。从 BnFAD2-C1基因的表达量分析
可知, 该基因在种子发育中期具有诱导种子表达的
现象。那么, 为了探明 BnFAD2-C1 基因表达调控的
机制, 现采用生物信息学方法分析该基因的启动子
序列。如图 7 所示, 在启动子序列中存在一些胚乳
特异性表达元件(GCN4-motif, skn-1), 赤霉素应答
元件(P-box, GARE), 热激蛋白结合位点(HSE), 脱
落酸应答元件 (ABRE, MBS), 茉莉酸应答元件
(CGTCA-motif), 水杨酸应答元件 (TCA-element),
抗性应答元件(TC-rich), 分生组织表达特异性元件
(CAT-box), 厌氧诱导表达元件(ARE), 光诱导元件
(AE-box、GA-motif、ACE、3-AF1和 CATT-motif)。
核心启动子元件 TATA-box 存在于–25~ –32 bp, 具
有增强启动子功能效应的元件 CAAT-box 存在于
–53~ –57 bp。

图 5 BnFAD2-C1基因结构模式图
Fig. 5 Model of BnFAD2-C1 gene structure
第 11期 刘 芳等: 甘蓝型油菜 BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件分析 1667



图 6 不同植物体中 FAD2基因结构比较
Fig. 6 Comparison of FAD2 gene structures in different species

利用 PlantCARE 和 PLACE 网站预测分析内含
子序列, 发现在内含子+1027~ +1030 bp处和+944~
+948 bp处分别存在 TATA-box和 CAAT-box元件。
另外也存在一些类似启动子中的元件, 如胚乳特异
表达元件(GCN4-motif, skn-1), 光诱导元件(CATT-
motif、Box I、3-AF1和 ATCT-motif), 厌氧诱导元件
(ARE)。
2.5 茉莉酸诱导 BnFAD2-C1 基因表达量变化情
况分析
不同浓度的茉莉酸处理开花后 25 d的油菜角果,
然后经定量 PCR 检测分析显示, 当茉莉酸浓度在
0~50 µmol L–1时, 随着茉莉酸浓度的增加, 种子中
BnFAD2-C1 基因的表达量逐渐增加, 但是表达量增
加的量不到 0.3倍; 当茉莉酸浓度大于 50 µmol L–1
时, 随着其浓度的增加, BnFAD2-C1 基因表达量下
降, 当茉莉酸浓度达到 150 µmol L–1时, BnFAD2-C1
基因的表达量下降一倍多(图 8), 说明该基因在表达
过程中确实受到茉莉酸的影响。
3 讨论
本研究成功克隆了甘蓝型油菜 BnFAD2-C1基因
的全长 cDNA序列, 确定了该基因的转录起始位点。
研究了该基因在甘蓝型油菜不同组织, 种子发育的
不同时期的表达量变化情况, 结果显示, 该基因主
要在种子发育的中后期高效表达, 在种子发育的前
期表达量极低, 在其他组织基本不表达, 因此我们
认为该基因属于诱导型种子特异性表达基因。该基
因在种子中的表达规律和油菜脂肪酸的积累模式规
律较为接近, 在油菜种子发育的中后期脂肪酸尤其
是亚麻酸快速积累且持高不下[17], 说明 BnFAD2-C1
基因在催化油酸去饱和形成亚油酸的过程中发挥了
重要功能。
针对 BnFAD2-C1 基因的启动子序列分析发现,
预测到的胚乳特异诱导表达元件可能是导致该基因
在种子中特异表达的因素, Vicente等[18]发现, P-box
和胚乳特异性转录因子相互作用可以促进 zein 基因
在胚乳发育过程中大量表达。另外, 突变 ABRE 或
G-box序列可以引起种子中 napA启动子功能下降[19]。
不仅启动子具有调控基因表达的作用, 内含子也具
有增强基因表达的功能 , 称为内含子增强效应
(intron-mediated enhancement, IME)。这一类内含子
大多位于 5′UTR 内部, 并且具有类似核心启动子的
元件 TATA-box和 CAAT-box; 发挥 IME功能的元件
不仅存在于内含子, 在 5′UTR和CDS区也大量存在,
并且内含子区的增强效应元件主要分布于内含子 5′
端, 其中 CGATT (距离转录起始位点小于 1 kb)可能
是产生 IME功能的主要元件[20]。本研究中克隆的内
含子位于 5′UTR 内部, 并且在距离转录起始位点
862 bp (+862)处存在一个 CGATT元件(图 7)。因此,
我们初步推测该内含子可能具有 IME功能。我们下
1668 作 物 学 报 第 41卷




图 7 BnFAD2-C1基因启动子及内含子序列生物信息学分析结果
Fig. 7 Bioinformatic analysis of the nucleotide sequences of BnFAD2-C1 gene promoter and intron
第 11期 刘 芳等: 甘蓝型油菜 BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件分析 1669



图 8 不同浓度茉莉酸处理后种子 BnFAD2-C1基因相对表达量
Fig. 8 Relative expression level of BnFAD2-C1 gene in seed
after treated with different concentrations of JA

一步工作可以针对 BnFAD2-C1基因启动子及内含子
区域进行缺失分析, 确定控制种子中 BnFAD2-C1 基
因特异性高效表达的主校元件。
茉莉酸是在植物发育过程中尤其是抵御伤害的
情况下发挥重要功能的信号分子[21], 在许多双子叶
植物中, 茉莉酸具有诱导抗性基因表达产生抗性蛋
白的功能[22]。研究表明, 植物经外源茉莉酸处理后,
为了降低膜的流动性, 增加其稳定性, 脂肪酸组分
会发生改变, 其中饱和脂肪酸C16:0和C18:0及单不
饱和脂肪酸 C18:1组分增加, 多不饱和脂肪酸 C18:2
和 C18:3 n-3组分减少[23-24]; 同时, 茉莉酸会促进油
脂及相应的次级代谢物的产生, 提高含油量[23,25-26]。
茉莉酸对于脂肪酸和含油量的改变主要通过对脂肪
酸合成基因 KASI、SAD、ω-6 FAD和 ω-3 FAD的表
达量的调控来实现, 其中 KASI、SAD和 ω-6 FAD基
因会因茉莉酸的刺激表达上调, ω-3 FAD 基因则下
调[23]。开花后 25 d的油菜角果, 经不同浓度的茉莉
酸处理后, 其种子 BnFAD2-C1 基因表达量出现明显
的变化(图 8), 说明 BnFAD2-C1 基因的表达受到茉
莉酸的调控。Rouster 等[27]发现存在于大麦 Lox1 基
因启动子区域的 CGTCA和 TGACG元件, 当二者中
的一个或者两个同时突变会导致基因的表达不受茉
莉酸的诱导, 证实这两个调控元件是茉莉酸信号的
应答元件。生物信息学分析结果显示, 在 BnFAD2-
C1 基因的启动子区域存在一个 CGTCA-motif 元件
(图 7), 初步推测该基因该元件可能是茉莉酸的应答
元件, 响应茉莉酸的刺激诱导 BnFAD2- C1基因表达
量变化 , 但还有待进一步验证 , 因此 , 我们后续工
作可以通过缺失分析方法来进一步确定茉莉酸调控
元件所在区域, 进而针对该区域深入探索, 发现茉
莉酸发挥功能的根源及其原理。
4 结论
克隆了甘蓝型油菜 BnFAD2-C1 基因的全长
cDNA序列, BnFAD2-C1是种子特异性诱导基因; 从
油菜基因组中克隆了该基因的内含子序列和启动子
序列, 且初步预测到该基因调控序列的顺式作用元
件, 该基因的启动子区域可能存在受茉莉酸诱导调
控的应答元件。
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